一种海绵动物水溶性肽类的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肽类制备方法，尤其是涉及一种海绵动物水溶性肽类的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 人们已经从海洋生物中分离出20, 000余种天然产物，包括肽类、蛋白质类、多糖 类、生物碱类、萜类、大环聚酯类等，其中数量庞大的一类化合物是肽类，相较于大蛋白，肽 类的分子量小、无免疫原性、结构简单、副作用小、生物活性高。又由于海洋生物生存的特定 环境，海洋肽类的结构与陆生动植物肽有很大不同，海洋肽类的开发日益成为海洋药物研 宄的热点。
[0003] 海绵属于多孔动物门，是动物中最低等的多细胞无脊椎动物，也是最具开发潜 力的药源海洋生物。在目前发现的海洋天然产物中，有7, 000多种来自海绵，并以每年 200余种新化合物的发现速度递增。其中的新型肽类不仅占了较高比例，某些还极具药 用开发潜力。比如海绵来源的一种三肽化合物Hemiasterlin是微管蛋白的解聚物，能 诱导有丝分裂阻滞和细胞凋亡，具有良好的开发为抗癌药物的潜力（Bai，R.，Durso,N. A.,Sackett,D.L.andHamel,E. (1999)Interactionsofthesponge-derived antimitotictripeptidehemiasterlinwithtubulin:comparisonwithdolastatin IOandcryptophycinI.Biochemistry，38, 14302-1431)。从蒂壳海绵属Theonella sp.中分离得到双环肽类TheonellamideA-F，它们有强烈的抗真菌活性（Wada，S.，Mat sunaga,S. ,Fusetani,N.andWatabe,S. (1999)TheonellamideF，aBicyclicPeptide MarineToxin,InducesFormationofVacuolesin3YlRatEmbryonicFibroblast. MarBiotechnol(NY)，1，337-341 ;3.Wada，S.，Matsunaga，S.，Fusetani，N.andWatabe，S. (2000)InteractionofCytotoxicBicyclicPeptides，TheonellamidesAand F,withGlutamateDehydrogenaseandl7beta-HydroxysteroidDehydrogenaseIV.Mar Biotechnol(NY), 2, 285-292)。这些例子表明海绵肽类的开发前景良好。但是已发现的海 绵肽类主要是通过有机萃取获得的，肽类通常与其他类别的化合物混杂在一起，目前还没 有一个系统富集和分离海绵肽类的方法，肽的种类、分离效率和规模受到极大限制。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供可增加肽的种类、提高处理规模和分离效率，以便利海绵活 性肽类药物开发的一种海绵动物水溶性肽类的制备方法。
[0005] 本发明包括以下步骤：
[0006] 1)将海绵动物破碎，用提取缓冲液浸泡，超声，离心后获得可溶解蛋白/肽类水溶 液，过滤后进行吸附/解吸附，获得脱盐后的肽类第一级粗提物；
[0007] 2)将肽类第一级粗提物经旋转蒸发浓缩后进行第二级纯化得10?30个第二级组 分，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存；
[0008] 3)将第二级组分中主成分小于95%的二级组分经旋转蒸发浓缩后进行第三级纯 化得海绵动物水溶性肽类，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存。
[0009] 在步骤1)中，所述破碎可采用冷冻破碎或冻干后破碎；所述冷冻破碎可在液氮温 度下用粉碎机破碎海绵动物组织块；所述冻干后破碎可将海绵冻干后用粉碎机破碎；
[0010] 所述提取缓冲液的配方可为：水，10%乙醇，20禮1^8-11(：1?117.5,51111￡0丁八， 0.5 %TritonX-100或NP-40,临用时加lmM0-巯基乙醇、20yM苯硫脲、ImMPMSF和 10yg/mL抑肽酶，每隔Ih加一次PMSF;
[0011] 所述浸泡可于4°c层析柜中以2?4倍海绵动物质量的提取缓冲液浸泡，浸泡时 间为1?2h;所述离心可于8000Xg离心30min;所述过滤可采用切向流过滤，所述切向流 过滤可采用PALLCentramate超滤系统，先用MWC0300K膜包滤去大分子蛋白，滤过液再用 MWC05K或MWCOlK膜包滤过小分子蛋白/肽类，需要注意的是膜包标称的滤过或截留孔径大 小要经过实验验证，标称IOK的膜包在实际中会滤过部分10?20K的蛋白；
[0012] 所述吸附/解吸附流程可采用大孔吸附树脂吸附，将处理好的大孔吸附树脂与切 向流滤过液混合，4°C下，通过摇床、磁力搅拌、机械搅拌等方式连续搅拌10?14h，之后用 去离子水漂洗大孔吸附树脂至少5次，再将大孔吸附树脂装入层析柱用层析系统在280nm 或215nm波长检测肽类洗脱过程，洗脱中逐步提高乙醇浓度到75%，最后用50mMNaOH洗 脱，最大量的组分在60%?75%乙醇区间洗脱，收集10%?50乙醇洗脱组分和50mMNaOH 洗脱组分；所述大孔吸附树脂与切向流滤过液的体积比可为1 : (3?20);所述大孔吸附 树脂可采用型号为DA201-C、NKA-9、AB-8或DlOl等大孔吸附树脂中的一种，优选型号为 DA201-C大孔吸附树脂。
[0013] 在步骤2)中，所述第二级纯化的具体方法是采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，乙 腈-水梯度反相HPLC方法采用C18反相柱WelchUltimataXB-C18,内径30mm，高度250mm， 填料粒径l〇ym，孔径300A，或同类型产品；所用的流动相含〇. 1%三氟乙酸；上样样品用 起始乙腈浓度含0. 1 %三氟乙酸的水溶液溶解；第二级纯化的HPLC每次上样3. 5mL，梯度程 序为：0 ?40min，3%- 70% 乙腈；40 ?43min，70%- 100% 乙腈；43 ?53min，100% 乙腈， 流速27mL/min，检测波长280nm或215nm。
[0014] 在步骤3)中，所述第三级纯化的具体方法可采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，乙 腈-水梯度反相HPLC方法采用C18反相柱WelchUltimataXB-C18,内径30mm，高度250mm， 填料粒径l〇ym，孔径300A,或同类型产品；所用的流动相含〇.I%三氟乙酸；上样样品用 起始乙腈浓度含0. 1 %三氟乙酸的水溶液溶解；第三级纯化的HPLC每次上样0. 5?I.OmL， 以二级组分收集点的乙腈浓度减3%的乙腈-水溶液等度洗脱40min;40 - 45min，乙腈浓 度升到 100% ;45 - 55min，100% 乙腈，流速 13. 5mL/min，检测波长 280nm或 215nm。
[0015] 本发明的优点在于：
[0016] 1.高效而廉价。水溶性肽类提取的难点在于脱盐，许多寡肽的分子量小于1000， 很难与水溶液中的盐类分开。脱盐可采取凝胶过滤、固相萃取或纳滤方法。凝胶过滤填料 贵，上样量少，每次耗时长。以价格1万元的凝胶过滤柱处理Ikg湿重海绵溶出的水溶性肽 合计用时15天以上，并随处理量的增加而等比例增加，这么长的处理时间在效率上、在肽 类的活性保留上是非常不利的。另一类脱盐方法是C18或C8固相萃取，但这类固相萃取填 料与水溶液不亲和，水系溶液不易通过，升以上的操作很难开展。实验室通用的离心纳滤也 可小规模地脱盐，但L级以上的脱盐在成本上不可承受。本发明以大孔吸附树脂方法脱盐， 在规模、成本和时间上有很大优势。大孔吸附树脂对肽类的吸附量高，操作便捷，而价格仅 为凝胶过滤填料、C18固相萃取填料的1/150?1/100。花费时间上，处理3?30L水提液 耗时均不超过2天；在耗材、能源消耗上，比凝胶过滤方法节约10倍以上；在得率上，本发 明的方法略低于凝胶过滤，约为后者的70%?85%，但由于高效，可以加大初始原材料的 量来弥补。
[0017] 2.处理通量高，易于放大。海绵肽类的药物开发涉及活性筛选、结构测定和各种体 外体内实验，至少需提纯到IOOmg以上的纯肽才能开展这些实验。这就要求分离提纯的通 量要高，容易放大。本发明很容易就能放大规模，一次能获得50g级别的粗提物，足以支撑 几十种肽类的各类实验。
[0018] 3.本发明富集的肽的种类极为丰富。对苔海绵第一级肽类粗提物的液相色谱串联 质谱分析，在分子量1060?2850区间鉴定出了 262种能在转录组找到序列的肽（见实施 例2)。
[0019] 4.本发明系统地富集了肽类，可以与转录组学、蛋白质组学等组学方法联用，快速 对各分离组分中的肽类定性定量，极大便利活性组分的成分分析。
【附图说明】
[0020] 图1为切向流过滤对海绵水溶性蛋白的分组。M.分子量标记；1.总水溶性蛋白； 2. 30K膜包滤过、IOK膜包截留；3.IOK膜包滤过、IK膜包截留。
[0021] 图2为实施例1大孔吸附树脂的洗脱曲线。
[0022] 图3为实施例1的第二级分离洗脱曲线。
[0023] 图4为实施例2进行液相色谱串联质谱分析得到的总离子流色谱图。<