专利名称：：淫羊藿素在制备防治内毒素血症药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明属中药制药领域，涉及淫羊藿素的医药新用途，具体涉及淫羊藿素在制备防治内毒素血症药物中的用途。
背景技术：
：细菌内毒素(endotoxin)是革兰氏阴性细菌生长时释放或死亡时裂解出来的细胞壁脂多糖成分(lipopolysaccharide,LPS)。现有技术公开了LPS是产生内毒素血症的重要原因，可刺激机体产生TNF-ci、IL-6等前炎症细胞因子，后者触发瀑布式炎症级联反应，进一步激活炎症细胞(单核-巨噬细胞、中性粒细胞等)，增加粘附分子表达(CDllb/CD18、ICAM-1)、释放炎性介质(N0、PEG2)，形成复杂的炎症网络，造成组织损伤和微循环障碍。研究报道，革兰氏阴性细菌严重感染所致脓毒血症，可弓l起全身炎症反应综合征(Systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)禾口多器官功能障碍综合征(Multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS)，其死亡率高达20%-40%,尤其在ICU病房中更是高达50%左右。作为防治内毒素血症的手段，现有技术从抑制内毒素发生源的革兰氏阴性菌增殖出发，施予抗菌素。但是抗菌素的大量给药会出现耐药菌株，并且被杀死的革兰氏阴性菌突然释放大量内毒素可加重内毒素血症。因此，临床实践需要开发抗菌素之外的治疗药。由此目的出发，针对内毒素或内毒素构成成分脂质A的拮抗剂、针对炎性因子的单克隆抗体等相继被研发出来。然而，据有关多中心临床研究发现，迄今为止，还没有一种该些类型的制剂能够显著降低死亡率。故，从天然药物中寻找防治内毒素血症的活性成分，就显得十分必要。淫羊藿为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、粗毛淫羊藿、巫山淫羊藿或朝鲜淫羊藿的干燥地上部分。淫羊藿含多种黄酮类成分，如淫羊藿苷、淫羊藿次苷、淫羊藿素等。中医认为其味辛、甘性温，归肾、肝经，能补肾壮阳，祛风除湿。淫羊藿素属黄酮醇类化合物，少量存在于淫羊藿药材中，其化学结构式如下淫羊藿素R=CH3,Rl-R2-H目前有关淫羊蕾素的药理活性研究报道较少。中国专利CN1869204A公开了"淫羊藿素在诱导干细胞体外定向分化方面的用途"。中国专利CN1194701C公开了"淫羊藿素或去甲基淫羊藿素在制备雌激素受体调节剂中的应用"。迄今尚未见有关于淫羊藿素防治内毒素血症方面的用途的报道。
发明内容本发明的目的在于提供淫羊藿素的医药新用途，具体涉及淫羊藿素在制备防治内毒素血症药物中的用途。本发明所述的淫羊藿素属黄酮醇类化合物，具有如下化学结构式OH0淫羊藿素R=CH3，R1=R2=H本发明的目的通过以下技术方案实现以脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7建立体外内毒素炎症模型，以LPS刺激C57BL/6J小鼠建立内毒素血症动物模型，采用淫羊藿素干预，并以地塞米松为对照，通过观察LPS攻击后小鼠死亡率，并检测巨噬细胞活力、炎性因子TNF-a、IL-6、炎性介质NO、黏附分子CDllb及肺脏病理，检测淫羊藿素的疗效。结果表明，淫羊藿素能显著降低小鼠内毒素攻击后的死亡率、降低炎性因子、炎症介质和粘附分子的水平、减少组织炎症细胞浸润。淫羊藿素可作为防治内毒素血症的有效药物。可进一步按常规方法制备含淫羊藿素的口服肠溶胶囊或静脉注射剂等剂型。图l是小鼠肺脏炎症细胞浸润的观察结果，其中，A:为小鼠正常肺组织病理切片；B:为LPS腹腔注射90分钟后肺组织切片，可见肺间质高度充血，大部肺泡间隔明显增宽，肺泡腔部分融合成肺大泡，部分萎縮；肺间质大量中性粒细胞浸润，腔内有红细胞，可见微血栓形成；C、D分别为提前2h给予地塞米松(5mg/kg)和淫羊藿素(25mg/kg)灌胃，LPS腹腔注射90分钟后两组肺组织病理改变基本一致，病理显示肺中度淤血，肺泡隔增宽，少量微血栓形成，间质可见较多白细胞浸润，与B相比有所改善。具体实施例方式实施例1淫羊藿素对小鼠内毒素攻击后死亡率的影响实验实验药物淫羊藿素(上海融禾医药，批号20081578,HPLC纯度98。/0、地塞米松(sigma，批号D4902)、LPS(sigma,L2880)。实验动物C57BL/6J小鼠，雌雄各半，18-22g(上海斯莱克)，动物给药前在饲养观察室内观察3d,动物随机分组,平均每笼6只群养，室温20°C25°C,相对湿度为50%70%,光暗周期为12h。实验方法将实验动物随机分为6组空白组、模型组、淫羊藿素低剂量组、淫羊藿素中剂量组、淫羊藿素高剂量组、地塞米松对照组，每组12只。其中，淫羊藿素低剂量组、中剂量组、高剂量组和地塞米松组分别给予25mg/kg.d、50mg/kg.d、100mg/kg.d淫羊藿素、5mg/kg.d地塞米松灌胃，连续3天，空白组和模型组则以同等体积生理盐水灌胃。第3天灌胃后2小时模型组、淫羊藿素低剂量组、中剂量组、高剂量组和地塞米松组分别给予28mg/kgLPS腹腔注射，空白组给予同等体积的生理盐水腹腔注射。观察各组小鼠48小时内的死亡率。5采用SPSS15.0统计软件分析数据，卡方检验OO进行比较。P〈0.05为差异有统计学意义。结果表明，与模型组相比，淫羊藿素低(25mg/kg)、中(50mg/kg)、高剂量组(75mg/kg)、地塞米松组(5mg/kg)，能显著降低小鼠LPS攻击后的死亡率，然而其量效关系不明显。表l是小鼠内毒素攻击后的死亡率。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注与模型组相比较，P<0.05实施例2淫羊藿素对小鼠内毒素相关炎症影响的体外实验实验药物同实施例l。细胞株小鼠巨噬细胞系RAW264.7(购自中国科学院上海细胞库)。实验方法(1)RAW264.7细胞的培养与传代小鼠巨噬细胞RAW246.7加入含10y。的胎牛血清、100U/ml青霉素、链霉素的高糖DMEM,置于5%C02、37"C培养箱中生长，细胞生长至70~80%融合后进行传代，2_3天传代一次。(2)RAW264.7细胞活力检测调整细胞悬液浓度为lX10Vml,加入96孔培养板内，每孔100u1，置37°〇5%0)2孵箱培养6h，吸除旧培养液，分别加入含淫羊藿素(lug/ml、10ug/ml、飾g/ml)、含地塞米松(5ug/ml)的培养基，空白组加含O.1%DMSO的培养基，每组设6复孔，继续培养22h。加入10ulWST-8溶液，培养2h，在490nm处检测各孔的吸光值。实验重复3遍以上。(3)NO的检测调整细胞悬液浓度为lX107ml,加入96孔培养板内，每孔100yl，置371)5%0)2孵箱培养6h，吸除旧培养液，分别加入含淫羊藿素(lug/ml、10ug/ml、幽g/ml)、含地塞米松(5ug/ml)的培养基，空白组及模型组加含O.1%DMSO的培养基，每孔100ul，每组设3复孔，预培养lh;其后加入终浓度为10ug/ml的LPS(空白组加相同体积的培养基)，继续培养24h;每孔取50ul上清液，采用GriessReagent法，在540nm处检测各孔的吸光值，并绘制标准曲线，计算NO浓度。实验重复3遍以上。(4)TNF-a、IL-6的检测:调整细胞悬液浓度为lXl()S/ml，加入48孔培养板内，每孔400u1，置37。C5呢C02孵箱培养24h。吸除旧培养液，分别加入含淫羊藿素(lug/ml、10ug/ml、100ug/ml)、含地塞米松(5ug/ml)的培养基，空白组加O.1W的DMS0，每组设3复孔，预培养lh;其后加入终浓度100ng/mlLPS(空白组加相同体积的培养基)，继续培养18h;取培养上清，采用酶免试剂盒检测TNF-a、IL-6含量。采用SPSS15.0统计软件分析，定量资料以均数土标准差表示，采用方差分析"MWJ进行比较。P〈0.05为差异有统计学意义。RAW264.7细胞活力的检测结果表明与空白组相比较，分别给予地塞米松5ug/ml、淫羊藿素lug/ml、淫羊藿素10ug/ml均未显示出细胞毒性作用(P〉0.05)，给予淫羊藿素100ug/ml不仅未显示细胞毒性作用，还表现出促细胞增殖作用，P〈0.01。表2是RAW264.7细胞活力。表2组别空白地塞米松淫羊藿素淫羊藿素淫羊藿素5ug/mllug/ml10ug/mllOOug/mlOD0.20±0.040.19±0.03A0.19±0.04A0,23±0.02A0.25±0.O广注与空白组比较，AP〉0.05，，〈0.01。每组设6个复孔。RAW264.7细胞上清液N0的检测结果表明10ug/mlLPS刺激RAW264.7细胞24h后N0释放显著增多，P〈0.01;LPS剌激前lh给予淫羊藿素lug/ml未显示出抑制作用，P〉0.05;LPS刺激前lh分别给予地塞米松5ug/ml、淫羊藿素10ug/ml、淫羊藿素100ug/ml显示出较强的抑制作用，P〈0.01。表3是RAW264.7细胞上清液N0。表3组正常模型地塞米松淫羊藿素淫羊藿素淫羊藿素别LPS10ug/ml5ug/mllug/ml10ug/ral100ug/mlNO5.78±0.34林26.13±0.117.44±0.34**26.25±0.6厶19.5±0.81**17.96±0.65'*注与模型组比较，AP>0.05,WP<0.01。每组设3个复孔。7RAW264.7细胞上清液TNF-a、IL-6的检测结果表明，100ng/mlLPS刺激RAW264.7细胞18h后，上清液中TNF-a、IL-6含量显著升高(P〈0.0D，而LPS刺激前lh给予地塞米松5ug/ml、淫羊藿素10ug/ml、淫羊藿素100ug/ml对TNF-a和IL-6均显示出明显的抑制作用(P〈0.01)，而LPS刺激前lh给予淫羊藿素lug/ml仅对TNF-a显示出抑制作用(P〈0.01)。表4是RAW264.7细胞上清液TNF-a、IL-6检测结果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与模型组比较，厶P〉0.05，，〈0.01。每组设3个复孔。实施例3淫羊藿素对小鼠内毒素相关炎症影响的体内实验实验药物同实施例l。实验动物同实施例l。动物造模及药物干预实验动物随机分为4组空白组、模型组、治疗组和西药对照组，每组8只；治疗组(淫羊藿素25mg/kg)、西药对照组(地塞米松5mg/kg)均以DMSO助溶后灌胃，空白组和模型组以同等体积的DMSO灌胃；灌胃2h后腹腔注射LPSlmg/kg，空白组注射生理盐水，90分钟后戊巴比妥钠麻醉，心脏采血，并分离肺脏。检测TNF-a、IL-6:全血室温静置30分钟以上，4000转/10分钟离心，取上清，采用酶联免疫法，根据试剂盒说明，检测小鼠血清TNF-a、IL-6。检测中性细胞CDllb表达取100ul肝素钠抗凝全血，加入0.25ulPE标记的CDllb抗体，混匀后，室温避光20min，加PBS2ml，2000转/5分钟离心，弃上清，再加300ulPBS，重悬后，采用流式细胞仪检测首先按白细胞键门，白细胞中根据前向和侧向光散射的不同区分淋巴、中性粒细胞(PMN)和单核细胞(MN)，每个样本分析10000个细胞，结果以平均荧光强度(MeanFluorescencelnten-sity,MFI)表示。小鼠肺脏病理观察福尔马林液固定小鼠肺组织，无水乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察小鼠肺脏病理。采用SPSS15.0统计软件分析，定量资料以均数士标准差表示，采用方差分析进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。小鼠血清TNF-a、IL-6的检测结果表明给予lmg/kgLPS腹腔注射90分钟后，小鼠血清TNF-a、IL-6释放均明显增多，P〈0.01;提前2h给予地塞米松(5mg/kg)和淫羊藿素(20mg/kg)灌胃，LPS腹腔注射90分钟后小鼠血清TNF-a均明显减少，p〈0.01，IL-6未见明显改变，P〉0.05。表5是小鼠血清TNF-a、IL-6检测结果。表5组别正常组模型组地塞米松组淫羊藿素组TNF-a31.32士11.91林556,47±44.96142,12±29.27"224.09±27.87材IL-626.89+24.52**224L33+86.672267.62+24.30A2209.26+52.67A注与模型组比较，AP〉0.05，"P<0.01。每组为8只。小鼠中性粒细胞CDllb表达的检测结果表明，给予lmg/kgLPS腹腔注射90分钟后，小鼠中性粒细胞表面CDllb表达明显增多(P<0.01)。提前2h给予地塞米松(5mg/kg)和淫羊藿素(25mg/kg)灌胃，LPS腹腔注射90分钟后小鼠中性粒细胞表面CDllb表达明显减少(P〈0.01)。表6是小鼠中性粒细胞CDllb表达的检测结果。表6组别正常组模型组地塞米松组淫羊藿素组CDllb(MFI)259,67±31**731.67±56.2345±30.51W278.67±59.1**注与模型组比较，"P<0.01。每组为3只小鼠肺脏炎症细胞浸润的观察结果(图l)显示LPS腹腔注射90分钟后肺组织切片，可见肺间质高度充血，大部肺泡间隔明显增宽，肺泡腔部分融合成肺大泡，部分萎縮；肺间质大量中性粒细胞浸润，腔内有红细胞，可见微血栓形成(图1B);分别提前2h给予地塞米松(5mg/kg)和淫羊藿素(25mg/kg)灌胃，LPS腹腔注射90分钟后两组肺组织病理改变基本一致，病理显示肺中度淤血，肺泡隔增宽，少量微血栓形成，间质可见较多白细胞浸润，与B相比有所改善(图lC、图1D)。权利要求1、淫羊藿素在制备防治内毒素血症药物中的用途。2、按权利要求l所述的用途，其中所述的淫羊藿素属黄酮醇类化合物，具有如下化学结构式-3、按权利要求l所述的用途，其中所述的防治内毒素血症是降低内毒素攻击后的死亡率、降低炎性因子、炎症介质和粘附分子的水平以及减少组织炎症细胞浸润。4、按权利要求l所述的用途，其中所述的药物是含淫羊藿素的口服肠溶胶囊或静脉注射剂。淫羊藿素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本发明属中药制药领域，涉及淫羊藿素的医药新用途，具体涉及淫羊藿素在制备防治内毒素血症药物中的用途。本发明以脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7建立体外内毒素炎症模型，以LPS刺激C57BL/6J小鼠建立内毒素血症动物模型，采用淫羊藿素干预，并以地塞米松为对照，实验结果表明，所述的淫羊藿素能降低内毒素攻击小鼠后的死亡率、降低炎性因子、炎症介质和粘附分子的水平以及减少组织炎症细胞浸润，证实淫羊藿素能有效防治内毒素血症，可进一步制备防治内毒素血症的有效药物，包括口服肠溶胶囊或静脉注射剂等剂型。文档编号A61P39/00GK101428015SQ20081020234公开日2009年5月13日申请日期2008年11月6日优先权日2008年11月6日发明者吴金峰,董竞成申请人:复旦大学附属华山医院