一种促进人角质细胞表达炎症因子IL-1α的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种促进人角质细胞表达炎症因子IL-1a 的方法。
【背景技术】
[0002] 炎症因子是一类小分子多肽和糖蛋白，具有调节和介导免疫反应、炎症反应的作 用，包括白介素类、干扰素类、肿瘤坏死因子类、生长因子类以及趋化因子类。细胞受到刺激 后产生大量的炎症因子，直接或间接影响淋巴细胞或周围细胞，在免疫调节、炎症反应、细 胞凋亡中起重要作用。
[0003]表皮细胞或成纤维细胞释放炎症因子IL-la，又叫IL-1A或IL1F1，它与其他8个 白介素家族基因均位于人类第2号染色体上，它可以结合细胞表面受体，发挥免疫炎症调 节，促进细胞分化等生物学作用。
[0004] 角质细胞分泌炎症因子白介素1 (IL-1a) -方面促进成纤维细胞分泌IL-6,引起 成纤维细胞大量基因表达发生变化，另一方面促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上，从而刺 激机体局部发生炎症反应。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是促进人角质细胞表达炎症因子IL-1a。
[0006] 为解决上述问题，本发明首先提供了一种促进离体的人角质细胞表达炎症因子 IL-la的方法，可包括如下步骤a2):用SDS处理离体的人角质细胞。
[0007] 上述方法中，所述步骤a2)中，可用浓度为0. 3-0. 4yg/ml的SDS处理所述离体的 人角质细胞。
[0008] 上述方法中，所述步骤a2)中，具体可用浓度为0. 357yg/ml的SDS处理所述离体 的人角质细胞。
[0009] 上述方法中，所述步骤a2)中，用SDS处理离体的人角质细胞的条件参数可为： 35-39°C，5h-7h。
[0010] 上述方法中，所述用SDS处理离体的人角质细胞的条件参数具体可为37°C和6h。
[0011] 上述方法中，还包括如下步骤al):将离体的人角质细胞的细胞悬液接种至细胞 培养板，培养；在进行所述步骤a2)前先进行所述步骤al)。
[0012] 上述方法中，所述步骤a2)可为：完成所述步骤al)后，取所述细胞培养板，加入 SDS溶液并培养。
[0013] 上述方法中，所述步骤al)中，所述细胞悬液中人角质细胞的浓度可为 18000-20000 个 /cm2。
[0014] 上述方法中，所述细胞悬液中人角质细胞的浓度具体可为19000个/cm2。
[0015] 上述方法中，所述步骤al)中，所述培养的条件可为：35-39°C，18h-26h。
[0016] 上述方法中，所述步骤al)中，所述培养的条件具体可为：37°C和24h。
[0017] 上述方法中，所述步骤al)中，所述细胞悬液的接种量可为100iiL/孔。
[0018] 上述任一所述炎症因子IL-1a的基因序列可如序列表中序列1所示。
[0019] 上述任一所述SDS溶液可为用DMEM培养基溶解SDS获得。
[0020] 上述任一所述细胞悬液的制备方法具体如下：用0. 25%胰蛋白酶消化离体的人 角质细胞，然后用含10%胎牛血清（体积百分比）的DMEM培养基重悬并稀释。
[0021] 上述任一所述DMEM培养基的制备方法具体如下：将高糖DMEM固体培养基（Gibco 公司产品）13. 5g和NaHC033. 7g依次溶于水，pH调至7. 2-7. 4,然后定容至1L。
[0022] 上述任一所述人角质细胞可为人表皮角质细胞。
[0023] 实验证明，本发明提供的方法可以显著促进人表皮角质细胞中炎症因子IL-1a 的表达，从而可以用于筛选治疗炎症的药物。
【附图说明】
[0024] 图1为MTT法测定不同浓度的SDS溶液处理人表皮角质细胞的存活率。
[0025] 图2为炎症因子IL-1a在SDS溶液不同处理时间下的表达量。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0027] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0028] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029] 下述实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。
[0030] 人表皮角质细胞为北京富隆康泰生物技术有限公司产品；SDS为sigma公司产品， 产品目录号为15750;胎牛血清为办〇1〇1^公司产品，产品目录号为31130084.03 ;0.25%胰 蛋白酶为Hyc1one公司产品，产品目录号为SH30042. 01;DMS0为sigma公司产品，产品目录 号为D2650。
[0031]DMEM培养基：将高糖DMEM固体培养基（Gibco公司产品）13. 5g和NaHC033. 7g依 次溶于水，pH为7. 2-7. 4,定容至1L。使用0. 22ym微孔滤膜过滤除菌，于4°C保存。
[0032]MTT溶解液：将MTT(sigma公司产品）5g溶于上述DMEM培养基，定容至1L。使用 0? 22ym微孔滤膜过滤除菌，于4。。保存。
[0033]PBS缓冲液：购买自hyclone公司，货号SH30256. 01B。
[0034] 实施例1、确定人表皮角质细胞的最佳接种细胞密度和SDS处理浓度
[0035] 设置试验组，进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：
[0036] 1、用0. 25%胰蛋白酶消化人表皮角质细胞，然后用含10%胎牛血清（体积百分 比）的DMEM培养基重悬并稀释，获得细胞密度为15600个/cm2的细胞悬浮液1、细胞密度为 19000个/cm2 (实际应用中18000-20000个/cm2均可）的细胞悬浮液2、细胞密度为22000 个/cm2的细胞悬浮液3和细胞密度为25000个/cm2的细胞悬浮液4。
[0037] 2、用DMEM培养基溶解SDS，获得SDS溶液。
[0038]3、取96孔培养板，每孔接种100yL步骤1获得的细胞悬浮液（细胞悬浮液1、细 胞悬浮液2、细胞悬浮液3或细胞悬浮液4)，在37°C(实际应用中37±2°C均可）、5%C02 环境中培养24h(实际应用中18h-26h均可）。
[0039] 4、完成步骤3后，取所述96孔板，加入步骤2制备的SDS溶液，得到处理体系，处 理体系中的SDS的浓度为 0? 05yg/mL、0. 15yg/mL、0. 46yg/mL、1. 37yg/mL、4. 11yg/mL、 12. 35yg/mL、37. 03yg/mL、111. 1yg/mL、333. 3yg/mL或 1000yg/mL(每个SDS浓度设置 5个复孔）。5%C02、37°C培养44h(实际应用中40h-48h均可），然后加入20yLMTT溶解 液，继续5%C02、37°C培养4h。
[0040] 5、完成步骤4后，取所述96孔板，吸弃孔内的液体，然后每孔加入150yLDMS0,采 用酶标仪检测570nm处的吸光值。
[0041] 设置空白对照组：用等体积含10%胎牛血清（体积百分比）的DMEM培养液代替 细胞悬浮液，其它操作同试验组。每个SDS浓度设置5个复孔。
[0042] 设置细胞对照组：用等体积DMEM培养基代替SDS溶液，其它操作同试验组。每种 细胞悬浮液设置5个复孔。
[0043] 以SDS在处理体系中的浓度为横坐标，人表皮角质细胞的存活率为纵坐标，比较 不同浓度的SDS处理后人表皮角质细胞的存活率。