一种o型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽及其用途的制作方法

专利名称：一种o型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子免疫学领域，具体涉及一种能模拟o型口蹄疫病
毒抗原表位的短肽，以及该短肽在制备免疫原、猪口蹄疫表位肽疫苗上的应用。
背景技术：
口蹄疫(Foot and Mouth Disease , FMD)是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病传播途径多、传播速度快，曾多次在世界发生大流行。虽然该病的死亡率不高(幼畜除外)，但造成动物生产性能下降，扑杀动物花费大量的人力、物力和财力，影响国际贸易，经济损失惨重。如1997我国台湾、2000年日本和韩国、2001年英国暴发的FMD可以说给该地区或该国畜牧经济以致命的打击。为此，世界各国非常重视FMD的研究。
口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)属于小丽A病毒科，口蹄疫病毒属，该病毒有七个血清型，各型之间无交叉保护反应。疫苗接种是特异性预防FMD的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。目前使用的Fffl)弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，但由于病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒在工厂制备时逃逸等不安全因素，世界上一些地区FMD的暴发似乎与灭活疫苗中残存的活病毒有关，促使人们寻求一种更加安全有效的FMD疫苗。
噬菌体表面展示技术(Phage Display Techniques ,PDT)是上世纪九十年代初发展起来的一种新的基因操作技术，它使表达的外源肽与噬菌体表面特定蛋白融合并展示于其表面，被展示的多肽可以保持相对独立的空间结构和生物特性，借以研究多肽的性质、相互识别和作
3用，并据此从巨大的展示肽库中选择出具有特定功能的多肽(噬菌体
展示肽库技术及其应用研究现状，中国病原生物学杂志，2007， 2 (2):152-154)。
由于抗原在体内诱导免疫反应的过程中起决定作用的结构是抗原表位，而通常表位的长度不过几个到几十个氨基酸，因此以抗原表位为免疫原的疫苗设计是基因工程疫苗的一种重要形式。多肽表位使靶分子的抗原性与毒性作用分离，疫苗载体表面仅展示抗原表位肽段，不存在完整的靶分子结构也不具有完整的靶分子功能。但是，传统的蛋白质抗原表位分析方法主要是通过化学或生物学方法处理抗原分子以获得多肽碎片，再利用单克隆抗体筛选能与之起阳性反应的片段,并以此间接推测抗原表位分布区域及构成表位的关键氨基酸(Mappingof antigenic sites on the nucleocapsid protein of the severeacute respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 2004Nov;42 (11) :5309-14.蛋白质B细胞抗原表位测定方法的研究进展，黑龙江畜牧兽医，2008， 7: 23-24)。此方法筛选出的表位为线性表位，而天然完整蛋白质的抗原表位中，仅10%为线性抗原表位,90%是构象型表位，因此传统方法筛选的序列肽仅模拟蛋白质的线性表位,难以形成构象表位。而且这种方法存在工作量大，工作效率低，成本高等缺陷。
虽然，早在1982年，Bittle和Pfaff等就利用免疫原性多肽首次确定了位于FMDV结构蛋白VP1第140 160位氨基酸之间的G2H环内含有一个免疫原性位点，称之为siteA，是最主要的抗原位点；Krebs和Baxt等进一步研究发现,O型FMDV的VP1变异主要发生在140 160位和200 211位两段抗原表位区，这两个肽段是决定免疫原性的抗原决定簇，但是以这些抗原表位区构建或合成的表位疫苗均无法在仔猪体内诱导高效的免疫应答(Induction of an antigen-specific immuneresponse and partial protection of cattle against challengeinfection with foot-and-mouth disease virus (FMDV) afterlipop印tide vaccination with FMDV-specific B-cell epitopes. JGen Virol. 2003;84 (Pt 12):3315-24.)。
而噬菌体表面展示技术，是一种抗原多肽筛选的简便有效、成本低廉的方法。噬菌体展示技术筛选到的多肽与普通的线性多肽相比扩大了疫苗靶分子选择范围。因为该技术筛选的模拟抗原表位不仅可以模拟多肽、蛋白质的线性表位，还能模拟空间表位以及多糖、寡核苷酸等抗原性较弱的抗原位点，从而以此设计的表位疫苗可能诱导更为有效的免疫应答。
目前，基因工程疫苗在许多疫病的控制中已经发挥了重要作用。
但是，高效的基因工程FMDV疫苗的报道却很少，若能在筛选出FMDV中和性抗原表位的基础上，研制其基因工程疫苗，将有利于研制更为有效的基因工程疫苗。

发明内容
本发明的目的是筛选出一种O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽，并提供该短肽在制备免疫原、猪口蹄疫表位肽疫苗中的应用。
本发明利用噬菌体表面展示技术来筛选有效的FMDV表位，筛选的结果为本发明提供了一种O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽，所述肽的氨基酸序列如下所示
GLSPSDTRDEVH (SEQIDNO:l)
HLFPSDRSVVPL (SEQIDNO:2)
NKAPSDVRQSYP (SEQIDNO:3)
GLFPSDWRGLAL (SEQ ID NO:4)
上述O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽，其共性为均为12
个氨基酸的短肽，其第4-6位的氨基酸残基均为PSD (即脯氨酸一丝氨酸一天冬氨酸)，第8位的氨基酸残基均为R (即精氨酸)，可以用以下通式代表X!X2X3PSDX7RX9Xk)XuX^，其中Xn (n=l-3,7,9-12)代表任意氨基酸。
本发明优选的是具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的短肽。本发明的O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽，是用以下方法筛选得到的
以O型FMDV的多抗猪血清IgG为靶蛋白，从噬茵体展示的随机线形十二肽库(New England Biolabs公司)中筛选到与之结合的短肽。上述短肽可通过本发明技术领域中的常规技术如化学合成等方法 制备。
将本发明公开的短肽序列与GeneBank中已公布的FMDV的蛋白序 列进行比较，未发现有同源性，这些短肽可部分抑制天然抗原与多抗 的结合，说明它们在结构上能模拟天然抗原表位，为一种新的抗原表 位的分子模拟肽。
本发明还提供了上述O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽在制 备免疫原上的应用。
本发明还提供了上述O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽在制 备猪口蹄疫表位肽疫苗中的应用。
将上述分子模拟肽与乙肝病毒核心蛋白类病毒颗粒HBc-VLP融合 表达。经原核表达纯化后做为免疫原，免疫接种小鼠，获得了特异识 别O型FMDV的抗体，说明该表位肽构成免疫原后可以诱导机体免疫 系统产生针对O型FMDV的抗体。利用本发明的短肽，可以提供一种 研制新型FMDV疫苗的途径，该表位肽疫苗具有靶分子的抗原性而不具 有毒性，十分安全，且大规模生产成本很低，具有良好的经济效益和 社会效益。


图l阳性噬菌体抗原竞争抑制试验
图2重组表达载体pBAD-印itope的酶切鉴定
其中l.DL 15000分子量标记；2.DL2000分子量标记；3.重组 质粒经辰o I和J力o I酶切
图3融合表位的HBc嵌合蛋白诱导表达的SDS-PAGE电泳结果及 western分析结果
其中A为电泳结果，M是分子量标记(molecular weight marker); 1 6和8是五.co/!'转入pBAD-epitope重组质粒；7是阴性对照；B为 western分析结果
图4 pBAD-印itope表达的重组嵌合蛋白形成病毒样颗粒的电镜下颗 粒观察结果(放大倍数XIO，OOO)图5重组蛋白免疫Balb/C小鼠诱导抗体的产生
其中图5A为HBc特异性IgG滴度；图5B为FMDV病毒特异性 IgG滴度
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。 实施例l:猪口蹄疫病毒VP1抗原模拟表位的筛选及序列分析 一、实验材料
1. 噬菌体随机肽库试剂盒
噬菌体表面衣壳蛋白III展示的线形12肽库试剂盒购自美国New England Biolabs公司。肽库的滴度4X 1012pfo / ml，随机多样性1.9X 109;受体菌E.coli ER2537基因型为F'lacqA(lacZ)M15proA+B+fhuA2 supE thiA( 1 ac-proAB)A(hsdMS-mcrB)5(rk—mk—McrBC)。
2. 化学试剂
BSA购自Roche公司；IPTG、 X-gal购自Bebco公司；PEG8000 、 PEG20000 、 ABTS、 Tween20购自Sigma公司；口蹄疫ELISA检测试剂盒 为中国农业科学院兰州兽药研究所生产；HRP标记的抗M13单克隆抗体、 DEAE s印hadex A50购自Pharmacia公司；猪O型FMDV-VP1蛋白、猪O 型FMDV-VPl阳性抗血清按文献方法制备(Induction of immunity in swine by purified recombinant VP1 of foot-and-mouth disease virus. Vaccine. 2003 S印8;21 (25-26) :3721-9.)。
3. 相关试剂的配制
PB缓冲液0.02mol/LNa2HP04， 0. 02mol / L NaH2P04;
TBS缓冲液50mmol / LTris.Cl(pH8.0)， lmmol / LEDTA，高压灭
菌；
PEG / NaCl: 20%(w / v)PEG 8000， 2.5mol / LNaCl，高压灭菌； 碘化钠缓冲液10mmol/LTris.Cl(pH8.0)， lmmol/LEDTA， 4mol /LNal;
低盐LB培养基酵母提取物5g、胰蛋白胨10g和NaCI 5g溶解于 蒸馏水并定容至1L，高压灭菌； 顶层琼脂糖LB培养基+lg/LMgCl2.6H20+7g/L琼脂糖，高压灭
7菌；
底层LB/IPTG/X-gal平板LB培养基+15g / L琼脂粉，高压灭 菌，冷却至7(TC时，加入IPTG和X—gal(终浓度分别为50吗/ml， 40吗/ml)，铺平板。 二、方法
1. IgG的分离与纯化
对猪FMDV-VP1抗血清采用饱和硫酸铵沉淀法进行IgG粗 提，PBS(O. 01mo1/ L ， pH7. 4)缓冲液透析48h后用PEG 20000进行浓縮。 将浓縮后的IgG粗提产物上平衡好的DEAE s印hadex A50柱，用PBS (0. 01mo1/ L ， pH7. 4)缓冲液洗脱，收集洗脱的IgG，透析除盐后，用PEG 20000进行浓縮，紫外分光光度法测定蛋白质浓度，并用ELISA法检测 其生物学活性。
FMDV-VP1 IgG经饱和硫酸铵粗提，DEAE s印hadex A50纯化后， 用紫外分光光度法测得蛋白质浓度为63.25mg/mL;稀释200倍后， ELISA检测IgG与FMDV-VPl呈阳性反应。
2. 噬菌体随机肽库的筛选
吸取150pL 500倍稀释的纯化IgG(稀释后浓度约100u g/ mL)， 加入到预冷的微孔板板孔中，parafilm膜封口，4。C过夜。倾掉板孔中 的包被液，在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。加200 pL封阻 缓冲液
，4 。C作用l h 。倾去封阻液，TBST洗板6次后，加入100uL TBS稀释的 噬菌体文库(含l. 8 X1011个病毒子和luL纯化的NSP-VPl阴性IgG), 室温孵育l h ，倾去未结合噬菌体，TBST缓冲液洗板。加入100uL FMDV- VP1溶液(100 ug/ mL)，室温洗脱5 min ，弃去洗脱液，再加入 100 u L FMDV-VP1溶液，37。C洗脱30min 。将洗脱物移入干净微量离 心管中，取2 p L用于滴度测定，其他用ER2738菌扩增、纯化后，用于下 一轮筛选。筛选时设空白对照(记作N)，不包被IgG，其他同试验孔 (记作P)。重复上述步骤，共筛选4轮，并通过降低靶分子浓度、延长 结合时间、提高TBST中Tween20浓度的方法，逐轮增加选择压力。在第4 轮筛选后，洗脱液不再扩增，随机挑取20个蓝色噬菌斑，进行扩增，制备噬菌体贮液，用于进一步研究分析。计算每一轮筛选的回收率和P/N值，
分析富集效果。回收率计算方法:回收率(％)=投入的噬菌体数/回收 的噬菌体数X 100%.噬菌体滴度测定、洗脱物扩增与纯化，按 《PH. D-12 Phage Display P印tide Library Kit》操作手册进行。 经过4轮吸附2洗脱2扩增的富集筛选，结果显示，随着筛选轮次的 增加，试验组的回收率逐轮提高(1.37X10—7 3. 12X10—"，对照组回 收率逐轮降低(4.22X10—8 1. 21X10—s);而P/N值随着筛选轮次的 增加显著提高(5.3 197.1)，表明目的克隆得到了有效富集，非目的 克隆被有效剔除。
3.双抗体夹心ELISA鉴定噬菌体阳性克隆
取150pL 500倍稀释纯化的IgG(稀释后浓度约100 pg/mL)包被 酶标板，为每个待鉴定的噬菌体克隆包被一个板孔，另外包被两个板孔 作空白对照和阴性对照，在另一酶标板包被相同浓度的纯化的 FMDV-VPl阴性IgG，置4。C过夜。各孔加满封阻液，4。C封阻lh， TBST洗 板6次。将待鉴定的噬菌体贮液用TBS稀释至约10"个病毒子/mL ，在包 被好的酶标板孔中加入100uL ，阴性对照板孔中加入含10n个病毒子 的原始肽库。37。C作用30min ， TBST洗板6次，加入5000倍稀释的服P 标记的抗M13单克隆抗体，37t:作用30min ，同样用TBST洗板6次，每孔 加入ABTS底物溶液，室温避光放置10 20min后酶标仪测量405nm的0D 值，测试样0D大于阴性对照2. 1倍视为阳性，与FMD-VP1阴性IgG反应
呈阳性者视为假阳性。
在经4轮筛选得到的噬菌体克隆中，随机挑取30个蓝色噬菌斑进行 扩增，制备噬菌体贮液，ELISA鉴定结果显示有5个克隆(7、 8、 11、 16、 19)与纯化后的IgG呈0D值较高的阳性反应，且与FMD-VPl阴性IgG无交 叉凝聚(表l)。
表l双抗夹心ELISA鉴定噬菌体克隆结果
噬菌体克隆
噬菌体文库4. 抗原竞争抑制ELISA
包被FMDV-NSP 3ABC阳性IgG，方法同上。4。C过夜，封阻l h ，洗板 后加入1.2.3中初步鉴定的含10"病毒子的噬菌体贮液与5 u g FMDV-NSP 3ABC的混合液共100uL ，其他ELISA方法同l. 2. 3 。测定 OD值，计算抑制率。
公式为抑制率(％) 二 (OD未抑制-OD抑制)/ 0D未抑制X100呢 结果表明5个阳性克隆均出现不同程度的被抑制现象(图1)，抑制 率55% 77%。这种被特异性抗原所抑制的现象说明，在没有被抑制的情 况下，阳性噬菌体克隆特异性地结合在IgG的H链可变区的抗原抗体结 合部位，而不是非特异性结合。
5. 阳性克隆DNA序列推定的短肽序列分析
将经过ELISA鉴定的5个具有生物学活性的阳性噬菌体克隆扩增， 提取ssDNA进行DNA测序，推导出其编码的氨基酸序列，其中08 、 19号 克隆碱基序列和氨基酸序列完全一致，属同一个克隆扩增产物，其他2 个克隆也不同程度地具有保守序列。结果如下所示。
19号克隆GLSPSDTRDEVH (SEQIDNO:l)
08号克隆GLSPSDTRDEVH (SEQIDNO:l)
16号克隆HLFPSDRSVVPL (SEQIDNO:2)
ll号克隆NKAPSDVRQSYP (SEQIDNO:3)
07号克隆GLFPSDWRGLAL (SEQIDNO:4)
采用Blast软件对结合肽进行比较，上述氨基酸序列有共同的核心 序列PSD-R。
实施例2:模拟表位肽在疫苗中的应用 一、实验材料
1. 实验动物C57BL/6(H-2kb)小鼠和Balb/c小鼠，6-8周龄，购自第
二军医大学实验动物中心。 .
2. 菌株和基因工程载体基因工程用宿主菌:大肠杆菌DH5a 、Top10，； pVAXl载体、pBAD/glll A载体(购自Invitrogen Life Science)。
3. 常用试剂
anti-HBcAg mAb购自 Biodesign公司，HRP-conjugated Rabbitanti-mouse IgG贝勾自Sigma公司。 PCR引物由上海基康、博彩公司合成。
常用酶类限制性内切酶Sac I、 Bbe I、 Nco I、 Xho I，均为Takara 公司产品。RNase为华舜公司产品。
分子生物学试剂盒pGEM-T试剂盒为华舜公司产品；PCR试剂盒、T4 连接酶试剂盒为Takara公司产品。
常用分子生物学试剂DNA分子量Marker DL2000，为Takara公司产 品。琼脂糖、Tris饱和平衡酚、EB等为Sigma公司或华舜公司产品。 大肠杆菌培养用试剂胰蛋白胨、酵母提取物、SDS、 Triton X-100、 反转录试剂盒等为上海博彩公司产品。
常规化学试剂NaCl, KAc， NaH2P04， Na2HP04， Tris， EDTA, NaOH, EB，HCl，NaAc，DMSO，无水乙醇，乙醚，异丙醇，柠檬酸纳，甘 油，氯仿等分别为Sigma， Merck， Aldrich， Gibco等公司产品和国 内分析纯产品。 4.主要仪器设备
PCR仪PE480和PE2400两种型号均为Perkin-Elmer (PE)公司 产品；紫外分光光度计Pharmacia Biotech, ULTRASPEC1000; TGL-台式高速离心机MIKRO 12-24， HETTICH公司产品；细菌培养摇床 上海离心机械研究所；超纯水制备设备Labconco Water proTMPS;生 化培养箱LDR-15B广东省医疗器械厂；细胞室离心机TL-5.0台式 离心机，上海市离心机械研究所；二氧化碳细胞培养箱Heraeus产品； 凝胶成像系统ChemihnagerTM5500;电穿孔仪美国BioRad公司产
1. HBc-VLP疫苗载体的构建
根据O型FMDV—VP1'多抗猪IgG对线性12肽库的筛选结果，选 出 一条模拟表位序列GLSPSDTRDEVH ( SEQ ID NO: 1);带有该融合 肽段的噬菌体克隆命名为Phage-19。人工合成该肽段的编码碱基酸序 列。将其插入原核表达载体pBAD表达HBc蛋白1-144位氨基酸的基因 序列的主要免疫显性区域部位(第75位氨基酸)，使其展示于HBc类
ii病毒颗粒的表面。重组质粒命名为pBAD-印itope。
基因片段的设计合成人工合成编码目的肽段的互补碱基序列，
并且在两端各加酶切位点，分别命名为Prl、 Pr2。按照原始Phage-19 测序结果合成如下碱基序列，并在5'端加Bbe I， 3'端加Sac I: Prl: GAGGCGCCGGTCTATCTCCATCGGACTCAAGAGACGAGATACATGAGCTCGC Pr2: GCGAGCTCATGTATCTCGTCTCTTGAGTCCGATGGAGATAGACCGGCGCCTC
将上述DNA片段退火后用相应的限制性内切酶酶切目的片段和 pBAD载体，进行连接、转化。小量快速抽提质粒并酶切鉴定。
重组子分别经相应的内切酶酶切，切出2条片段，大片段约5. 0 kb， 为线性载体，小片段约为0.5 kb，与设计值相符(图2)。测序结果表 明，含目的表位的全基因合成片断正确地插入到HBc的第75位形成嵌 合基因，序列与设计的完全相符。
2.原核表达质粒pBAD-HBc-multi印itope嵌合抗原的表达与纯化
诱导表达原核表达所用的宿主菌为冗coh' TOPIO，将含有目的基 因的原核表达重组质粒的甘油菌10iU接种至3ml含氨苄青霉素的LA培 养基中(LA)， 37° C摇床培养过夜，然后以1%的接种量接种至另一含 有LA培养基的三角烧瓶中，37r培养至0D值约为0.4 0.6后，加入合 适浓度的阿拉伯糖，继续培养4h，离心收集菌体，每3g大肠杆菌重悬于 20ml缓冲液A中；经超声破碎后，离心收集超声上清和沉淀，进行15% 的SDS-PAGE电泳，观察有无蛋白的表达及表达产物存在于上清中还是 包涵体中。结果显示，与空载体诱导物相比，抗原均获得了表达，分 子量约27kDa，与推测的分子量相符，在诱导剂L-阿拉伯糖的浓度为 0.02%时，目的蛋白约占菌体总蛋白的20%左右(图3A)。
包涵体的变性、亲和层析及复性。将收集的菌体超声后，12 000 rpm 4。C离心20 min —将沉淀重悬于9倍体积的含0. 5% TritonX-100的缓冲 掖A中，用研磨棒研磨充分，室温放置10min， 13 000 rpm 4。C离心10 min，重复3遍一加含有变性剂(0-8M尿素)的NTA缓冲液(3g湿菌加入 20ml液体)，室温在磁力搅拌器上搅拌30 min， 13 000 rpm 4"离心1 Omin，分别收集上清和沉淀；进行15% SDS-PAGE电泳，观察溶解包涵 体的变性剂的浓度。用该浓度的变性剂尿素溶解包涵体，加到NTA亲和 层析柱上，分别用含NTA洗脱缓冲液(含20 mmol/L-1000鹏ol/L咪唑和尿素)洗脱，收集洗脱的蛋白，15。/。SDS-PAGE电泳观察。结果显示， 当洗脱液中的咪唑浓度lmol/L时，大部分的目的蛋白被洗脱下来，变 复性后蛋白的纯度约有95%以上。
稀释目的蛋白(至终浓度约为O. lmg/ml)，装入透析袋中透析复性， 透析液中加入氧化型和还原型的谷胱甘肽(2mmol/L)，复性72h。将复 性后的蛋白用PEG浓縮，再用缓冲液A进行透析，13000 rpm 4'C离心 20min ，收集上清待用。
3. 表达产物的Western blot鉴定
将表达产物经15%的SDS-PAGE电泳，切10张大小与凝胶一样的 3ram Whatman滤纸和1张硝酸纤维素膜，凝胶在阴极，硝酸纤维素膜 在阳极，根据凝胶面积按0.65mA/cm2的电流量进行转移，转移时间为 2 3h。转移完毕后，取膜，用洗膜液洗3次，以0. lml/cm2的封闭液 I 37'C封闭lh，加入用封闭液I稀释的一抗，37'C孵育lh，用洗涤 液I洗膜3次，用洗涤液II洗1次后加入用封闭液II稀释二抗(1: 100) 37°C孵育lh，用洗涤液II洗3次，以免疫印迹化学发光试剂 Supersignal CL-服P底物溶液显示特异蛋白信号并曝光显影。 Western结果显示，变复性后的目的蛋白能被抗HBc单抗所特异性地 识别，说明抗原经纯化、复性后保持了原来的免疫原性(图3B)。
4. 电镜观察颗粒样蛋白的形成
将纯化得到的 HBc-印itope 嵌合蛋白 (HBc 1-76-印itope-HBc76-144)吸附到400目铜网上，负染，透射电镜观 察。发现重组嵌合蛋白具有明显的颗粒样结构(图4)。
5. 疫苗免疫及免疫应答检测
购6-8周龄的雌性BalB/C纯系鼠，随机分成4组，每组8只小鼠。 组1为未免疫蛋白的而仅用佐剂的空白对照组；组2为VLP融合表位 免疫组，分别用50 u g的疫苗蛋白颈背部皮下多点注射；组3为VLP 不含表位的对照组，并加弗氏佐剂；组4为VLP融合表位免疫组，并 加弗氏佐剂。共免疫3次，免疫间隔2周，第3次免疫后4天取眶上 静脉血。检测病毒特异性抗体和肽特异性抗体。结果发现，重组蛋白 诱导了多肽特异性抗体(图5A)，和病毒特异性抗体(图5B)。
13SEQUENCE LISTING 〈110〉中国人民解放军第二军医大学
〈120> —种O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽及其用途 <130>说明书，权利要求书
<歸 4
〈170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211> 12
〈212〉 PRT <213>人工序列
<400> 1
Gly Leu Ser Pro Ser Asp Thr Arg Asp Glu Val His 1 5 10
〈210〉 2
<211> 12
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈400〉 2
His Leu Phe Pro Ser Asp Arg Ser Val Val Pro Leu 1 5 10
〈210〉 3
〈211〉 12
〈212> PRT
<213> 人工序列
<400〉 3
Asn Lys Ala Pro Ser Asp Val Arg Gin Ser Tyr Pro 1 5 10〈210〉 4 〈211〉 12
<212> PRT 〈213>人工序列
〈400〉 4
Gly Leu Phe Pro Ser Asp Trp Arg Gly Leu Ala Leu 1 5 10
权利要求
1、一种O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1、2、3或4所示。
2、 如权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽在制 备免疫原上的应用。
3、 如权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽在制 备猪口蹄疫表位肽疫苗上的应用。
全文摘要
本发明涉及分子免疫学领域，目前使用的口蹄疫弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗虽然具有良好的免疫原性，但是存在病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒从制备工厂逃逸等不安全因素，促使人们寻求一种更加安全有效的FMD疫苗。本发明利用噬菌体表面展示技术来筛选有效的FMDV表位，提供出一种O型口蹄疫病毒抗原表位的分子模拟肽，本发明还提供该模拟肽在制备免疫原、猪口蹄疫表位肽疫苗中的应用。利用本发明的FMDV表位肽疫苗具有靶分子的抗原性而不具有毒性，十分安全，且大规模生产成本很低，具有良好的经济效益和社会效益。
文档编号A61K39/125GK101597327SQ200810201859
公开日2009年12月9日 申请日期2008年10月28日 优先权日2008年10月28日
发明者奇 周, 孙树汉, 毅 张, 越 王, 郭瀛军 申请人:中国人民解放军第二军医大学