专利名称：人T2R受体hT2R50的新单体型及其在鉴定人苦味调节剂的测定法中的用途的制作方法
技术领域：
然而，尽管已有报道并理解T2R成员调控苦味，且它们可 能在胃肠功能中的起作用，但有需要鉴定活化人苦味T2R味觉受体的特 异性配体。更好地理解不同T2R (特别是人T2R)的结合特性将非常有 益，因为其将更好地促进其在选择具有预期味觉调节特性(即阻断或抑 制特异性苦味化合物的味道)的化合物中的用途。另外，它也将提供用 于治疗和调节胃肠功能和相关疾病(如肥胖症、糖尿病、食物吸收、食 物感受、进食障碍)，并调控相关激素和肽(如GLUT2、胆嚢收缩素等) 的化合物的鉴定。
发明内容
"T2R单体型"指见于不同个体的hT2R多肽的天然存在的 等位基因变体，如
图1所含hT2R50单体型及相应DNA。此类T2R单体 型可与早先报道的最初鉴定的hT2R多肽响应相同或不同的苦味配体。 例如， 一些单体型可参与一些个体品尝不同的苦味配体或与其它个体不 同地感知此类配体的能力。某些化学感受GPCR在拓朴学上具有"N-末端结构域"、"胞 外结构域"、包含七个跨膜区及相应胞质和胞外环的"跨膜结构域"、"胞 质区，，和"C-末端区，，(参见，例如Hoon等人，Cell, 96:541-51 ( 1999); Buck&Axel， Cell, 65:175-87 ( 1991 ))。使用本领域技术人员已知的方 法，如鉴定疏水性和亲水性结构域的序列分析程序(参见，例如Stryer， Biochemistry (生物化学)(第三版，1988);另请参见许多基于互联网的 序列分析程序，如见于dot.imgen.bcm.tmc.edu的那些中的任何一个)，可在结构上鉴定这些区域。可将这些区域用于制备嵌合蛋白，并用于本 发明的体外测定法(例如配体结合测定法)。本文所用术语"纯化的"、"基本纯化的"和"分离的"指不含天 然状态下一般与本发明的化合物结合的其它、不相似的化合物的状态。 "纯化的"、"基本纯化的"和"分离的，，优选指所述组合物以重量计包含至 少0.5%、 1%、 5%、 10%或20%，且最优选至少50%或75%重的给定 样品。在一个优选实施方案中，这些术语指以重量计包含至少95%重的 给定样品的本发明的化合物。当指核酸或蛋白时，本文所用术语"纯化 的"、"基本纯化的"和"分离的"核酸或蛋白也指不同于哺乳动物(尤其是 人)身体中天然存在的纯化或浓缩状态。任何大于所述哺乳动物(尤其 是人)身体中天然存在的纯化或浓缩程度，包括(1)从其它结合的结构或化合物中纯化，或(2)与在哺乳动物(尤其是人)身体中一般不结合 的结构或化合物结合亦在"分离的，，的含义内。可根据本领域技术人员已 知的多种方法和程序分离本文所述核酸或蛋白或所述类别的核酸或蛋 白，或将它们与天然状态下一般不与它们结合的结构或化合物结合。术语"文库，，指为不同核酸或多肽分子的混合物的制品，如用 简并引物对扩增核酸或包括扩增的配体结合区的载体的分离收集而产生 的重组产生的感觉(特别是味觉)受体配体结合区的文库，或用至少一 种编码味觉受体的载体各自随机转染的细胞的混合物。对于是保守变体的本发明的多肽，常规实验即确定模拟物是 否在本发明范围内，即其结构和/或功能未被实质性改变。多肽模拟物组
19合物可含非天然结构组件的任意组合，其一般来自三个结构組a)不是 天然酰胺键("肽键")连接的残基连接组；b)非天然残基取代天然存在 的氨基酸残基；或c)诱导二级结构模拟(即诱导或稳定二级结构(例如 P转角、y转角、p折叠、a螺旋构象等))的残基。当多肽的所有或一些 残基通过不是天然肽键的化学方式连接时，可将其表征为模拟物。个别 的肽模拟物残基可通过肽键、其它化学键或偶联方式(如，例如戊二醛、 N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N，N'-二环己基碳二亚胺 (DCC)或N，N，-二异丙基碳二亚胺(DIC))连接。可替代传统酰胺键 ("肽键")连接的连接基团包括，例如酮亚甲基(例如-C(，-.O)--CH2 替代一C(.-O)--NH—)、氨亚甲基(CH2NH )、乙烯、烯烃(CH.dbd.CH )、 醚(CH20 )、硫醚(CH2—S )、四唑(CN4 )、噢唑、逆酰胺(retroamide )、 石l/f戈酰胺或酉旨(参见，，W口 Spatola， Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins,第7巻，267-357， Marcell Dekker， Peptide Backbone Modifications, NY ( 1983 ))。还可将含取代了所有或一些天 然存在的氨基酸残基的被非天然残基的多肽表征为模拟物；非天然残基 在科学和专利文献中已有详细描述。"经标记的核酸探针或寡核苷酸"是通过连接体或化学键共 价结合，或通过离子键、范德华键、静电键或氢键非共价结合标记物， 从而可通过检测出结合到所述探针的标记物的存在情况来检测所述探针 的存在情况的核酸探针或寡核苷酸。
0073本文所用"核酸探针或寡核苷酸"的定义是能够通过一种或 多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氬键形成，结合 具有互补序列的靶核酸的核酸。本文所用探针可包括天然(即A、 G、 C 或T)或经修饰碱基(7-脱氮鸟苷、次黄苷等)。此外，探针中的碱基可通过不是磷酸二酯键的连接而连接，只要其不干扰杂交。因此，例如， 探针可为肽核酸，其中作为组成的碱基通过肽键，而非磷酸二酯连接连 接。本领域技术人员应理解，探针可依赖于杂交条件的严格性而与所述 探针序列缺乏完全互补性的靶序列结合。所述探针任选用同位素、发色 团、发光团、色原进行直接标记，或用如生物素进行间接标记(随后可 将链霉亲和素复合体结合至所述生物素)。本领域技术人员可通过测定所 述探针的有无来检测所选序列或子序列的有无。基于前述内容，本发明提供用于鉴定调节(优选阻断) hT2R50的新单体型和先前鉴定的人苦味受体hT2R50被苦味化合物(即 吡溱和结构上相关的化合物)的特异性活化的化合物的测定法。本发明 尤其提供用于鉴定调节(例如阻断)hT2R50及其单体型被苦味配体的活 化的化合物的基于细胞的测定法。预期这些化合物将在人受验者中调节与hT2R50和其它潜在T2R味觉受体相关的苦味。这可在味觉试验中确 认。另外，这些核酸也可通过公知的化学合成技术在体外合成， 参见,例如 Carruthers, Cold Spring Harbor Symp. Quant. ■ Biol. 47:411-18(1982); Adams, Am. Chem. Soc.， 105:661 ( 1983 ); Belo脂v， Nucleic Acids Res. 25:3440-3444 (1997); Frenkel， Free Radic. Biol. Med. 19:373-380 ( 1995 ); Blommers， Biochemistry 33:7886-7896 ( 1994 ); Narang, Meth. Enzymol. 68:90 (1979 ); Biwn， Meth. Enzymol. 68:109
(1979 ); Beaucage， Tetra. Lett 22:1859( 1981 );美国专利No. 4,458,066。 然后可通过合成互补链并在适当的条件下将所述链退火在一起，或通过 使用DNA聚合酶和适当的引物序列添加互补链来获得双链DNA片段。合成寡核苷酸引物对的方法是本领域公知的。可使用"天然 的"碱基对或合成的碱基对。例如，使用人工核碱基提供了操作引物序列 和产生更复杂的扩增产物混合物的通用方法。各种家族的人工核碱基能 够通过内部键旋转推定多个氬键键合方向，以提供简并分子识别的方法。 将这些类似物并入PCR引物的单个位置允许产生复杂的扩增产物文库。 参见，例如Hoops， Nucleic Acids Res.， 25:4866-71 ( 1997)。还可使用 非极性分子模拟天然DNA碱基的形状。腺嘌呤的非氢键键合形状模拟物 可有效并选择性针对胸腺嘧啶的非极性形状模拟物进行复制(参见，例 如Morales, Nat. Struct. Biol.， 5:950-54 ( 1998))。例如，两个简并碱基 可为嘧咬碱基6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-cj[l，2j噁溱-7-酮或嘌呤碱基
N-6-曱氧基-2，6-二氨基嘌呤(参见，例如，Hill, PNAS, 95:4258-63( 1998 ))。 本发明的示例性简并引物包括核碱基类似物5'-二曱氧基三苯甲基-N-苯 曱酰基-2'-脱氧-胞苷、3'-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)卜亚磷酰胺(序列中 的术语"P",参见上文)。此嗜啶类似物与嘌呤形成包括A和G残基的氢含于转位结构域(用于有效的质膜表达)和其余新翻译多肽 之间的可切割的连接体序列(如因子Xa (参见，例如Ottavi， Biochimie， 80:289-93( 1998 ))、枯草杆菌蛋白酶蛋白酶识别基序(参见，例如Polyak, Protein Eng.， 10:615-19( 1997));肠激酶(Invitrogen, San Diego, Calif.) 等可用于促进纯化。例如， 一个构建体可包括连接到六组氨酸残基的编 码多肽的核酸序列，接着是疏氧还蛋白、肠激酶切割位点(参见，例如， Williams, Biochemistry, 34:1787-97 ( 1995 ))和C-末端转位结构域。 所述组氨酸残基促进检测和純化，而所述肠激酶切割位点提供从所述融 合蛋白的剩余部分純化所需蛋白的手段。关于编码融合蛋白的载体的技 术和融合蛋白的应用在科学和专利文献中已有详细描述(参见，例如， Kroll、 DNA Cell, Biol，. 12:441-53 (1993 ))。包含配体结合区编码序列的表达载体(无论是作为单个表达 栽体还是作为表达栽体的文库)可被导入基因组或导入细胞质或细胞的 核，并可通过科学和专利文献中已有详细描述的多种常规技术进行表达。 参见，例如Roberts, Nature, 328:731( 1987); Berger,见上；Schneider, Protein Exper. Purif.， 6435:10 (1995); Sambrook; Tijssen; Ausubel。 来自生物试剂和实验设备制造商的产品信息也提供有关已知的生物学方 法的信息。所述载体可为从天然来源分离的，从如ATCC或GenBank 文库的来源获得或通过合成或重组方法制备的。
核酸可为在细胞中稳定或瞬时表达(例如游离表达系统)的 表达盒、栽体或病毒中进行表达。可将筛选标记物并入表达盒和载体中， 以赋予转化细胞和序列可选择的表型。例如，筛选标记物可编码游离维 持和复制，从而无需整合至宿主基因组。例如所述标记物可编码抗生素 抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗 性(例如绿磺隆(chlorosulfuron )或草丁膦(Basta))，以允许选择那些 经所需DNA序列转化的细胞(参见，例如Bkmdelet-Rouault， Gene， 跳.315-17 ( 1997); Aubrecht， J. Pharmacol. Exp. Ther.， 281:992-97 (1997 ))。因为赋予底物(如新霉素或潮霉素)抗性的可选择标记物基 因仅可用于组织培养，所以也将化学抗性基因用作体外和体内的选择标 记物。本发明的范围还包括用于表达本发明的T2R、片段或变体的 宿主细胞。为获得克隆的基因或核酸(如编码本发明的T2R、片段或变 体的cDNA)的高水平表达，技术人员通常将感兴趣的核酸序列亚克隆 至表达载体，所#达载体含指导转录的强启动子、转录/翻译终止子， 和用于翻译起始的核糖体结合位点(如果是编码蛋白的核酸)。合适的细 菌启动子是本领域^^知的，参见例如Sambrook等人。但可使用细菌或 真核表达系统。已将体外结合测定法用于其它GPCR，如代谢型谷氨酸受体 (参见，例如Han和Hampson， J. Biol. Chem. 274:10008-10013( 1999 ))。 这些测定法可能包括替换经放射性或荧光标记的配体，测量内在荧光的 变化或蛋白水解易感性的变化等。在另一个实施方案中，可使用基于荧光偏振("FP")的测
35定法检测和监控配体结合。荧光偏振是测量平衡结合、核酸杂交和酶活 性的通用实验室技术。荧光偏振测定法的相同之处在于它们不需要分离 步骤，如离心、过滤、色谦、沉淀或电泳。这些测定是实时、直接在溶 液中进行的，且不需要固定相。偏振值可重复测量，且可在加入试剂后 测量，因为测量偏振很快，且不损坏样品。 一般而言，此技术可用于测 量从低的皮摩尔至微摩尔水平的荧光团的偏振值。此节描述了如何可使
用荧光偏振以简单和定量的方式测量配体与本发明的T2R多肽的结合。
旋转弛豫时间对小分子(例如荧光素)小(大约等于1纳秒)， 而对大分子(例如免疫球蛋白)大(大约等于100纳秒)。如果粘度和温度保持恒定，则旋转弛豫时间和由此偏振与分子体积直接相关。分子体 积的改变可能是由于与其它分子的相互作用、离解、聚合、降解、杂交 或经荧光标记的分子的构象变化。例如荧光偏振已被用于测量蛋白酶、
DNA酶和RNA酶对大的经焚光素标记的聚合物的酶切。它还^皮用于测 量蛋白/蛋白相互作用、抗体/抗原结合和蛋白/DNA结合的平衡结合。 [0143A.固态和溶态高通量测定法合成的聚合物(如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、 聚乙烯亚胺、聚芳硫醚(polyarylene sulfides )、聚硅氧烷、聚酰亚胺和 聚乙酸酯(polyacetate ))也可形成适当的标签或标签结合物。本领域技 术人员可通过阅读本公开明晰，许多其它标签/标签结合物对也用于本文 所述测定系统。在另一个实施方案中，可测量转录水平以评估被测化合物对 信号转导的效应。含感兴趣的T2R多肽的宿主细胞与被测化合物接触充 分的时间，以实现任何相互作用，然后测量基因表达的水平。实现此类 相互作用的时间量可根据经验确定，如通过运行时间过程并将转录水平 作为时间函数进行测量。可通过使用本领域的技术人员已知合适的任何 方法测量转录量。例如，可使用RNA印记法检测感兴趣的蛋白的mRNA 表达，或可使用免疫测定法鉴定它们的多肽产物。可选地，可用使用报 告基因的基于转录的测定法，参见美国专利No. 5,436,128 (通过引用并 入本文)。所述报告基因可为例如氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、P-半乳 糖普酶、P-内酰胺酶和碱性磷酸酶。此外，可通过将感兴趣的蛋白附着 到第二报告分子(如绿色荧光蛋白)而用作间接报告分子(参见，例如 Mistili & Spector, Nature Biotechnology, 15:961-964 ( 1997 ))。"敲除"细胞和动物的构建基于如下前提通过向基因组导入 新的DNA序列(其发挥中断待抑制基因的DNA序列的某个部分的作 用)，特定基因在哺乳动物细胞中的表达水平可被降低或完全消除。另夕卜， "基因包载插入(gene trap insertion)"可用于破坏宿主基因，且小鼠胚 胎干(ES)细胞可用于产生敲除转基因动物(参见，例如Holzschu， Transgenic Res 6:97-106 ( 1997))。 一般通过互补核酸序列之间的同源重 组插入外源物。所述外源序列是待修饰的靶基因的某个部分，如外显子、 内含子或转录调控序列或能够影响靶基因的表达水平的任何基因组序 列，或它们的组合。多能胚胎干细胞中通过同源重组的基因打乾允许技 术人员精确修饰感兴趣的基因组序列。可使用任何技术以产生、筛选、 繁殖敲除动物，例如参见Bijvoet， Hum. Mol. Genet. 7:53-62 (1998 ); Meredith, J. Mol. Med. 75:208-216 ( 1997 ); Tojo， Cytotechnology 19:161-165 ( 1995); Mudgett， Methods Mol. Biol. 48:167-184 ( 1995 );
43Longo， Transgenic Res. 6:321-328 ( 1997);美国专利No. 5，616，491; 5,464,764; 5，631，153; 5，487，992; 5,627,059; 5,272,071; WO 91/09955; WO 93/09222; WO 96/29411; WO 95/31560; WO 91/12650。
01711本发明的核酸还可用作产生"敲除"人细胞及其后代的试剂。 同样地，本发明的核酸还可用作在小鼠中产生"敲入，，的试剂。人或大鼠 T2R基因序列可替换小鼠基因组中的T2R直向同源物。这样就产生了表 达人或大鼠T2R的小鼠。此小鼠然后可用于分析人或大鼠T2R的功能， 并鉴定此类T2R的配体。
调节剂在一个实施方案中，高通量筛选方法包括提供含大量潜在的 治疗性化合物(潜在的调节剂或配体化合物)的组合化合物或肽文库。 然后如本文所述在一个或多个测定中筛选此"组合化学文库"或"配体文 库"，以鉴定那些表现出所需特征性活性的文库成员(特定的化合物种类 或亚类)。由此经鉴定化合物可充当常规的"先导化合物"或其自身可用作 潜在的或实际的消费产品。图1和权利要求书前的序列表中含本文鉴定的新hT2R50单 体型的核苷酸和蛋白序列。从中可看出，图1所含较长(单体型)形式 的hT2R50蛋白(称为hT2R50L)比最初鉴定的hT2R50等位基因(这些残基用加粗和下划线表示)多出IO个氨基酸，如图2所示，与最初报 道的单体型(hT2R50)相比，所述10个氨基酸被添加到其C-末端。
[01881如图2所示，hT2R50L的延长的C-末端序列与其它近缘 hT2R (如hT2R61、 64，和75 )高度同源或相同。迄今获得的遗传分析提 示hT2R50L等位基因的相对频率估计是46%。这是基于发明人的来自 24个体(其中约50%为欧洲血统和50°/。为亚洲血统)的测序数据。
[0189j使用下文描述的体外测定，我们发现hT2R50单体型识别并 响应2种结构上相关的苦味分子(2-乙酰吡嗪和乙基吡嗪)。这些结果显 示于图3。在约5mM的浓度下，这两种吡嗪化合物均被人品尝为苦味。 相同的体外测定显示短和长形式的hT2R50均可响应所述苦味分子，而 近缘的hT2R75和61却显示无响应(图4 )。
hT2R50测定条件
[0190本文新hT2R50单体型及其它hT2R的活化是在检测胞内钙 浓度的变化的基于细胞的测定中测量的。简言之，将人胚胎肾细胞接种 于48孔组织培养板中。24小时后，用含hT2R50单体型或另一个hT2R 核酸序列的质粒和含嵌合G蛋白(G16gust44)的质粒瞬时转染所述细 胞。再过24小时后，将所述细胞与钙特异性荧光染料(Fluo-4; Molecular Probes)温育，所述染料提供用于检测细胞内钓浓度的变化的快速、简 单和可靠的基于荧光的方法。T2R活化引起信号级联，其导致PLC活化 和随后的胞内钙浓度升高。此4丐浓度升高改变了细胞内钙染料的荧光性 质。使用荧光显微术监控这些变化。
序列表
视紫质转位结构域的蛋白序列(SEQIDNO: 1) MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV
hT2R50L的DNA和蛋白序列(SEQ ID NO: 2 )
48编码DNA序列atgataacttttctgcccatcatattttccattctagtagtggttacatttgttattggaaattttgctaatggcttcatagcgttggtaaattccaccgagtgggtgaagagacaaaagatctcctttgctgaccaaattgtcactgctctggcggtctccagagttggtttgctctgggtgttattattaaattggtattcaactgtgttgaatccagctttttgtagtgtagaattaagaactactgcttataatatctgggcagtaaccggccatttcagcaactggcctgctactagcctcagcatattttatttgctcaagattgccaatttctccaaccttatttttcttcgcttaaagaggagagttaagagtgtcattctggtgatgctgttggggcctttgctatttttggcttgtcatctttttgtggtaaacatgaatcagattgtatggacaaaagaatatgaaggaaacatgacttggaagatcaaattgaggcgtgcaatgtacctttcagatacgactgtaaccatgctagcaaacttagtaccctttactgtaaccctgatatcttttctgctgttagtctgttctctgtgtaaacatctcaagaagatgcacctccatggcaaaggatctcaagatcccagtaccaaggtccacataaaagttttgcaaactgtgatctccttcctcttgttatgtgccatttactttgtgtctgtaataatatcagtttggagttttaagaatctggaaaacaaacctgtcttcatgttctgccaagctattggattcagctgttcttcagcccacccgttcatcctgatttggggaaacaagaagctaaagcagacttatctttcagttttgtggcaaatgacgtactgggtgaaagga gagaagccttcatctccataghT2R50单体型蛋白序列(SEQ ID NO: 3)mitflpiif—silVwtfvignfangfialv^stewvkrqkisfadqivtalavsrvgllwvlllnwystvlnpafcsvelrttayniwavtghfsnwpatslsifyllkianfsnliflrlkrrvksvilvmllgpllflachlfvvnmnqivwtkeyeg醒twkiklrramylsdttvtmlanlvpftvtlisflllvcslckhlk腿hlhgkgsqdpstkvhikvlqtvisflllcaiyfvsviisvwsfknlenkpvfmfcqaigfscssahpfiliwgnkklkqtylsvlwqmtywvkgekpssphT2R C-末端序列的比对hT2R50-KLKQTYLSVLWQMRY终止(SEOIDNO: 4) hT2R50L" KLKQTYLSVLWQMTYWVKGEKPSSP终止(SEQ ID NO: 5)hT2R61 — KLKQTFLSVFWQMRYWVKGEKTSSP ( SEQ ID NO: 6)hT2R64 - KLKQTFLSVLRQVRYWVKGEKPSSP ( SEQ ID NO: 7)hT2R75 - KLKQTFLSVLWHVRYWVKGEKPSSS ( SEQ IDNO: 8)虽然本说明书已描述了本发明的几个实施方案，但应理解，以上描 述仅是例证性的，并不限制所公开的发明。本发明仅受下列权利要求的 限制。
权利要求
1. 编码苦味受体hT2R50单体型的核酸序列或其变体，所述核酸序列编码具有SEQ ID NO3所含序列的T2R多肽序列，所述变体编码与所述T2R多肽序列具有至少90％序列同一性且在其羧基末端含与SEQID NO3所含hT2R50多肽相同的10个氨基酸的T2R多肽。
2. 核酸序列，其编码SEQIDNO: 3所含多肽。
3. 权利要求2的核酸序列，其包含SEQIDNO: 2所含核酸序列。
4. 表达载体，其含权利要求l的核酸序列。
5. 表达载体，其含权利要求2的核酸序列。
6. 表达栽体，其含权利要求3的核酸序列。
7. 细胞，含权利要求l中任一项的表达载体。
8. 权利要求7的细胞，^选自哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞 和两栖动物卵母细胞。
9. 权利要求8的哺乳动物细胞，其选自HEK-293细胞、HEK-293T 细月包、CHO细月包、Cos细月包和BHK细月包。
10. 权利要求9的哺乳动物细胞，其是HEK-293细胞。
11. 权利要求8的细胞，其还表达与所述hT2R多肽功能相关的G 蛋白。
12. 权利要求ll的细胞，其中所述G蛋白选自Gal6、 Gal6、味转 导素、转导蛋白或包含其部分的嵌合G蛋白。
13. 包含hT2R50单体型的多肽或其变体，所述多肽具有SEQID NO: 3所含多肽序列，所述变体与所述多肽具有至少卯％序列同一性且 特异性响应2-乙酰吡溱或乙基吡溱。
14. 权利要求13的多肽，其包含SEQIDNO: 3所含序列。
15. 测定法，其用于鉴定调节特异性响应2-乙酰吡唤或乙基吡溱的 人hT2R50苦味受体的化合物，所述受体选自SEQ ID NO: 3所含hT2R50 单体型多肽、或与所述hT2R50单体型具有相同的氨基酸序列但缺乏最 后10个羧基氨基酸的hT2R50多肽、或与所述序列具有至少90%序列同一性且特异性响应2-乙酰吡，秦或乙基吡，秦的hT2R50多肽变体，所述测 定法包括i. 筛选作用于2-乙酰吡嗪或乙基吡嗪或在结构上相关并诱导所述 hT2R多肽的活化的化合物，和ii. 确定所述化合物是否基于其对所述受体被所述吡溱或结构上相 关的化合物活化的作用而调节hT2R50相关的苦味。
16. 权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体在分离的细 胞膜中表达。
17. 权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体在完整的细 胞中表达。
18. 权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体在真核细胞 中表达。
19. 权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体由两栖动物、 哺乳动物或昆虫细胞表达。
20. 权利要求15的测定法，其中所述味觉受体在选自HEK293、 BHK、 COS、 HEK293T、 CHO和爪蟾卵母细胞的细胞中表达。
21. 权利要求15的测定法，其是荧光测定法。
22. 权利要求15的测定法，其是结合测定法。
23. 权利要求15的测定法，其通过测定所述化合物对胞内离子浓度 的作用来检测对所述化合物的作用。
24. 权利要求23的测定法，其检测所述化合物对胞内钠或4丐的作用。
25. 权利要求15的测定法，其检测所述化合物对细胞膜电位的作用。
26. 权利要求15的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体转录 的作用。
27. 权利要求15的测定法，其中所述化合物是根据其阻断所述吡溱 化合物对所述hT2R50味觉受体的活化或与其相互作用的能力筛选的。
28. 4又利要求15的测定法，其检测所述化合物对胞内cAMP、 cGMP 或IP3的作用。
29. 权利要求15的测定法，其中所述hT2R味觉受体包含所述hT2R味觉受体的胞外结构域或跨膜区。
30. 权利要求15的测定法，其中所述测定法使用钙特异性荧光染料 检测钓的变化。
31. 库又利要求15的测定法，其中所述测定法^使用选自Fluo-3、 Fhio-4 和Fura-2的染料检测胞内钾的变化。
32. 权利要求15的测定法，其中所述味觉受体是在溶液中。
33. 权利要求15的测定法，其是检测光谱特征、流体动力学特征或 溶解度的变化的结合测定法。
34. 权利要求15的测定法，其检测所述化合物对所述hT2R50味觉 受体与G蛋白的复合的作用。
35. 权利要求15的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与选自转导蛋白、味转导素、Gw5和Goa6的G蛋白的复合的作用。
36. 权利要求15的测定法，其是荧光偏振测定法。
37. 权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体多肽附着于 固相基质。
38. 权利要求15的测定法，其是高通量测定法。
39. 权利要求15的测定法，其中所述hT2R50味觉受体多肽由 HEK293细胞表达。
40. 权利要求30的测定法，其中所述测定法使用选自Fluo-3、 Fluo-4 和Fura-2的染料检测胞内4丐的变化。
41. 权利要求30的测定法，其中所述味觉受体是在溶液中。
42. 权利要求30的测定法，其是检测光镨特征、流体动力学特征或 溶解度的变化的结合测定法。
43. 权利要求30的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与G 蛋白的复合的作用。
44. 权利要求30的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与选自转导蛋白、味转导素、Gw5和Ga,6的G蛋白的复合的作用。
45. 权利要求30的测定法，其是荧光偏振测定法。
46. 权利要求30的测定法，其中所述味觉受体附着于固相基质。
47. 权利要求30的测定法，其是高通量测定法。
48. 权利要求30的测定法，其中所述味觉受体由HEK293细胞表达。
49. 分离的味觉或胃肠细胞，其表达具有在严格杂交条件下与SEQ ID NO: 2所含DNA序列特异性杂交的核酸序列的T2R单体型多肽，且 所述T2R单体型多肽结合于特异性地与SEQ ID NO: 3所含T2R50单 体型肽相结合的苦味配体。
50. 权利要求49的分离的味觉或胃肠细胞，其中所述细胞包含SEQ ID: NO: 2所含DNA序列。
51. 鉴定调节人T2R50单体型多肽的活性的化合物的方法，所述方 法包括使权利要求49或50的味觉或胃肠细胞与潜在的T2R调节化合物T2R的活性，和/或通过另一种化合物影响所述人T2R的特异性结合或 活化。
52. 筛选具有T2R50单体型的个体的方法，所述方法包括对个体进 行基因检测，并测定所述个体是否包含SEQ ID NO: 2所含hT2R50序列。
53. 篩选测定法，其包括使表达如SEQ ID NO: 3所示的hT2R50 单体型多肽序列的细胞与推定的调节化合物接触，并检测调节所述 T2R50单体型的活性的化合物。
54. 检测与T2R50单体型表达相关的差异的方法，所述方法包括鉴 定特异性结合和/或活化hT2R50但不特异性结合和/或活化其他hT2R50 单体型的化合物。
55. T2R配体筛选测定法，所述测定法包括接触表达SEQIDNO: 3所含任一种hT2R50单体型多肽的细胞，并鉴定特异性活化所述 hT2R50序列的化合物。
56. 权利要求55的测定法，所述测定法进一步包括检验所述配体对 涉及舌或胃肠系统中表达T2R的细胞的味觉和/或胃肠或消化功能的作 用。
全文摘要
本发明涉及T2R味觉受体家族中响应特定苦味配体即2-乙酰吡嗪和乙基吡嗪的人味觉受体hT2R50的新单体型的发现。本发明还涉及此新单体型在用于鉴定调节hT2R50味觉受体活化的配体的测定中的用途。这些化合物潜在地可用作食品、饮料和药品中的添加剂，以改变(阻断)hT2R50相关的苦味。
文档编号C07H21/04GK101522702SQ200780038215
公开日2009年9月2日 申请日期2007年9月5日 优先权日2006年9月5日
发明者A·普洛宁, 宏 徐, 李晓东 申请人:塞诺米克斯公司