参见图6的图示。
[0242] (ii)NgR缺失突变体的表达。
[0243] 人NgRC末端氨基酸的缺失导致膜锚定特性的丢失及可溶性受体蛋白在细胞上 清中的存在。在N末端，hNgR的信号肽（氨基酸1-27)被载体中编码的信号肽取代。因 此使用起始于hNgR的氨基酸27、终止于hNgR的氨基酸450的N末端和C末端缺失变体 (hNgR27-450)作为这些突变体的基础，以使可溶性蛋白存在于细胞上清。此外，这些突变体 包含短的氨基酸标签以便纯化这些蛋白。hNgR突变体的DNA在293F细胞中瞬时表达。72 小时后通过离心收集细胞上清。按下文方法进行蛋白纯化。利用下列编码7种不同人NgR 突变体的DNA进行转染。
[0244] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/Myc/His
[0245] ?pSecTag2AigK/hNgR58-450/Myc/His
[0246] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A58-106/Myc/His
[0247] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/Al〇6-155/Myc/His
[0248] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A155-202/Myc/His
[0249] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A203-250/Myc/His
[0250] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A260-310/Myc/His
[0251] ?PSecTag2AigK/hNgR27-310/Myc/His
[0252] hNgR突变体的DNA在293F细胞中瞬时表达。
[0253] (iii)利用Ni-螯合物亲和力（Ni-NTA)纯化NgR蛋白
[0254] 使用Ni-NTA超流珠（QiagenQiagen#1018611)。将珠子用PBS(磷酸盐缓冲液， Invitrogen)清洗3次，通过在13500rpm离心珠子悬液，弃去上清，并在新配PBS中重悬珠 子。30ml细胞培养上清使用200y1珠子悬液。将珠子与细胞培养上清在4°C旋转器（60rpm) 上温育过夜，温育后离心（10分钟，3000rpm)沉淀珠子。弃去上清，用PBS清洗珠子3次。 利用250yl洗脱缓冲液（PBS，160mMNaCl，150mMImidazol)从珠子洗脱结合的蛋白。在 室温下旋转器上温育30分钟后，通过在13. 500rpm离心3分钟沉淀珠子。提取上清。将洗 脱蛋白在-20°C冷冻用于进一步分析。
[0255] 利用hNgR缺失突变体的斑点印迹实验的数据概述于表6。
[0256]表 6.
[0257]
[0258] +++ :非常强的信号；++ :强的信号；
[0259] + :有信号；_ :无信号；~：无相关信号.
[0260] 实施例8A.MAG-Fc结合NgR-Fc的竞争
[0261] 为进一步表征单克隆抗体，使用类似于实施例2的结合分析法的竞争分析法来检 测实施例1中产生的两种mAbs抑制MAG-Fc结合人NgR-Fc的能力。将溶于50mM碳酸钠缓 冲液口1^9的呢1?-?(3(0.2 118/孔，1?&0 35^七61118)在96孔微量滴定板（他11〇]\^?18〇1'13)中 4°C固定过夜，然后用溶于Tris-HCL，pH7. 2的2%BSA在室温下封闭2小时。
[0262] 通过Zenon人IgG标记试剂盒（MolecularProbes)利用辣根过氧化物酶标记 MAG-Fc(R&DSystems重组大鼠MAG/FcChimera，目录号538-MG)。向所述孔中添加恒定浓 度的标记MAG-Fc(终浓度50ng/ml，溶于含0? 1 %BSA的Tris-HCL，pH7. 2)及指定浓度的 mAb50和mAb51。将其在室温下温育60分钟，并利用未标记的MAG-Fc和NgR-Fc作为对 照。每次温育步骤期间，用清洗缓冲液（10mMTris-HCl，pH7. 2和0. 05%TWeen20)清洗板。 在标准条件下利用3,3<，5,5< -四甲基联苯胺底物（TMB，Pierce)显色标记的MAG-Fc。 如图7所示，mAb50 (闭合三角形）和mAb51 (空心三角形）不抑制MAG-Fc与人NgR的结 合。MAG-Fc和NgR-Fc与标记的MAG-Fc(闭合环）竞争结合NgR-Fc(-种融合蛋白，包括人 NgR的氨基酸Met1到Ser447及人Fc片段（R&DSystems);闭合正方形）。因此，在这些 条件下mAb50和mAb51不与MAG竞争结合NgR(Figure7)。在这些条件下也没有其他剩余 的抗体与MAG竞争结合NgR。
[0263] 实施例8B.OMgp结合NgR-Fc的竞争
[0264] 为进一步表征单克隆抗体，使用类似于实施例8a的结合分析法的竞争分析法来 检测实施例1中产生的两种mAbs抑制oMgp结合人NgR-Fc的能力。将溶于50mM碳酸钠缓 冲液口1^9的呢1?-?(3(0.2 118/孔，1?&0 35^七61118)在96孔微量滴定板（他11〇]\^?18〇1'13)中 4°C固定过夜，然后用溶于Tris-HCL，pH7. 2的2%BSA在室温下封闭2小时。向所述孔 中添加恒定浓度的人OMgp(R&DSystems/1673-OM;终浓度500ng/ml，溶于含0. 1 %BSA的 Tris-HCL，pH7. 2)及指定浓度的mAb50和mAb51。将该混合物在室温下温育60分钟。 利用标记辣根过氧化物酶的抗His抗体（Roche)检测OMgp结合。每次温育步骤期间，用清 洗缓冲液（10mMTris-HCl，pH7. 2和0. 05%Tween20)清洗板。在标准条件下利用3,3'，5， 5'-四甲基联苯胺底物（TMB，Pierce)显色标记的抗His抗体。
[0265] 如表7所示，mAb50和mAb51部分阻断OMgp与人NgR的结合（30-40%范围）。其 他抗体，除mAb52和mAb59外，也部分阻断OMgp与人NgR的结合，甚至在超过100倍摩尔过 量的直至80yg/ml的浓度（表7)。
[0266]表 7.
[0267]
[0268]实施例9.大鼠DRG中mAB50和mAb51对N〇g〇66诱导的轴突牛长抑制的中和。
[0269] 使用出生后3-6天的大鼠幼崽的背根神经节（DRGs)研究抗NgR抗体对轴突生长 的作用。
[0270] 为了制备DRGs，用手术剪给6-8只大鼠幼崽断头。通过去除腹部器官和椎骨，从腹 面解剖脊椎。然后，借助于精细手术剪纵向打开脊椎。取出脊髓及粘附的DRGs，将其转移 到含PBS的10cm培养皿。利用两把精细镊从DRGs中剔除脊髓和连接的神经纤维，将其转 移到含lmlPBS的35mm培养皿。在收集所有DRGs后，添加溶于PBS的0. 5ml胶原酶溶液 (4mg/mlI型胶原酶，Worthington#CLS-l)，将DRGs在 37°C温育 20-30 分钟。添加 0? 5ml 胰蛋白酶溶液（0.5%胰蛋白酶（561^\#37290)，溶于？85)，将01?8在37°(：再温育15-25分 钟。将DRGs转移到 15ml管，添加 10ml培养基（DMEMNutMixF12(Gibco#31330-038)， 加5%FCS(Gibco,热灭活）加5%马血清（Sigma，热灭活）加1%青霉素/链霉素 (Gibco#15140-122))。在DRGs沉降到管底后，去除上清。在2ml培养基中离解DRGs，利用 穿过Pasteur移液管3-5次，然后再穿过缩径开口的Pasteur移液管2-3次。在细胞团沉降 后，将包含解离细胞的上清转移到新管。通过在lOOOrpm离心5分钟收集细胞，将其重悬于 2ml培养基，计数，并用添加神经生长因子（NGF;62. 5yg/ml终浓度，Roche#1014331)的培 养基稀释到所需细胞密度。将4000-7000个细胞种于每孔80y1体积的聚赖氨酸包被96孔 板（例如，BecktonDickinson#356640)，所述板已经另外用100ul包被溶液（1瓶层粘连蛋 白（lmg/mlSigma#L-2020)，用50ml无菌水稀释），然后在37°C温育30分钟到3小时。在 细胞种植后添加体积为10y1的浓度增加的抗体。在37°C的C02培养箱中温育2小时后， 添加10y1AP-Nogo66。细胞生长18-30小时，通过添加100y1溶于PBS(磷酸盐缓冲液； Gibco#14190-094)的4%多聚甲醛溶液进行固定，然后在4°C温育至少12小时。作为96孔 板的替代，使用24孔板（例如，Falcon#353047)及聚赖氨酸包被的盖玻片（例如，Becton Dickins〇n#354085)，并用500y1包被溶液进行包被。使用抗-0III微管蛋白抗体（例如， Abcam#abl4545)及Cy3_偶联二抗（例如，JacksonImmunoResearch#715-165_151)，通过间 接免疫焚光法显示轴突生长。通过向二抗添加Bisbenzimide(H33258)对细胞核进行染色。 在BDTMPathwayBioimager(BecktonDickinson)上获取10X放大倍数的显微图像，并利 用AttoNO(BecktonDickinson)软件测定轴突长度。将轴突生长归一化为每幅图像中DRG 的数目。图8显示作为一个实例，mAb50对AP-Nogo66-诱导的轴突生长抑制的中和。图9 显示分别利用抗体mAb50和mAb51的实验的结果。与没有AP-Nogo66(第1栏）的对照条 件相比，AP-N〇g〇66的应用明显降低了轴突生长的长度（第2栏）。两种抗体均以剂量依赖 性方式中和AP-Nogo66诱导的轴突生长的抑制。与没有抗体的AP-Nogo66应用（第2栏） 相比，对于两种抗体来说，在50yg/ml(最后一栏）被归一化为DRG数目的轴突长度是统计 上不同的。
[0271] 对于抗体Mab52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,60,61和62来说，也获得轴突生长抑制 的改善。Mabl和Mab4不改善AP-Nogo66对轴突生长的抑制。
[0272] 从这些结果可以总结得出，这类抗体具有在生长抑制环境中刺激轴突生长的潜 能。
【主权项】
1. 一种单克隆中和抗体或其抗原结合片段，其与Nogo-66受体的至少一个表位特异性 相互作用，其中所述单克隆中和抗体或其抗原结合片段包含： 包括包含SEQ ID NO :5的序列的重链可变区（VH区）的序列；和 包括包含SEQ ID NO :6的序列的轻链可变区（VL区）的序列。2. 权利要求1的中和抗体，其中所述中和抗体降低Nogo-66与其受体结合的能力。3. 权利要求1的中和抗体，其中所述中和抗体能够中和Nogo-66受体。4. 权利要求1的抗体，其中所述Nogo66受体选自人，短尾猴，大鼠，小鸡，蛙和鱼。5. 权利要求1的抗体，其中所述1*^〇66受体多肽与选自5￡0 10从)：13和3￡0 10勵:23 的氨基酸序列具有90%同源性。6. 权利要求1的抗体，其中所述Nogo66受体由与核酸序列SEQ ID NO: Ib和SEQ ID NO: 2b具有90%同源性的核酸编码。7. 权利要求1的抗体，其具有范围从10 7M到10 13M的解离常数（Kd)。8. 权利要求1的抗体，其具有范围从10 3M 1S 1到10 7M 1S 1的结合速率常数（K J。9. 权利要求1的抗体，其具有范围从10 3S 1到至少约10 6S 1的解离速率常数（K rff)。10. 权利要求1的抗体，其具有范围从10 6S 1到至少约10 12S 1的IC5。值。11. 权利要求1的抗体，其结合人NgR的EC 5。范围为I X 10 9M到I X 10 nM。12. 权利要求1的抗体，其结合人NgR，其中所述抗体是糖基化的。13. 权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是小鼠抗体，人 源化抗体，完全人的抗体，嵌合抗体，人源化抗体的抗原结合片段，或嵌合抗体的抗原结合 片段。14. 权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是选自Fab片 段、Fab'片段、F (ab'）2片段和Fv片段的抗原结合片段。15. -种单克隆抗体，其特异性结合Nogo-66受体的至少一个表位，其中所述单克隆抗 体是由杂交瘤细胞系ATCC NO. PTA-8384分泌的单克隆抗体。16. 权利要求15的单克隆抗体，其中所述结合导致Nogo-66受体的失活。17. -种产生权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞系，所述单克 隆抗体或其抗原结合片段特异性结合Nogo-66受体的至少一个表位。18. 权利要求17的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤选自小鼠和人杂交瘤。19. 权利要求17的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤选自大鼠，绵羊，猪，牛，山羊和马杂 交瘤。20. 权利要求1的单克隆中和抗体或其抗原结合片段，具有选自以下的至少一个特 征： a) 以nM范围或更低的亲和力结合哺乳动物NgR ; b) 在轴突生长分析法中以nM或更低效能体外功能性诘抗Nogo-66结合； c) 在轴突生长分析法中以nM或更低效能体外功能性诘抗Nogo-66结合； d) 在视神经压榨伤模型中体内诱导萌生；和 e) 体内减轻实验性脊髓损伤。21. -种分离的核酸，其编码权利要求1的单克隆中和抗体或抗原结合片段。22. -种包括权利要求21的分离的核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA ;pTT ;pTT3 ; pEFBOS ;pBV ;pJV 和 pBJ。23. -种用权利要求22的载体转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自原生生物细 胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。24. 权利要求23的宿主细胞，其中所述动物细胞是选自HEK293、CHO和COS的哺乳动 物细胞。25. -种用权利要求22的载体转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。26. -种制备如权利要求1所述的结合人和/或大鼠NgR的结合蛋白的方法，所述方法 包括在足以产生结合人和/或大鼠NgR的结合蛋白的条件下在培养基中培养宿主细胞。27. -种药物组合物，所述组合物包括权利要求2或3的单克隆抗体或抗原结合部分和 药学上可接受的载体。28. 权利要求2或3的抗体在制备用于在需要其的个体中减少Nogo-66结合Nogo-66 受体的药物中的用途。29. 权利要求2或3的抗体在制备用于逆转Nogo-66诱导的轴突生长抑制的药物中的 用途。30. 权利要求2或3的抗体单独地或与其他治疗剂联合地在制备用于治疗个体与NgR 活性有关的疾病的药物中的用途。31. 权利要求30的用途，其中所述疾病包括神经学疾病，所述神经学疾病选自肌 萎缩侧索硬化，臂丛损伤，脑损伤，包括外伤性脑损伤，脑瘫，Friedrich's共济失调， Guillain-BarW综合征，脑白质营养不良症，多发性硬化，脊髓灰质炎后，脊柱裂，脊髓损 伤，棘肌萎缩，脊柱瘤，中风，和横贯性脊髓炎。32. 权利要求30的用途，其中所述疾病包括神经学疾病，所述神经学疾病选自痴呆， 老年性痴呆，轻度认知受损，阿尔茨海默尔相关痴呆，亨廷顿氏舞蹈病，迟发性运动障碍，痉 挛，躁狂症，帕金森氏病，steeI-Richard综合征，唐氏综合征，重症肌无力，神经创伤，血管 淀粉样变性，具有淀粉样变性的脑出血I，脑炎症，Friedrich's共济失调，急性精神错乱， 肌萎缩性侧索硬化，青光眼和阿尔茨海默氏病。33. 权利要求2或3的抗体单独地或与其他治疗剂联合地在制备用于降低患病个体中 人NgR活性的药物中的用途，所述疾病中NgR活性是有害的。
【专利摘要】本发明涉及抗NOGO-66受体(NGR)的中和单克隆抗体及其用途。本发明涉及结合Nogo-66的分离的蛋白，尤其是单克隆抗体。具体来说，这些抗体具有抑制Nogo-66受体的天然配体的结合及中和Nogo-66受体的能力。本发明的这些抗体或其部分可用于例如在患有疾病的人中检测NgR及抑制NgR活性，其中NgR或Nogo-66活性在所述疾病中是有害的。PTA-838320070425
【IPC分类】C07K16/28, C12R1/91, C12N5/20, A61P37/02, A61P25/28, C12N15/13, A61P25/00, C12N15/63, A61K39/395
【公开号】CN105111310
【申请号】CN201510212518
【发明人】M.梅茨勒, A.梅勒, R.米勒, B.K.米勒, T.加于尔, E.H.巴罗, M.施米德特, A.梅耶, N.托伊施
【申请人】雅培制药有限公司, Abbvie德国有限责任两合公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2007年11月21日
【公告号】CA2670368A1, CN101969999A, EP2091563A2, EP2091563A4, EP2700410A1, US7906120, US20080279859, US20110142845, US20140065155, WO2008064292A2, WO2008064292A3