链抗体
[0083] 本申请包括结合本发明的免疫原性NgR的单链抗体（scFv)。为了制备scFv，将 VH-和V-编码DNA可操作的连接到编码柔性接头的DNA，例如编码氨基酸序列（G1Y4-Ser)， 这样的话VH和VL序列可以被表达为邻接的单链蛋白，其中VL和VH区域通过柔性接头连接 (参见例如，Bird等人（1988)Science242 :423_426;Huston等人（1988)Proc.Natl.Acad. Sci.USA85:5879-5883;McCafferty等人，30Nature(l99 0)34 8:552-554)。如果只使用 单个VH和VL，则该单链抗体可以是单价的；如果使用两个VH和VL，则其是二价的；或如果 使用超过两个VH和VL，则其是多价的。
[0084] 嵌合抗体
[0085] 本申请还包括双特异性抗体或其抗原结合片段，其中一种特异性是针对本申请的 免疫原性Nogo受体-1多肽。例如，可以产生嵌合抗体，其通过一个结合结构域与本发明的 免疫原性NgR多肽特异性结合，通过第二结合结构域与第二分子特异性结合。术语"嵌合抗 体"表示包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列及来自另一个物种的恒定区序列的抗 体，诸如具有与人恒定区连接的小鼠重链和轻链可变区的抗体。嵌合抗体可以通过重组分 子生物技术产生，或可以物理上偶联。此外，可以产生包含超过一个VH和VL的单链抗体， 该抗体特异性结合本发明的免疫原性多肽和另一个分子，所述分子与减弱的髓磷脂介导生 长锥萎缩及轴突生长和萌芽的抑制有关。可以利用公知的技术例如Fanger等人Immunol Methods4 :72_81 (1994)和WrightandHarris，20 (上文）产生这种双特异性抗体。在一 些实施方案中，利用本发明抗体的一个或多个可变区制备嵌合抗体。在另一个实施方案中， 利用所述抗体的一个或多个CDR区制备嵌合抗体。术语"人源化抗体"是指包括非人物种 (例如，小鼠）的重链和轻链可变区序列的抗体，但其中至少一部分VH和/或VL序列被改 变的更"像人"，即，更类似于人类种系的可变序列。一类人源化抗体是CDR移植抗体，其中 将人CDR序列引入非人VH和VL序列以取代相应的非人CDR序列。
[0086] 人源化抗体
[0087] 人源化抗体是结合目标抗原的非人物种的抗体分子，其具有来自非人物种的一个 或多个互补决定区（CDRs)及来自人免疫球蛋白分子的骨架区。已知的人Ig序列是本领域 公知的。这类输入的序列可用于降低免疫原性，或降低、增强或改变结合、亲和力、结合率、 离解率、亲合力（avidity)、特异性、半衰期或任何其他相应的特性，这些都是本领域已知 的。
[0088] 人骨架区的骨架残基可以用来自CDR供体抗体的对应残基替换，以改变（优选的 提高）抗原结合。这些骨架替换可以利用本领域公知的方法鉴定，例如，通过对CDR和骨架 残基的相互作用建模，以鉴定对于抗原结合重要的骨架残基，并进行序列比较以鉴定特定 位置的罕见骨架残基。（参见，例如，Queen等人，美国专利号5, 585, 089 ;RieChmann等人， Nature332:323(1988)，其在此完整引入作为参考。）通常提供有三维免疫球蛋白模型，并 且其被本领域技术人员所熟知。可以获得计算机程序，其说明和展示挑选的候选免疫球蛋 白序列的可能三维构象结构。对这些展示的检查可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能 中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基。采用这种方法，可 以选择FR残基并与共有的输入序列组合，这样的话就可以实现需要的抗体特性，例如对靶 抗原增加的亲和力。通常，CDR残基直接并且最实质地参与影响抗原结合。可以利用本领 域已知的各种技术将抗体人源化，诸如但不限于以下描述：Carter等人，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A. 89 :4285 (1992);Presta等人，J.Immunol. 151 :2623 (1993)，Padlan，Molecular Immunology28(4/5) :489_498(1991);Studnicka等人，ProteinEngineering7(6): 805-814(1994) ;Roguska.等人，PNAS91:969-973(1994)。
[0089] 衍牛和标iP,的抗体
[0090] 本申请的抗体或抗原结合片段可以衍生出或连接有另一个功能分子（例如，另一 个肽或蛋白）。通常，抗体或抗原结合片段的衍生不会因为所述汀生或标记而对与本发明免 疫原性多肽的结合产生不利影响。
[0091] 例如，可以将本申请的抗体或抗体部分功能性连结（通过化学偶联，基因融合，非 共价结合或者相反）到一个或多个其他分子实体，比如另一个抗体（例如，双特异性抗体或 双价抗体），检测剂，细胞毒性剂，药物试剂，和/或可以调节所述抗体或抗原结合片段与另 一个分子（诸如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签）结合的蛋白或肽。此外，抗体或其 抗原结合部分可以是更大的免疫免疫粘附素分子的一部分，由所述抗体或抗体部分与一个 或多个其他或不同的蛋白或肽的共价或非共价结合形成。这种免疫粘附素分子的实例包括 使用链霉亲和素核心区制备四聚体的scFv(Kipriyanov等人（1995)HumanAntibodiesand Hybridomase:93-101)及使用半胱氨酸残基、标记物肽和C端多聚组氨酸标签制备二价和 生物素化的scFv分子（Kipriyanov等人（1994)MolecularImmunology31 :1047_1058)〇 可以利用常规技术，诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分别消化完整的抗体，来制备抗体部分，诸 如Fab和F(ab' )2片段。此外，可以利用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘 附素分子。
[0092] 可以通过交联两个或更多个抗体（相同类型或不同类型的，例如，以产生双特异 性抗体）来制备衍生抗体。合适的交联剂包括那些异型双功能的，具有被合适的间隔物 (例如间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯）分隔的两个不同活性基团，或是 同型双功能的（例如，辛二酸二琥泊酰亚胺酯）。这种接头由PierceChemicalCompany， Rockford，III提供。
[0093] 衍生抗体也可以是标记抗体。例如，从本发明抗体或抗体部分衍生出的检测剂是 荧光化合物，包括荧光素，异硫氰酸荧光素，若丹明，5-二甲胺-1-萘磺酰氯，藻红蛋白，镧 系荧光体等等。抗体还可以用酶（用于检测）标记，诸如辣根过氧化物酶，半乳糖苷酶，荧 光素酶，碱性磷酸酶，葡糖氧化酶等等。在用可检测的酶标记的实施方案中，通过添加其他 试剂（酶利用其产生可检测的反应产物）检测该抗体。例如，辣根过氧化物酶与过氧化氢 和二氨基联苯胺。抗体还可以用生物素标记，并通过抗生物素蛋白或链霉亲和素结合的间 接测量进行检测。抗体还可以标记有预先确定的多肽表位，该多肽表位被第二报告分子识 别（例如，亮氨酸拉链配对序列，第二抗体的结合位点，金属结合结构域，表位：标签）。抗 Nogo受体-1抗体或其抗原片段也可以标记有放射性标记的氨基酸。该放射性标记可用于 诊断和治疗两种目的。放射性标记的抗Nogo受体-1抗体可用于诊断，例如用于确定个体 的Nogo受体-1水平。此外，放射性标记的抗Nogo受体-1抗体可以治疗性的用于治疗脊 髓损伤。
[0094]多肽的标记物的实例包括，但不限于，下列放射性同位素或放射性核苷酸15N、35S、 9°y、99TC、mIn、125I、131I、mLu、166H〇、153Sm。抗Nogo受体-1抗体或其抗原片段还可以衍生有 化学基团诸如聚乙二醇（PEG)，甲基或乙基，或碳水化合物基团。这些基团可用于改进抗体 的生物学特性，例如，延长血清半衰期或增强组织结合。此外，多肽的标记物可以包括核酸， 例如用于PCR检测或增强基因表达的DNA，或在载有NgR的细胞或组织中抑制基因表达的 siRNA〇
[0095] 可以通过本领域已知的任何方法确定抗Nogo受体-1抗体的类型和亚类。通常， 利用对抗体的特定类型和亚类特异的抗体来确定抗体的类型和亚类。这类抗体是商品化提 供的。可以通过ELISA、WesternBlot以及其他技术确定类型和亚类。可选择地，可以通过 如下方法确定类型和亚类：对抗体重链和/或轻链恒定区的全部或一部分测序，将它们的 氨基酸序列与各种类型和亚类的免疫球蛋白的已知氨基酸序列进行比较，确定该抗体的类 型和亚类。
[0096] 抗NgR抗体对NgR活件的抑制
[0097] 本申请的抗Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段，抑制配体与NgR的结合。可以利 用本领域已知的任何方法，例如ELISA、RIA或功能性拮抗作用测量这种抑制的IC5。。IC5。可 以在0? 01到100nM之间变化。优选的，IC5。在1到10nM之间。更优选的，本发明的抗Nogo 受体-1抗体或其抗原结合片段的IC5。在0?InM到InM之间。最优选的，1C5。低于0?InM。
[0098] 双可夺域抗体
[0099] 本文使用的双可变域（DVD)结合蛋白是包括两个或更多个抗原结合位点的结合 蛋白，并且它们是四价或多价结合蛋白。术语"多价结合蛋白"在本说明书中使用时表示包 括两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白优选的被改造为具有3个或更多 个抗原结合位点，其通常不是天然存在的抗体。术语"多特异性结合蛋白"是指能够结合两 个或更多个相关或无关靶的结合蛋白。这种DVDs可以是单特异性的（即能够结合一种抗 原）或多特异性的（即能够结合两种或更多种抗原）。包括两条重链DVD多肽和两条轻链 DVD多肽的DVD结合蛋白被称为DVDIg。DVDIg的每一半包括一条重链DVD多肽，一条轻 链DVD多肽和两个抗原结合位点。每个结合位点包括一个重链可变域和一个轻链可变域， 每个抗原结合位点总共有6个CDRs参与抗原结合。DVD结合蛋白及制备DVD结合蛋白的 方法公开于美国专利申请号11/507, 050,其在此引入作为参考。本发明旨在包括能够结合 NgR的含有DVD结合蛋白的结合蛋白。优选的DVD结合蛋白能够结合NgR和第二靶标。所 述第二祀标选自斥性导向分子（repulsiveguidancemolecule，RGM)、Nogo_A、MAG、0Mgp、 CSPG。CSPG可以选自聚集蛋白聚糖，短蛋白聚糖，多功能蛋白聚糖，神经蛋白聚糖，憐酸聚糖 或Te38。因此，这些实例包括meylin来源的抑制剂，以及NgR的已知神经元共受体。
[0100] 双特异件抗体
[0101] 本申请还描述了"双特异性抗体"技术。双特异性抗体可以作为激动剂，拮抗剂，或 在不同的组合中作为激动剂和拮抗剂。本文使用的术语"激动剂"是指与不存在激动剂时观 察到的活性或功能相比，当接触感兴趣的分子时引起所述分子的某一活性或功能大小增加 的调节剂。本文使用的术语"拮抗剂"或"抑制剂"是指与不存在拮抗剂时观察到的活性或 功能相比，当接触感兴趣的分子时引起所述分子的某一活性或功能大小降低的调节剂。具 体的感兴趣的诘抗剂包括那些阻断或调节Nogo-66生物活性的诘抗剂。Nogo-66的诘抗剂 和抑制剂可能包括，但不限于任何分子，优选的是与Nogo-66受体（NgR)相互作用的单克隆 抗体。
[0102] 应当注意到与NgR的相互作用可能导致受体或其他配体/细胞膜组分的结合和中 和，从而可用于抗多种疾病的加强或协同功能。
[0103] 本申请还描述了与NgR共受体（像NgR和p75，NgR和TR0Y，NgR和LING0-1)结合 的NgR抗体。本申请还包括在NgR和其配体及NgR和髓磷脂来源的抑制因子之间交叉反应 的抗体。这些可以在NgR和RGM(repulsiveguidancemolecule)、NGR和Nogo_A、NGR和 獻6、呢1?和01^8、呢1?和03?6之间交叉反应的抗体。03?6可以选自聚集蛋白聚糖，短蛋白 聚糖，多功能蛋白聚糖，神经蛋白聚糖，磷酸聚糖或Te38。因此，这些实例包括meylin来源 的抑制剂，以及NgR的已知神经元共受体。
[0104] 本申请还描述了NgR和生长因子受体之间的双特异性抗体，包括但不限于，神 经生长因子（NGF)，脑源性神经营养因子（BDNF)，表皮生长因子（EGF)，粒细胞集落刺激 因子（G-CSF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)，神经营养素，血小板衍生生长因 子（PDGF)，红细胞生成素（EP0)，促血小板生成素（TP0)，筒箭毒碱（⑶F-8)，生长分化因 子-9 (GDF9)，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF或FGF2)，神经胶质源性神经营养性因子 (⑶NF)，睫状神经营养性因子（CNTF)。
[0105] 抗体的用涂
[0106] 考虑到本申请的中和抗体或其部分结合人NgR的能力，它们可以在常规免疫分析 (诸如酶联免疫吸附（ELISA)、放射免疫分析（RIA)或组织免疫组织化学）中用于检测人 NgR(例如，在生物样品中，诸如血清或血浆）。本申请提供一种检测生物样品中人NgR的方 法，包括将生物样品与本发明的抗体或抗体部分接触，并检测结合人NgR的抗体（或抗体部 分）或未结合的抗体（或抗体部分），从而检测所述生物样品中的人NgR。所述抗体用可检 测的物质直接或间接地标记，从而有利于结合或未结合抗体的检测。合适的可检测物质包 括各种酶，辅基，荧光物质，发光物质和放射性物质。合适酶的实例包括辣根过氧化酶，碱 性磷酸酶，beta-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉亲和素/ 生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光物质的实例包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光 素，若丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或者藻红蛋白；发光物质的实例包括氨基苯二 酰肼；和合适放射性物质的实例包括 3H、14C、35S、9°Y、99Tc、mIn、125I、131I、177Lu、166Ho、153Sm。
[0107] 优选的本申请的抗体和抗体部分在体外和体内均能够中和人NgR活性。因此，本 发明的这类抗体和抗体部分可用于抑制Nogo-66结合NgR或其引起的活性。
[0108] 在另一个实施方案中，本申请提供一种降低个体中Nogo-66活性或NgR活性的方 法，有利地个体患有的疾病或病症中NgR产生的活性是有害的。本申请提供降低患有这类 疾病或病症的个体中NgR活性的方法，所述方法包括给个体施用本申请的抗体或抗体部 分，这样的话所述个体中NgR活性被降低。优选的，所述NgR是人的，所述个体是人类个体。 此外，所述个体可以是表达能够结合本发明抗体的NgR的哺乳动物。此外，所述个体可以是 已经导入NgR的哺乳动物。为了治疗目的可以将本申请的抗体给人类个体施用。此外，为 了兽医学目的或作为人类疾病的动物模型，可以将本申请的抗体给表达能够结合所述抗体 的NgR的非人哺乳动物施用。对于后者，这种动物模型可用于评价本发明抗体的治疗效果 (例如，剂量和施用时程的试验）。
[0109] 本文使用的术语"NgR活性是有害的病症"旨在包括以下疾病和其他病症：患有所 述病症的个体中NgR的存在或其引起的活性已经被证明或被怀疑导致所述病症的病理生 理学或是导致所述病症恶化的因素。因此，NgR活性是有害的病症是如下所述的病症，其中 预期NgR活性的降低将缓解所述病症的症状和/或延缓其进展。可以用本发明抗体治疗的 病症的非限制性实例包括下面关于本发明抗体的药物组合物的部分描述的那些病症。
[0110] 已经证明NgR在与各种疾病有关的病理学中起着重要作用，所述疾病涉及与神经 变性或神经再生过程的抑制有关的神经疾病，导致瘫痪。该疾病包括肌萎缩侧索硬化，臂丛 损伤，脑损伤，包括外伤性脑损伤，脑瘫，脊髓小脑性共济失调，Guillain-Barr6综合征，脑 白质营养不良症，多发性硬化，脊髓灰质炎后（PostPolio)，脊柱裂，脊髓损伤，棘肌萎缩， 脊柱瘤，中风，横贯性脊髓炎。此外，已经证明NgR在以下疾病中起作用：痴呆，老年性痴呆， 轻度认知受损，阿尔茨海默尔相关痴呆，亨廷顿氏舞蹈病，迟发性运动障碍，痉挛，躁狂症， 帕金森氏病，唐氏综合征，重症肌无力。
[0111]NgR及其配体也可能参与涉及已知炎性元件的炎性或自身免疫性疾病的产生和 发展（Teng&Tang，2005 ;Fontoura&Steinmann，2006)。这些疾病包括，但不限于风湿性关 节炎，骨关节炎，青少年慢性关节炎，脓毒性关节炎，莱姆关节炎，牛皮癣关节炎，反应性 关节炎，脊椎关节病，全身性红斑狼疮，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，炎症性肠病，胰岛素 依赖型糖尿病，甲状腺炎，哮喘，变应性疾病，银肩病，皮炎硬皮病，移植抗宿主病，器官移 植排斥，与器官移植有关的急性或慢性免疫病，结节病，动脉粥样硬化，弥漫性血管内凝 血，川崎氏病，格雷夫氏病，肾病综合征，慢性疲劳综合征，眶坏死性肉芽肿病，过敏性紫癜 (Henoch-Schoenleinpurpurea)，肾微型血管炎，慢性活动型肝炎，葡萄膜炎，脓毒性休克， 中毒性休克综合征，败血综合征，恶病质，传染性疾病，寄生虫疾病，获得性免疫缺乏综合 症，急性横贯性脊髓炎，亨廷顿氏舞蹈病，帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，中风，原发性胆汁 性肝硬化，溶血性贫血，恶性肿瘤，心力衰竭，心肌梗死，艾迪生氏病，散发性I型多腺缺陷 和II型多腺缺陷，施密特氏综合征，成年（急性）呼吸窘迫综合征，