联反应，依次偶联保护氨基 酸，制得鲑鱼降钙素肽树脂，以Pro作为第一个偶联氨基酸，Cys作为最后一个偶联氨基酸 排序，偶联氨基酸片段为：
[0046]Fmoc-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-X(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Y-Lys(Bo c)-X(tBu)-Gin(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gin(Trt)-Thr(tBu)-Tyr( tBu) -Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)_Z(tBu)-Thr(tBu) -Pro-树脂，
[0047]其中X为Leu-Ser，Y为Leu-Gly，Z为Gly-Ser_Gly〇
[0048] 接入X时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Leu-Ser(tBu) -〇H;
[0049] 接入Y时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Leu-Gly-〇H ;
[0050] 接入Z时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Gly-Ser (tBu) -Gly-〇H。
[0051] 本发明的具体步骤如下：
[0052](1)、将Fmoc-Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂为原料脱Fmoc-保护 后，与Fmoc-Pro-OH偶联得到Fmoc-Pro树脂；得到的Fmoc-Pro-树脂可以是取代值为0.2~ 1.0mmol/g的树脂。
[0053](2)、在Fmoc-Pro-树脂上偶联Thr
[0054]取 0? 15mol第 2 个保护氨基酸Fmoc-Thr(tBu) -0H和 0? 15molHOBt，用适量DMF溶 解；另取0. 15molDIC，搅拌下慢慢加入含有保护氨基酸的DMF溶液中，于室温环境中搅拌 反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
[0055]取Fmoc-Pro-树脂lllg，取代值为 0? 45mmol/g，用 1500mL20%PIP/DMF溶液去保 护30分钟，洗涤抽滤得到去Fmoc的树脂。
[0056] 将活化后的第2个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应2-5小 时，抽滤洗涤，得含2个保护氨基酸的树脂。
[0057] (3)、接入第3~9个氨基酸或者多肽片段
[0058] 使用步骤⑵中的方法，将第3~9个氨基酸片段偶联在树脂上，其中在普联第 3~4个氨基酸片段时接入Z片段，接入Z片段后再依次接入第5~9个氨基酸。
[0059] (4)、接入第10个保护氨基酸
[0060] 取0. 2mol第10个保护氨基酸和0. 2molHOBt，用适量DMF溶解；另取0. 2molDIC， 搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的 保护氨基酸溶液。
[0061] 将加入活化后的第10个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂，偶联反应3~ 5小时，过滤洗涤，得含第10个保护氨基酸的树脂。
[0062] (5)、接入第11~24个保护氨基酸或片段
[0063] 采用接入第2个保护氨基酸相同方法，依次接入上述对应的第11~24个保护氨 基酸或片段。
[0064](6)、接入第25个保护氨基酸
[0065] 取0. 2mol第25个保护氨基酸和0. 2molHOBt，用适量DMF溶解；另取0. 2molDCC 二环己基碳二亚胺，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30 分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用；本发明中DCC作为活化剂，可以将保护氨基酸 活化，使其可以与树脂进行偶联时更容易进行，反应速率快，收率也较高。通过对比试验可 以得知，在加入步骤6的活化剂后，保护氨基酸的收率更高，且与未加入实验组相比具有显 著性差异。
[0066] 已接第24个保护氨基酸的0.lmol树脂，采用1500mL20%PIP/DMF溶液去保护两 次，第一次去保护时间为15分钟，第二次去保护时间为30分钟，洗涤抽滤得到去Fmoc的树 脂。
[0067] 将活化后的第25个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应3~5 小时，抽滤洗涤，得含25个保护氨基酸的树脂。
[0068](7)、接入第25~32个保护氨基酸或片段
[0069] 采用接入第25个保护氨基酸相同方法，依次接入上述对应的第25~32个保护氨 基酸或片段，得鲑鱼降钙素肽树脂。
[0070] 制备鲑鱼降钙素肽树脂还原型粗品：
[0071] 取鲑鱼降钙素肽树脂，加入体积比为TFA:EDT:TIS:水=90 : 4 : 2 :4的裂解 液，裂解液用量为10mL/g树脂，搅拌均匀。室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗 过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再 用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为鲑鱼降钙素还原型粗品。
[0072] 鲑鱼降钙素肽树脂还原型粗品的氧化：
[0073] 取鲑鱼降钙素还原型粗品溶于乙腈溶液，溶液中鲑鱼降钙素的浓度为0. 5~5mg/ ml，乙腈水溶液的浓度为40%~80%，本实施例选用鲑鱼降|丐素浓度为2mg/ml，溶液中乙 腈的质量分数为60%。然后用碘/甲醇溶液氧化2小时，得鲑鱼降钙素粗品。
[0074] 鲑鱼降钙素粗品的纯化工艺：
[0075] 鲑鱼降钙素粗品溶液用0.45y m混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
[0076] 采用高效液相色谱法进行纯化，纯化的色谱柱为直径10cm、填料为粒径10um的 十八烷基键合硅胶、孔径的C18柱，流动相分别为磷酸-醋酸铵缓冲液和乙腈溶液，流速为 120ml/min，上样量为5~10g，色谱仪的检测波长为220nm。
[0077] 取鲑鱼降钙素纯化中间体浓缩液，用0.45 ym滤膜滤过备用；
[0078] 采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1%醋酸/水溶液-乙腈，流速为 20mL/min;采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观 测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得 到鲑鱼降钙素醋酸水溶液，冷冻干燥，得鲑鱼降钙素精品35. 6g，总收率为27. 7%。
[0079]分子量：3431. 58(100%M+H);纯度：99.2%。
[0080] 在实施上述实施例时，缩合剂为N，N_二异丙基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三 唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2- (7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六 氟磷酸酯、苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸盐或0-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四 甲基脲四氟硼酸酯中的一种；选用的去Fmoc保护试剂为哌啶/N，N-二甲基甲酰胺混合溶 液，混合溶液中含哌啶为10%~30% (v/v)。
[0081] 上述实施例表明，本发明提供的方法直接避免了 [+lGly]_鲑鱼降钙素和 [_lGly]_鲑鱼降钙素杂质的产生，使纯化难度大大降低，提高了产品收率，所得产品纯度大 于99.0%，具有广泛的实用价值和应用前景。
[0082] 实施例2
[0083] 制备鲑鱼降钙素肽树脂：
[0084] 以Fmoc-Pro-树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次偶联保护氨基 酸，制得鲑鱼降钙素肽树脂，以Pro作为第一个偶联氨基酸，Cys作为最后一个偶联氨基酸 排序，偶联氨基酸片段为：
[0085]Fmoc-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-X(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Y-Lys(Bo c)-X(tBu)-Gin(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gin(Trt)-Thr(tBu)-Tyr( tBu) -Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)_Z(tBu)-Thr(tBu) -Pro-树脂，
[0086]其中X为Leu-Ser，Y为Leu-Gly，Z为Gly-Ser-Gly。
[0087] 接入X时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Leu-Ser(tBu)-OH;
[0088] 接入Y时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Leu-Gly-〇H;
[0089] 接入Z时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Gly-Ser(tBu) -Gly-〇H。
[0090] 本发明的具体步骤如下：
[0091](1)、将Fmoc-RinkAmideMBHA树脂或RinkAmideAM树脂为原料脱Fmoc-保护 后，与Fmoc-Pro-OH偶联得到Fmoc-Pro树脂；得到的Fmoc-Pro-树脂可以是取代值为0. 2~ 1. 0mmol/g的树脂。
[0092](2)、在Fmoc-Pro-树脂上偶联Thr
[0093]取 0? 15mol第 2 个保护氨基酸Fmoc-Thr(tBu) -0H和 0? 15molHOBt，用适量DMF溶 解；另取〇? 15molDIC和0? 003mol的三乙胺和0? 28mol的N-乙基对甲苯胺，搅拌下慢慢加 入含有保护氨基酸的DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基 酸溶液，备用。
[0094]取Fmoc-Pro-树脂lllg，取代值为 0? 45mmol/g，用