油菜抗裂角性状主效qtl相关的分子标记及应用
【专利摘要】本发明公开了油菜抗裂角性状主效QTL相关的分子标记及应用，表型解释变异大小达到38%。并开发对应区间SSR分子标记，本发明的油菜裂角相关的SSR标记为BnS1和BnS2，引物序列分别为BnS1F：AGCTAAGAGCTGAAGCACGG，BnS1R：AGATGCTGAAATTCGTCTGTGA；BnS2F：TCAACTTGACATGTTCACTAATAGTTT，BnS2R：CAATAGACACGGAAATGGGC。利用本发明分子标记，筛选高世代回交导入抗裂角株系效率达到93.4%，可用于油菜遗传改良；该方法和标记在油菜抗裂角性育种领域具有广阔的应用前景。
【专利说明】
油菜抗裂角性状主效QTL相关的分子标记及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及油菜基因组上一个抗裂角主效QTL(qSRI. 2)，具体涉及一种与甘蓝型 油菜抗裂角主效QTL位点紧密连锁的分子标记及其在作物遗传育种上应用。
【背景技术】
[0002] 油菜是我国优势油料作物，种植面积和总产量居世界前列，总产量接近世界的三 分之一，但我国油菜机械化作业程度仍然很低，成为制约我国油菜生产发展的主要因素之 一。目前油菜生产仍以手工为主，以劳动力投入为主的油菜生产费工、费时，劳动力占油菜 生产成本的近50%，油菜种植成本大幅增加，与同季作物小麦等相比效益显著下降。因此油 菜种植不是农民的首选，致使部分油菜主产区油菜生产面积下滑。近几年来，油菜收获机械 化已引起政府及相关部门的高度重视和农机、农业科技工作者的广泛关注。我国油菜机械 化正处在一个加快发展的历史新起点，既面临着难得的发展机遇，也拥有发展油菜生产机 械化良好的环境和条件。2014年中央一号文件再次强调，加快推进大田作物生产全程机械 化，实现作物品种、栽培技术和机械装备的集成配套。我国目前现有油菜品种的角果结构决 定了其在成熟期易于裂角落粒，由此造成的损失一般占籽粒总产量的5-10%左右；当成熟 期气候比较恶劣时，产量损失可高达50%。同时炸裂的油菜籽在条件适宜时会萌发形成自 生苗，不仅影响下茬作物生长，而且易造成生物学混杂。因此，培育适合机械化收获的油菜 品种成为目前育种的主要研究方向。
[0003] 分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection,MAS)基于与目标基因紧密连锁 的分子标记分析，可以快速高效地检测后代家系中的目标基因，从而极大地提高育种效率 和缩短育种进程。MAS还可以分析导入目标片段的大小，减少不利性状的连锁累赘。通过MAS 与回交育种相结合，检测后代单株的遗传背景回复率，在改良抗性等目标性状的同时不影 响其它优异性状，实现对目标性状的定向改良。此外，MAS还能够实现在同一品种中多个抗 性基因的聚合。在水稻的驯化改良过程中，栽培稻就是通过聚合控制落粒性QTL位点qSHl、 qSH3和Sh4(Zhang et al.2009)，把落粒表型转化成非落粒(Donini et al.2007)。在利用 杂交结合回交创建了优良杂交种亲本系R2背景含有抗裂角位点基础上，建立抗裂角位点的 分子标记辅助选择体系，构建多个抗性基因在R2背景下的近等基因系(NILs)，再利用油菜 全基因组高密度SNP芯片进行背景筛选，最终希望获得一系列含有目标抗性基因的NILs。通 过综合评价这些基因在R2-NIL及其杂交组合中的遗传效应，可为解析其抗裂角分子机制、 培育高度稳定的抗裂角杂交油菜品种提供理论基础。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供了一种油菜抗裂角性状主效QTL相关的分子标记引物，弓丨 物序列为BnSl:AGCTA AGAGC TGAAG CACGG和AGATG CTGAA ATTCG TCTGT GA;BnS2:TCAAC TTGAC ATGTT CACTA ATAGT TT和CAATA GACAC GGAAA TGG GC。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供了一种油菜抗裂角性状主效QTL相关的分子标记引 物在油菜高产育种中的应用。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0007] 一种油菜抗裂角性状主效QTL相关的分子标记引物的获得：
[0008] (1)利用油菜品系R1和R2杂交，杂种F1代通过小孢子培养生成DH分离群体。
[0009] (2)利用多态性引物对DH分离群体进行分子标记分析，获得基因型数据。
[0010] (3)把DH分离群体的基因型数据输入Joinmap4.0软件，进行遗传连锁图谱的构建；
[0011] (4)DH群体的基因型数据(仅限于定位到遗传图谱上的标记）以及两年的抗裂角性 状数据输入WinQTLcart2.5软件进行QTL定位，其中，有一个QTL在DH群体两年中能重复检测 到，而且效应值和贡献率稳定。
[0012]利用上述技术措施，最终获得了油菜抗裂角指数(SRI)性状主效QTL位点qSRI. 2， 为角果开裂主效位点。利用WinQTLCart2.5软件分析获得其对油菜抗裂角指数的贡献率为 27.58-38.11 %，加性效应为0.12~0.23。针对该位点设计了两对SSR引物：
[0013] BnSl：AGCTA AGAGC TGAAG CACGG,AGATG CTGAA ATTCG TCTGT GA；
[0014] BnS2:TCAAC TTGAC ATGTT CACTA ATAGT TT，CAATA GACAC GGAAA T GGGC;
[0015] 在R1中用SSR标记BnSl可扩增出164bp条带，用BnS2可扩增出218bp条带；在R2中 SSR标记BnSl可扩增出168bp大小的产物，而BnS2可扩增出231bp大小的产物。
[0016] 一种油菜抗裂角性状主效QTL相关的分子标记引物在油菜高产育种中的应用，包 括利用BnSl和BnS2对待筛选植株DNA进行扩增，保留与R1条带一致的植株，即可获得抗裂角 性状的植株。
[0017]与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0018]本发明首次定位到油菜抗裂角品系R1和不抗裂角品系R2中控制抗裂角的QTL位 点，获得了油菜抗裂角指数(SRI)性状主效QTL位点qSRI.2,为控制角果开裂的主效位点。利 用WinQTLCart2.5软件分析获得其对油菜抗裂角指数的贡献率为27.58-38.11 %，加性效应 为0.12~0.23。在常规育种方法中，角果抗裂角性鉴定要等到成熟期收获后室内鉴定，费时 费力且选择效率低下(抗裂角性会一定程度受到成熟度、倒伏和病害等的影响）。通过分子 标记检测角果抗裂角QTL位点的存在情况，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大 大提高选择效率。本发明中抗裂角QTL含有裂角相关功能基因，位置明确，检测方法方便快 速，不受环境影响。通过检测抗裂角性状的分子标记，即可预测育种材料的抗裂角性，进而 准确快速筛选抗裂角油菜株系。
[0019] 本发明所提供的用于鉴定油菜抗裂角主效QTL位点的引物对，目的在于提供一种 与甘蓝型油菜主效应QTL的功能分子标记的应用。可用于分子标记辅助选择、以及该QTL位 点下功能基因图位克隆，为油菜抗裂角育种提供新手段，可加速油菜抗裂角性状的改良进 程，提高油菜育种的准确性和选择效率。
[0020] 本发明通过实验研究，发现了一个影响油菜抗裂角性的QTL位点，进一步开发了鉴 定该位点的SSR引物对。应用本发明的QTL位点及SSR引物对可以在油菜早期事先鉴定油菜 抗裂角性，而不用等到油菜成熟后通过田间表型鉴定抗裂角性。本发明位点及引物对加快 了油菜育种进程，在油菜的选择育种领域有广阔的应用前景。
[0021] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
【附图说明】
[0022] 图1为油菜基因组上的抗裂角QTL位点L0D曲线示意图。该QTL((qSRI.2)效应大，为 正向效应QTL，抗性来源于抗裂角亲本R1。
[0023] 上坐标图中横坐标代表连锁群，纵坐标代表L0D值。
[0024] 下坐标图中横坐标代表连锁群，纵坐标代表加性效应值。
[0025]图2为qSRI. 2区段近等基因系的构建示意图。
[0026] 图3抗裂角QTL qSRI.2区间两个标记鉴定K079近等基因系BC4F2的效应值分布。 [0027] +为R1基因型，-为R2基因型，H为杂合基因型;每种类型大于5个单株。
[0028]图4标记BnSl毛细管电泳检测两亲本Rl，R2和BC4F2杂合个体(H)的示意图。
[0029]图5标记BnS2毛细管电泳检测两亲本R1，R2和BC4F2杂合个体(H)的示意图。
【具体实施方式】
[0030]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中DH群体在文献"王会，桑世飞， 梅德圣等.甘蓝型油菜DH群体抗裂角性的遗传分析。中国油料作物学报，2014，36(4):437 - 442"公开过，公众可以从中国农科院油料作物研究所获得。
[0031] 实施例1:
[0032]抗裂角主效QTL(qSRI.2)的发现 [0033](一）田间实验与抗裂角指数表型测定：
[0034]田间试验分别于2011年至2015年秋季在中国农科院油料所阳逻实验站（武汉）， 2011年至2015年夏季在青海大学(青海西宁)进行，每年9月中旬在武汉进行秋播，次年5月 初收获，5月中旬在青海进行夏播，9月份收获。播种地块平坦肥沃，均匀施足底肥，行长 210cm，株距15cm，行距33cm。成熟期考察株系或单株的抗裂角指数(SRI)，鉴定方法参考文 献(彭鹏飞，李云昌，梅德圣，刘道敏，付丽，王会，桑世飞，陈玉峰，胡琼.油菜抗裂角性鉴定 方法的改进及试验.农业工程学报，2013,29(21): 19-25)。具体为将油菜角果在80°C烘干 30min，室温封闭保存隔夜后，放入圆柱容器，圆柱容器中放置8个钢珠;采用型号为HQ45Z摇 床，以280rpm转速对圆柱容器进行震荡处理，每两分钟观察一次，共观察5次，每份材料重复 3次，利用公式:裂角指数=2XiX(6-i)/角果数X总次数计算裂角指数，Xi为第i次破损的 角果数，1 < i < 5,抗裂角指数=1-裂角指数。
[0035](二)基因型鉴定
[0036] R1XR2 DH群体及亲本，分别在5叶期时取叶片提取DNA，并分别标记每个单株，对 于DH群体株系，则将具有同一基因型的3个单株进行混合叶片取样，以小区号进行标记，在 田间迅速冷冻保存。每个样品DNA稀释至IjlOng/yl左右，分别与油菜60KSNP芯片杂交，另外设 计目标区间引物进行PCR扩增，用聚丙烯酰氨凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定。 目标基因组区域序列信息来源于Darmor-bzh全基因组测序数据，用SSRHunter扫描目标基 因组序列中的SSR位点，再利用Primer5.0(www. Premier5BioSof t. com)设计引物，开发多态 性标记，用于目标基因组区域有利重组单株的筛选。
[0037](三)QTL定位分析
[0038] 利用 Windows QTL Cartographer (http ://statgen.ncsu.edu/qtlcart/ WQTLCart ? htm)对DH群体群体进行复合区间QTL作图定位分析（1000次permutat ion，P = 0.05水平）。对qSRI.2进行初步的定位分析（图1)。对qSRI. 2进行分子标记开发，用以分子标 记辅助育种。
[0039]实验结论:利用DH群体定位到油菜抗裂角性主效QTL，该QTL位点qSRI. 2(抗裂角性 基因来源于R1)，影响抗裂角的QTL的L0D值为10.32-13.43，能够解释27.58-38.11 %的表型 变异(表1)。
[0040] 表1:R1XR2 DH群体两年抗裂角性的QTL定位
[0042](四）qSRI. 2近等基因系构建及评价：
[0043]采用高世代回交策略构建目标QTL的近等基因系，选择优良甘蓝型油菜杂交育种 品系R1和R2发展而来的双单倍体群体中抗裂角性极端的家系DH79(平均抗裂角系数0.65)， 其在qSRI. 2所在目标区段携带来自R1的片段。背景筛选85个SSR标记的扫描结果显示两家 系间仅存在30%的遗传学差异。以R2为轮回亲本对供体亲本DH56进行多代回交构建了抗裂 角主效qSRI. 2的近等基因系。
[0044]在早期世代BC1F1，BC2F1和BC3F1仅根据表型进行选择，保留抗裂角性高的个体。 在BC4F1代，利用DH79和R2之间有差异的120个SSR标记进行扫描，检测到其中K079抗裂角指 数与轮回亲本R2以及抗性亲本R1存在较大差异，同时只有931?1.2区段(31111264-11186区段为 杂合基因型，而其他区域均已回复到轮回亲本R2的基因型，因此选择该单株自交发展的 BC4F2群体于2014年在武汉对qSRI. 2进行定位。在重组单株的BC4F2家系中，根据附近标记 基因型选择两个QTL渗入片段最小的家系中的一个单株自交，发展B C4F3进行进一步精细 定位并同时发展渗入片段更小的近等基因系。（图2,图3，P:表型鉴定;G:基因型鉴定）。 [0045]为方便在油菜抗裂角育种及品种改良中更好的应用此等位基因，在qSRI. 2的附近 筛选及开发了两对直接检测QTL的SSR标记BnSl:AGCTA AGAGC TGAAG CACGG;AGA TG CTGAA ATTCG TCTGT GA和BnS2:TCAAC TTGAC ATGTT CACTA ATAGT T T;CAATA GACAC GGAAA TGGGC〇
[0046] 实施例2:
[0047] 一种油菜抗裂角性状主效QTL相关的分子标记引物在油菜高产育种中的应用：
[0048] 一、实验材料如下：
[0049]初定位使用的两个亲本材料:R1及R2，DH群体和进一步精细定位的BC4F2单株。 [0050] 二、基因型检测引物：
[0051] BnSl:AGCTA AGAGC TGAAG CACGG;AGATG CTGAA ATTCG TCTGT GA。
[0052] BnS2：TCAAC TTGAC ATGTT CACTA ATAGT TT；CAATA GACAC GGAAA TGGGC〇 [0053] 三、基因型检测方法
[0054]分别在5片叶时，提取叶片DNA，稀释到lOng/yl浓度的工作液进行PCR扩增，并对所 得PCR产物进行毛细管电泳检测。BnSl和BnS2的扩增体系及程序：
[0055] PCR扩增体系为：2XTaq Mix 5ul,正向引物（10uM/ul)lyl,反向引物（10uM/ul)ly l，g DNA lyl，ddH20 2yl，Total lOyLBnSl为红色荧光引物，BnS2为蓝色荧光引物。
[0056] PCR反应条件：94°C，3min; 94°C，30s; 58°C，30s，72°C，45s; 35个循环；72°C，lOmin; 4 °C保存备用。
[0057] 毛细管电泳上机，机器型号为ABI3730:
[0058] 取700ul的甲酰胺加3-10ul的LIZ500内参混匀，再分到96孔板里，每孔加7ul的混 合液和lul稀释过的双色PCR产物。
[0059]电泳数据读取采用软件GeneMarkerl .9,并进一步统计和分析（图4和图5)。
[0060] 利用目标区间标记BnSl鉴定BC4F#PBC4F3重组单株，用毛细管电泳能鉴定出扩增 片段分别与亲本R1(片段大小为164bp)和R2(片段大小为168bp)相同的纯合单株，以及同时 具有两个亲本扩增片段的杂合态单株(同时扩增出两条164bp和168bp片段）；利用目标区间 标记BnS2鉴定BC4F#PBC4F 3重组单株，用毛细管电泳能鉴定出扩增片段分别与亲本R1 (片段 大小为218bp)和R2(片段大小为231bp)相同的纯合单株，以及同时具有两个亲本扩增片段 的杂合态单株(同时扩增出两条218bp和231bp片段）。
[0061]选取与R1扩增条带相同的单株，对其抗裂角性进行测定，筛选出的单株其抗裂角 性接近R1的抗裂角性，远高于R2的抗裂角性，其抗裂角系数均大于0.2。因此，本发明提供的 分子标记位点适合用于油菜抗裂角性的育种筛选。
[0062] 实施例3:BnSl和BnS2引物对的普适性：
[0063] 一、实验材料如下：
[0064]选取抗裂角系数从0.02-0.49的油菜品系材料35份，如表3所示。
[0065] 二、基因型检测方法
[0066] 分别在5片叶时，提取叶片DNA，稀释到lOng/yl浓度的工作液进行PCR扩增，并对所 得PCR产物进行毛细管电泳检测。BnSl和BnS2的扩增体系及程序：
[0067] PCR扩增体系为：2XTaq Mix 5ul,正向引物（10uM/ul)lyl,反向引物（10uM/ul)ly l，g DNA lyl，ddH20 2yl，Total lOyLBnSl为红色荧光引物，BnS2为蓝色荧光引物。
[0068] PCR反应条件：94。(：，3min; 94。(：，30s; 58。(：，30s，72。(：，45s; 35个循环；72。(：，lOmin; 4°C ,till use。
[0069] 毛细管电泳上机，机器型号为ABI3730:
[0070] 取700ul的甲酰胺加3-10ul的LIZ500内参混匀，再分到96孔板里，每孔加7ul的混 合液和lul稀释过的双色PCR产物。
[0071 ]电泳数据读取采用软件GeneMarkerl .9,并进一步统计和分析。
[0072]三、基因型鉴定结果
[0073]利用BnSl和BnS2两个标记对35份抗裂角有显著差异的油菜品系进行鉴定，在23份 抗裂角系数小于〇.1〇(被认为抗裂角性差）的品系中BnSl扩增的都是与R2相同的168bp条 带，而在BnS2扩增的23份材料中有21份也扩增出与R2相同的条带231bp，仅有两份材料F459 和浙双72扩增出与R1相同的条带218bp，推测可能其中发生了基因组内部的交换，但该基因 位仍为不抗裂角等位位点。对于抗裂角系数大于0.20的12份品系材料，在B nSl鉴定时只发 现一份材料BLN3344能扩出两条同R1和R2相同的条带，推测其可能不纯;其他材料都只能扩 增出与R1相同的164bp条带。BnS2也全部扩增出与R1相同的218bp条带，符合预期，证明BnSl 和BnS2用来筛选鉴定主效位点抗裂角性具有普遍意义。
[0074] 表2:利用抗裂角主效QTL(qSRI.2)对应标记BnSl和BnS2的引物序列筛选不同的油 菜品系材料，与其抗裂角系数(SRI)分布表
[0077]注:*表示扩增出相应条带。
【主权项】
1. 一种与甘蓝型油菜抗裂角主效QTL位点紧密连锁的分子标记的引物： BnSIF:5，-AGCTAAGAGCTGAAGCACGG-3，， BnSIR:5 '-AGATGCTGAAATTCGTCTGTGA-3 '； 和BnS2F:5 '-TCAACTTGACATGTTCACTAATAGTTT-3 '， BnS2R:5 '-CAATAGACACGGAAATGGGC-3 ' 〇2. 权利要求1所述引物在甘蓝型油菜抗裂角性状标记辅助选择中的应用。3. 权利要求1所述引物在甘蓝型油菜抗裂角性状QTL位点精细定位中的应用。4. 权利要求1所述引物在甘蓝型油菜抗裂角性状QTL位点图位克隆中的应用。5. 权利要求1所述的引物在加速油菜抗裂角性状改良进程中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105821153SQ201610390218
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】胡琼, 刘佳, 汪文祥, 王会, 李云昌, 梅德圣, 周日金, 付丽
【申请人】中国农业科学院油料作物研究所