1500mL20%PIP/DMF溶液去保 护30分钟，洗涤抽滤得到去Fmoc的树脂。
[0095] 将活化后的第2个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应2-3小 时，抽滤洗涤，得含2个保护氨基酸的树脂。
[0096] (3)、接入第3~9个氨基酸或者多肽片段
[0097] 使用步骤⑵中的方法，将第3~9个氨基酸片段偶联在树脂上，其中在普联第 3~4个氨基酸片段时接入Z片段，接入Z片段后再依次接入第5~9个氨基酸；其中使用 的缩合剂为〇? 15molDIC和0? 003mol的三乙胺和0? 28mol的N-乙基对甲苯胺。
[0098](4)、接入第10个保护氨基酸
[0099] 取0. 2mol第10个保护氨基酸和0. 2molHOBt，用适量DMF溶解；另取0. 2molDIC， 搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的 保护氨基酸溶液。
[0100] 将加入活化后的第10个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂，偶联反应2~ 3小时，过滤洗涤，得含第10个保护氨基酸的树脂。
[0101](5)、接入第11~24个保护氨基酸或片段
[0102] 采用接入第2个保护氨基酸相同方法，依次接入上述对应的第11~24个保护氨 基酸或片段；所使用的缩合剂为〇? 15molDIC和0? 003mol的三乙胺和0? 28mol的N-乙基 对甲苯胺。
[0103](6)、接入第25个保护氨基酸
[0104] 取0? 2mol第25个保护氨基酸和0? 2molHOBt，用适量DMF溶解；另取0? 2molDCC 二环己基碳二亚胺，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30 分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用；本发明中DCC作为活化剂，可以将保护氨基酸 活化，使其可以与树脂进行偶联时更容易进行，反应速率快，收率也较高。通过对比试验可 以得知，在加入步骤6的活化剂后，保护氨基酸的收率更高，且与未加入实验组相比具有显 著性差异。
[0105]已接第24个保护氨基酸的0.lmol树脂，采用1500mL20%PIP/DMF溶液去保护两 次，第一次去保护时间为15分钟，第二次去保护时间为30分钟，洗涤抽滤得到去Fmoc的树 脂。
[0106] 将活化后的第25个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，加入0. 15molDIC 和0? 003mol的三乙胺和0? 28mol的N-乙基对甲苯胺偶联反应，抽滤洗涤，得含25个保护 氨基酸的树脂。
[0107] (7)、接入第25~32个保护氨基酸或片段
[0108] 采用接入第25个保护氨基酸相同方法，依次接入上述对应的第25~32个保护氨 基酸或片段，得鲑鱼降钙素肽树脂。
[0109] 为了验证本实施例缩合剂的效果，实施例2采用与实施例1基本相同的实验参数， 优化设计了缩合剂的组分。实施例1中采用的缩合剂大多与现有技术中相同，其缩合反应 时间一般为3~5小时。本实施例的缩合剂在原有基础上进行优化，例如在步骤2和步骤 4的缩合反应中，在达到相同的实验效果情况下，相比实施例1减少了 1~2小时。
[0110] 另外将三乙胺和N-乙基对甲苯胺作为氨基酸缩合剂进行反应时，这两种物质无 法对氨基酸进行缩合，说明实施例2中三乙胺和N-乙基对甲苯胺不能够单独进行缩合反 应，其是通过促进DIC的缩合效率来实现减少反应时间。
[0111] 实施例3 :采用逐一方式接入氨基酸
[0112] (1)、以RinkAmideMBHA树脂或RinkAmideAM树脂为起始原料，以Fmoc保护的 氨基酸为单体，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt为缩合剂，逐个接上氨基酸，获得保护三十二肽 树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团；得还原型粗品；
[0113] (2)、加入切肽试剂TFA/EDT/H20/TIS进行切肽，并脱侧链保护基团，然后加入乙 醚沉淀粗品，获得还原型鲑鱼降钙素粗品；
[0114] (3)、在通过碘/甲醇溶液氧化，过滤，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；
[0115] (4)、在C18柱或C8中进行分离纯化，获得目标产物。
[0116] 具体的实施参数可以参照实施例1或者CN1865283B。实施例2的接肽总收率达 93. 4% ;粗品收率为：86. 1%，总收率约为：17. 2%，产品纯度为91. 4%。
[0117] 实施例4 :通过三个多肽片段偶联
[0118] 本实施例的具体步骤为：
[0119] (1)分别固相合成侧链保护的第一至第三肽片段序列；
[0120] (2)脱去侧链保护的第三肽片段序列的氨基保护基；
[0121] (3)将脱去氨基保护基的侧链保护的第三肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序 列偶联得到侧链保护的第四肽片段序列；
[0122] (4)脱去侧链保护的第四肽片段序列的氨基保护基；
[0123] (5)将脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序 列偶联得到全保护的鲑鱼降钙素；
[0124] (6)将全保护的鲑鱼降钙素裂解脱除保护基得到鲑鱼降钙素粗品；
[0125] (7)鲑鱼降钙素粗品经纯化换盐得到醋酸鲑鱼降钙素。
[0126] 具体的实施参数可以参照实施例1或者CN104177490A，实施例4的接肽总收率为 83. 4% ;粗品收率为：76. 1%，总收率约为：14. 2%，产品纯度为90. 2%。
[0127] 有上述实施例1~实施例4的实施结果可以得知，本发明的方法相对于现有技术 具有明显的优势，在产品纯度和收率上有较大提升，对降低产品的生产成本有较大影响。
【主权项】
1. 一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括以下步骤： (1) 、将Fmoc-Pro-OH与树脂偶联，获得Fmoc-Pro-树脂； (2) 、将所述Fmoc-Pro-树脂与保护氨基酸逐一偶联获得鲑鱼降钙素线性肽树脂；其中 第3位~第5位三个保护氨基酸是以保护肽片段Z进行偶联； 第20位~第21位和第28位~29位两个保护氨基酸均是以保护肽片段X进行偶联； 第23位~第24位两个保护氨基酸是以保护肽片段Y进行偶联； X 为 Leu-Ser，Y 为 Leu-Gly，Z 为 Gly-Ser-Gly ; (3) 、将鲑鱼降钙素线性肽树脂在裂解液中裂解，得到还原性粗品； (4) 、将所述还原性粗品使用氧化剂氧化，得到氧化粗品； (5) 、将所述氧化粗品纯化，得到鲑鱼降钙素精品。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述与Fmoc-Pro-OH偶联的树脂为 Fmoc-Rink Amide MBHA 树脂或 Rink Amide AM 树脂。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)和步骤（2)的偶联反应中加 入活化剂，所述活化剂为1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)和步骤（2)中选用的缩合剂为 N，N-二异丙基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2- (7-氮杂-IH-苯 并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟 磷酸盐或0-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲四氟硼酸酯中的一种；选用的去Fmoc保护 试剂为哌啶/N，N-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中含哌啶为10%~30% (v/v)。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中，接入X对应的保护肽片段 为Fmoc-Leu-Ser (tBu) -OH ;接入Y对应的保护肽片段为Fmoc-Leu-Gly-OH ;接入Z对应的保 护肽片段为 Fmoc-Gly-Ser (tBu) -Gly - 0H。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述保护氨基酸或保护肽片段的用量为树 脂总摩尔量的2倍~6倍。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Fmoc-Pro-树脂的取代值为0. 2mmol/ g ~L OmmoVg08. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中，Fmoc-Pro-树脂与保护氨 基酸和保护肽片段偶联时，先反应得到的保护氨基酸树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个 保护氨基酸偶联反应。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3)中，裂解液含有三氟醋酸 80%~95% (v/v)、l，2-乙二硫醇1%~10% (v/v)、三异丙基硅烷1%~5% (v/v)，溶剂 为水。10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4)中，将所述还原性粗品溶于 乙腈水溶液中，使用氧化剂碘/甲醇溶液进行氧化。
【专利摘要】本发明公开了一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括将Fmoc-Pro-OH与树脂偶联，获得Fmoc-Pro-树脂；将Fmoc-Pro-树脂与保护氨基酸和保护肽片段逐一偶联获得鲑鱼降钙素线性肽树脂；将鲑鱼降钙素线性肽树脂在裂解液中裂解，得到还原性粗品；将还原性粗品使用氧化剂氧化，得到氧化粗品；将氧化粗品纯化，得到鲑鱼降钙素精品。
【IPC分类】C07K1/06, C07K14/585
【公开号】CN105111301
【申请号】CN201510594506
【发明人】龙春艳, 胡阳
【申请人】四川吉晟生物医药有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月17日