专利名称：新受体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基本纯的形式的新受体，该受体的可溶形式及其作为治疗剂的应用，筛选用于通过与受体相互作用而治疗疾病的化合物的方法，以及通过实施这种筛选方法发现的新化合物；涉及重组受体及其在这种筛选方法中的应用；涉及结合于该受体的单克隆和多克隆抗体的制备；涉及这种抗体作为治疗剂的应用以及确定结合于该受体的治疗剂有效性的方法。
WO 92\22293(Smithkline Beechamplc)描述了一族化合物，它们通过行为模型显示具有某些CNS活性，特别是在癫痫的治疗和/或预防中。描述了上述专利申请的这种化合物的一个实例为反式-(+)-6-乙酰-4S-(4-氟苯并氨基-3，4-二氢-2，2-二甲基-2H-1-苯并吡喃-3R-醇。(下文中称为化合物A)。
WO\94\13656，WO\94\13657，WO\94\13292，WO\94\13297，PCT\EP\95\02076，PCT\EP\95\02249和PCT\EP\95\02246都描述了具有某些中枢神经系统(CNS)活性的其它化合物，特别是PCT\EP\95\02076中描述了本申请实施例4中的“冷却”化合物，即化合物B。
上述专利中描述的化合物不结合任何已知受体，并且现在已鉴定出一种这种化合物结合的新受体。
相应地，本发明提供了一种获自大鼠前脑组织的基本纯的受体，其特征在于a)对于大鼠前脑组织，化合物A以Kd 40nM与其结合，b)对于大鼠前脑组织，化合物A以Bmax220pmol/g蛋白与其结合，c)对于大鼠前脑组织，化合物B以Kd 2nM与其结合，d)对于大鼠前脑组织，化合物B以Bmax220pmol/g蛋白与其结合，和与大鼠前脑组织享有至少85％同源性的来自其它来源的同源受体。
其它已知的抗惊厥化合物包括安定，苯妥英，戊巴比通，丙戊酸钠，氨甲酰苯，Vigabotvin lamotrigine，乙琥胺和gabapeutin不与新受体结合。
另外，新受体可在人类和啮齿动物成神经细胞瘤和神经胶质瘤细胞培养物中发现。它们可不经制备直接使用或通过与大脑组织相同的方法制备。在人类成神经细胞瘤细胞系如SHSYSY或IMR 32中，化合物B可以Kd为2nM和Bmnax为150pmol/g蛋白结合于新受体。
新受体通过常规技术以基本纯的形式分离。例如，含新受体(如上面所述的)的组织的等分试样(如含1至10mg蛋白/ml)与放射标记的(如125I)光亲合标记化合物(如实施例6的化合物C)混合。优选光亲合标记化合物在混合物中的终浓度是0.1至1000pM。该混合物适宜在室温下温育1小时。然后将该混合物暴露于紫外线(如来自6W灯的366nm)30分钟。随后通过离心活组织以去除未结合的光亲合标记化合物。光亲合标记的受体可通过凝胶渗透色谱法(例如使用Superose 6)在非还原条件下从其它蛋白初步分离。然后按照Bensadoun和Weinstein(Bensadoun A，和Weinstein D(1976)分析生物化学70，241-250)的方法将含受体的级分通过三氯乙酸沉淀。此蛋白级分通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进一步分离，在还原条件下，6％(w/v)棒凝胶覆盖以5％(w/v)积层凝胶，或垂直10％(w/v)，或4-20％(w/v)梯度，板凝胶可被使用，基于Laemmli(见Lacmmli英国(1970)自然，227，680-685)的方法。受体的进一步提纯可通过在固定pH梯度聚丙烯酰胺凝胶中对通过制备性SDS-PAGE制备的材料进行等电点聚焦(IEF)而获得。
受体的分子量当通过凝胶电泳(SDS-PAGE)分析时是在130KD范围内。
本发明的第二方面提供了上述受体的可溶形式。
所述受体的可溶形式可按照常规技术制备。
所述受体的这种可溶形式据信具有治疗学用途，因而本发明延伸至使用所述受体的可溶形式作为一种治疗学制剂。
本发明还延伸至所述受体的可溶形式在药物制造中的应用，这种药物用于治疗和/或预防焦虑、躁狂，抑郁、与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应，用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血。
本发明还延伸至治疗和/或预防焦虑、躁狂，抑郁、与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应，用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血的方法，该方法包含向需要此种治疗的患者施用有效量或预防量的可溶性受体。
本发明还延伸至一种药物组合物，该药物组合物包含与药物学上可接受的载体混合的可溶性受体。这种药物组合物可用于治疗和/或预防焦虑、躁狂，抑郁、与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应，用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血。
这种药物组合物和载体在本领域中是公知的，并可通过常规技术制备。
在本发明的第三方面提供了一种筛选具有与结合所述受体相关的治疗活性的化合物的方法，它包含将待测化合物与含有新受体的物质接触并测定结合的程度。
含有新受体的物质包含但不限于来自大鼠、人类、狨、狗、猫和小鼠的脑组织。这种脑组织适合在缓冲的水性介质如5至50mM HEPES，pH 7.4 Tris/HCl缓冲液中被匀浆。被匀浆的组织可通过离心和重悬被洗涤。从这些组织制备的亚细胞级分可被使用。
被测化合物与含有新受体的物质能接触可通过将含新受体(如上所述)的组织的等分试样(如含1至10mg蛋白/ml)与放射标记的(如用3H或125I)待测化合物混合而进行。优选待测化合物在混合物中的终浓度为0.1至1000nM，更优选1至50nM。
该混合物适合在环境温度温育1小时。未结合的被测化合物随后通过滤过从结合的被测化合物分离。这可使用Whatman玻璃纤维滤膜优选GF/B或GF/C型进行。该滤膜适合用冰冷的缓冲介质(优选在组织制备中使用的类型)洗涤。
在滤器上捕获的结合于组织的放射性量可通过向滤膜加入液体闪烁剂后在液体闪烁计数仪中计数(用于3H)或通过在γ计数仪中直接对滤器计数(用于125I)而测定。
另外，当使用粘附于培养板的完整细胞时，未结合的被测化合物与结合的被测化合物的分离可通过用冰冷的缓冲介质洗涤细胞，随后在氢氧化钠溶液中溶解细胞并在液体闪烁计数仪或γ计数仪中计数，如上所述。
被测化合物的放射标记使用常规技术进行。
另外，使用常规技术，可通过测定已知结合于受体如化合物(A)和(B)的其它前述专利或申请提及或包含的化合物的放射标记化合物的置换量来确定非放射标记的测定化合物的结合亲合力。
应认识到，结合于受体并可使用这种筛选方法置换的放射标记化合物是新的并且构成本发明和另一方面。
筛选方法中使用重组受体是有用的，这种重组受体可通过常规技术制备。
例如，分离新的人类受体编码核酸的一种方法是使用本领域公认的方法(参见“分子生物学流行方法”Ausubel.F.M等(编).Creene出版社和John Wiley Interscieuce，纽约，1989，1992)用自然的或人工设计的探针探查人类基因组或cDNA文库。所获得的分离核酸分子可用于获得来自人类，哺乳类或其它动物来源的基因组DNA，cDNA或RNA的互补拷贝；或用于筛查这些来源以寻找相关序列，包括上述转录调节和控制元件以及来自相对于编码序列的5′和/或3′区的其它稳定，加工，翻译和组织特异性决定区。
本发明的蛋白优选通过重组基因工程技术制造。分离的核酸特别是DNA可通过可操作地连接DNA至基团表达所需表达控制区(如，调节区)而导入表达载体。该载体可通过本领域公知的方法(Ausubel等，上文)导入适当的宿主细胞如原核(例如细菌)，或真核(例如，酵母，昆虫或哺乳类)细胞中。已经制备或分离的所需蛋白的编码序列，可克隆入适当的载体或复制子。许多克隆载体是本领域技术人员公知的，适当克隆载体的选取只是一个选择的问题。用于克隆的重组DNA载体和它们可转化的宿主细胞的实例包括噬菌体λ(大肠杆菌)，pBR322(大肠杆菌)，pACYC177(大肠杆菌)，pKT230(革兰氏阴性细胞)，pGV1106(革兰氏阴性细胞)，pLAFR1(革兰氏阴性细菌)，pME290(非大肠杆菌的革兰氏阴性细胞)，pHV14(大肠杆菌和枯草杆菌)，pBD9(杆菌)，pIJ61(链霉菌)，pUC6(链霉菌)，YIp5(酵母菌)，一种杆状病毒昆虫细胞系统，YCp19(酵母菌)。见“DNA”克隆卷I和II，Glover等编。IRL出版社，牛津(1985)(1987)和；J.Maniatis等(“分子克隆”冷泉港实验室(1982))。
该基因可被置于启动子，核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选一种操纵基因(在本文中合称为“控制”元件)的控制下，以便编码所需蛋白的DNA序列被转录为经含有这种表达构建物的载体转化的宿主细胞中的RNA。该编码序列可含或可不含信号肽或前导序列。本发明的亚单位抗原可使用如大肠杆菌tac启动子或蛋白A基因(spa)启动子和信号序列而被表达。前导序列可在翻译后加工中被细菌宿主去除。参见，如美国专利第4431739；4425437；4338397号。
除控制序列外，可能还希望增加调节序列以供调节宿主细胞生长相关蛋白序列表达。调节序列为本领域技术人员公知，实例包括在化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)下引起基因的表达开启或关闭的物质。调节元件的其它类型也可存在于载体中，例如，增强子序列。
构建表达载体以使特定编码序列位于带有适当调节序列的载体中，编码序列相对于控制序列的位置和取向应使编码序列在控制序列的“控制”下转录(即，在控制序列处结合于DNA分子的RNA多聚酶转录该编码序列)。为达到这一点，可能需要改变编码所研究的特定抗原的序列。例如，在一些情况下，可能需要改变该序列以便它可以适当取向连接于控制序列；即，保持阅读框，控制序列和其它调节序列可在插入一种载体，如上述克隆载体，之前连接于编码序列。另外，编码序列可直接被克隆入已含有控制序列和适当限制性位点的表达载体。
在一些情况下，可能希望增加引起多肽从宿主有机体分泌的序列，随后再剪切分泌信号。也可能希望产生所研究受体的突变型或类似物。突变型或类似物可通过编码蛋白的序列的一部分的缺失，通过在序列中插入一段序列，和/或通过取代一或多个核苷酸而制备。改变核苷酸序列的技术，如定点突变发生，为本领域技术人员所公知。见，如，T.Maniatis等，上文；DNA克隆，卷I和II，上文；核酸杂交，上文。
许多原核表达载体在本领域中是公知的。见，美国专利第4578355；4440859；4436815；4431740；4431739；4428941；4425437；4418149；4411994；4366246；4342832号。亦见英国专利申请GB2121054；GB2008123；GB2007675；和欧洲专利申请103395。酵母表达载体在本领域中也是公知的。见，如，美国专利第4446235；4443539；4430428号，亦见欧洲专利申请103409；100561；964491。使用SV40晚启动子以驱动哺乳动物细胞中的表达的pSV2neo(如J.Mol.Appl.Genet(分子应用遗传学杂志)1；327-341中所述)或使用CMV启动子以驱动表达的pCDNA1neo，一种使用CMV启动子以驱动表达的衍生自pCDNA1载体(分子细胞生物学74125-29)。这后两种载体可被用于在哺乳动物细胞中瞬时或稳定(使用G418抗性)表达。昆虫表达系统，如，果蝇，也有用，参见，PCT申请美国89/05155和美国91/06838以及欧洲申请88/304093.3。
根据所选择的表达系统和宿主，本发明的蛋白通过在所研究蛋白能被表达的条件下培养用上述表达载体转化的宿主细胞而产生。随后将蛋白从宿主细胞分离并提纯。如果表达系统将蛋白分泌入培养基，则可直接从培养基提纯蛋白。如果蛋白不被分泌，则它可从细胞溶胞产物分离或从细胞膜级分回收。在这种情况下，如果蛋白位于细胞表面，则完整细胞或分离的膜可用作所希望基因产物的可分析来源。适当培养条件和回收方法的选择是本领域中公知的。
鉴定本发明的蛋白的另一种方法是通过构建基因文库，使用产生的克隆去转化大肠杆菌并使用针对所希望受体的多克隆血清或单克隆抗体收集和筛选单个克隆。
本发明的蛋白也可通过化学合成如固相肽合成生产，使用已知氨基酸序列或衍生自所研究基因DNA序列的氨基酸序例。这些方法对于本领域技术人员是公知的。肽类的化学合成不特别优选。
本发明的蛋白或它们的片段包含至少一个表位可用于产生抗体，多克隆和单克隆抗体。如果期望得到多克隆抗体，则将一种被选择的哺乳动物(如小鼠，兔，山羊，马等)用本发明的受体或其片段，或一种突变的受体免疫接种。经免疫接种的动物的血清被收集并按照已知方法处理。如果使用含多克隆抗体的血清，则多克隆抗体可通过免疫亲合层析或其它已知方法提纯。
针对本发明的蛋白及其片段的单克隆抗体也易于由本领域技术人员生产。通过使用杂交瘤技术制造单克隆抗体的常规方法是公知的。可通过细胞融合，以及其它技术如用致瘤的DNA直接转化B淋巴细胞，或用EB病毒转染产生永生的抗体产生细胞系。参见，M.Schreier等，杂交瘤技术“(1980)；Hammeiling等，”单克隆抗体和T-细胞杂交瘤“(1981)；kennetl等，”单克隆抗体“(1980)；也参见美国专利4341761；4399121；4427783；4444887；4452570；446917；4472500；4491632；和4493890号。针对所研究抗原产生的单克隆抗体清单，可被筛查多种特性，即，同种型，表位，亲合性等。通过使用免疫亲合技术，单克隆抗体在它们所针对的个别抗原的提纯中有用。另外，编码所研究单克隆抗体的基因可通过本领域公知的PCR技术从杂交技术，单克隆抗体在它们所针对的个别抗原的提纯中有用。另外，编码所研究单克隆抗体的基因可通过本领域已知的PCR技术从杂交瘤分离并在适当载体中克隆和表达。本发明的这些抗体，不管是多克隆的还是单克隆的都有其它用途，因为，它们还可用作免疫测定，RIA，ELISA等中的试剂。
在另一项实施方案中，包含受体的细胞膜级分或游离或固定于固体支持物上的分离的受体可用于测定被测的结合。当重组体细胞用于表达受体时，优选使用具有很小或无内源性受体活性的细胞，以使结合(如果有结合的话)是由于被表达的所研究受体的存在。优选细胞包括人胚肾细胞，猴肾(HEK-293细胞)，成纤维(COS)细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，果蝇或鼠L-细胞。还优选采用具有受体反应第二信使系统的宿主细胞。公知的第二信使系统包括但不限于响应结合于细胞外受体结构域，磷酸肌醇水解，腺苷酸环化酶，鸟苷酸环化酶，离子通道活性的升高或降低。在另一项实施方案中，一种特殊设计的受体结合标记可被构建。例如可通过将本发明的受体与对受体结合敏感的蛋白区融合制造一种融合蛋白。在此称为指示域的结构域本身或与辅助分子一起能够产生一种分析上可检测信号，该信号指示受体配体结合。
另外，来自转染的或转化的细胞的细胞膜制备物可被使用。在这种情况下，分析上可测的配体的结合被测定。放射和非放射标记配体的使用在本发明中得到考虑。上述技术在配体鉴定中有用，而且在药物筛选和药物开发方法中也有用。
第四方面提供了在上述筛选方法中鉴定的新化合物(下文中称为通式(X)的化合物)和可药用的盐，水合物或溶剂化物。
可药用的盐，水合物和溶剂化物可按常规方法制备。
本发明还延伸至使用通式(X)的化合物或其可药用的盐，水合物或溶剂化物作为治疗剂。
本发明还延伸至一种治疗或防止疾病的方法，它包含向需要此种治疗或防止的患者施用有效量和/或预防量的通式(X)的化合物或其可药用的盐，水合物或溶剂化物。
本发明还延伸至在药物制造中通式(X)的化合物的用途。这种药物用于治疗或预防焦虑，躁狂，抑郁，与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因，尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应，用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病，如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血。
本发明也延伸至用于治疗或防止下述疾病的药物组合物。这些疾病包括焦虑，躁狂，抑郁，与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因，尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应，用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病，如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血。该方面包含将通式(X)的化合物与可药用的载体混合。
用所述筛选方法鉴定的这种新化合物可使用有机化学领域公知技术制备。
本发明第五方面提供了一种结合于新受体的单克隆或多克隆抗体。
这种单克隆和多克隆抗体可通过常规技术识别和制备。
本发明因此也提供了结合于新受体的单克隆或多克隆抗体作为治疗剂的应用。
本发明还提供了结合于新受体的单克隆或多克隆抗体在药物制造中的应用。这种药物用于治疗和/或预防焦虑，躁狂，抑郁，与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因，尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应，用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病，如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血。
本发明还提供了一种方法，用于治疗和/或预防焦虑，躁狂，抑郁，与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因，尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应，用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病，如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血。该方法包含施用有效量和/或预防量的结合于新受体的单克隆或多克隆抗体。
本发明还延伸至用于治疗和/或预防焦虑，躁狂，抑郁，与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因，尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应，用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病，如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血的药物组合物，它包含将单克隆或多克隆抗体与一种可药用的载体混合。
本发明的第六方面提供了一种结合于新受体的放射标记化合物。这种放射标记化合物可通过常规技术制备。这种化合物的具体实例在实施例中描述。本发明因此也提供了结合于新受体的放射标记化合物作为诊断工具在检测新受体中的改变或异常中的应用。这些改变可能存在于本发明中提及的与受体结合相关的疾病中。这种放射标记受体也可用作用于研究新受体性质的研究工具。优选的放射活性化合物包括实施例2至5中所给出的。
下列实施例阐明本发明。实施例1成年Wistar大鼠被处死并解剖取脑。解剖出全部前脑组织并在缓冲水性介质中均浆。均浆组织通过离心和再悬溶于相同缓冲液洗涤。离心后再悬溶的组织或新鲜使用，或在使用前冰冻保存3个月或更长时间。
浓度为1-10mg蛋白/ml的如上制备的组织的等分试样与溶解于缓冲介质(50mM HEPES，pH7.4)中的〔3H〕化合物A的等分试样混合。〔3H〕化合物在混合物各的终浓度在20-50mM范围内。该混合物在室温温育约1小时。然后通过滤过将结合于组织的〔3H〕化合物A从未结合的〔3H〕化合物A分离。滤过是通过Whatman玻璃纤维滤膜(GF/B或GF/C)。该滤膜随后用冰冷却的缓冲介质(50mM HEPES，pH 7.4)快速洗涤。在滤膜加入液体闪烁剂后在液体闪烁仪中计数而测定。
为确定〔3H〕-化合物A“特异”结合量(即，对新位点特异的结合)，按照上述进行平行测定，但是在存在高浓度(1-10μM)未标记化合物情况下将〔3H〕化合物A与组织共同温育，该未标记化合物也结合于新位点从而防止〔3H〕化合物A对此位点结合。可使用未标记的化合物A本身，但也可使用结合于新位点的其它化合物。在此未标记化合物存在下保留的〔3H〕-化合物A结合量定义为“非特异”结合。将此量从〔3H〕-化合物A结合总量(即，在无未标记化合物存在下的量)中减去以获得〔3H〕化合物A对新位点的“特异”结合。
组织中新受体的密度和其对〔3H〕化合物A亲合性的估算通过将组织与一系列浓度的〔3H〕化合物A温育而获得。在〔3H〕化合物A的不同浓度的特异结合(如上所定义)水平随后被用计算〔3H〕-化合物A对新位点的解离常数(KD)和组织中此位点的密度(Bmax)。
结果化合物A的计算值为对于大鼠前脑组织Kd为40nm和Bmax为220pmol/g蛋白。
使用上述类似方法，但化合物B的浓度约为1/10；则化合物B的计算值为对于大鼠前脑组织KD为2nM和Bmax为220pmol/g。实施例2〔羧基-14C〕化合物A的合成和〔羰基-14C〕化合物1.〔羧基-14C〕4-氟苯甲酸向搅拌的无水二甲基甲酰胺中的〔14C〕氰化钾(100 mCi，60mCi/mmol-1)悬液中加入碘化铜(I)(158mg，0.83mmol)和4-氟-碘代苯(433mg，1.95mmol)。该混合物在氮气下回流加热22小时。该溶液通过加入5N氢氧化钠(2ml)碱化并用水(2ml)稀释。该混合物用乙醚彻底提取，合并的提取物依次用饱和盐水(2×30ml)，水(2×30ml)洗涤，在硫酸镁上干燥，滤过并蒸发除醚。残留物溶于乙醇(15ml)，加入氢氧化钾(1.34g)水(8ml)溶液，产生的溶液回流加热15小时。冷却的反应混合物用水(20ml)稀释，用1N盐酸调节pH值至1-2并用乙酸乙酯彻底提取混合物。合并的提取物用水(1×50ml)洗涤，在硫酸镁上干燥，滤过并蒸发至干，提供〔羧基-14C〕4-氟苯甲酸(196mg，1.38mmol，68.4mCi，68.4％)。2.〔羧基-14C〕化合物A将〔羧基-14C〕4-氟苯甲酸(196mg，68.3mCi，1.38mmol)，1-羟基-苯并三唑水化物(191.4mg，1.42mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(265mg，1.38mmol)溶于无水二氯甲烷(6ml)。向其中加入二氯甲烷(2.0ml)中的(3R，4S)-4-氨基-3，4-二氢-2，2-二甲基-2H-苯并[b]吡喃-3-醇(258mg，1.38mmol，含95w/w甲醇)和三乙胺(0.190ml)溶液。该混合物在环境温度搅拌19.5小时并将溶剂在真空中蒸发。残留物用乙酸乙酯提取(25ml)依次用稀盐酸(2×25ml)，水(25ml)，饱和碳酸氢钠水溶液(25ml)，水(25ml)洗涤，在硫酸镁上干燥，滤过并蒸发至干。粗〔羧基-14C〕化合物A通过柱层析提纯(硅胶40g，用乙酸乙酯/己烷1∶3v/v洗脱以去除非极性杂质并用100％乙酸乙酯洗脱〔14C〕化合物A)产生〔14C〕化合物A(179.7mg，0.50mmol)。此物质的一部分(130mg)通过半制备性HPLC(Spherisorb 5W硅胶22.5×250mm柱，用氯仿/甲醇95∶5v/v)以1010ml/min洗脱)以提供〔14C〕化合物A(107mg)。此批在水中平衡6小时，随后在真空中彻底干燥。该产物放射化学纯度为99.7％，光学纯度＞99％，化学纯度为95.5％(“如是”)，比活为59.6Ci.mmol-1。1H NMR谱与结构一致，并且与WO 92/22293中制备的未标记化合物相同。分析系统在下面描述。图解式1〔14C〕化合物A的合成
〔14C〕化合物A*指碳-14放射标记实施例3〔羧基-14C〕的合成，(3S，4S)-6-乙酰基-3，4-二氢-2，2-二甲基-4-(3-氯-4-氟-苯基〔14C〕羰基氨基)-2H-苯并〔b〕吡喃-3-醇的合成3-氯-4-氟苯并〔14C〕腈将3-氯-4-氟碘代苯(472.8mg，184mmol)。〔14C〕氰化钾(比活为60mCi.mmol-1时100mCi，1.67mmol，108.8mg)和碘化铜(I)(173.9mg，0.91mmol)悬溶于N-甲基吡咯烷酮(4.5ml)中。
该混合物随后在氮气下加热至150℃，同时搅拌，总共19.25小时，并放置于室温49小时。通过TLC(硅胶，用乙酸乙酯/正-己烷1∶5v/v洗脱)检测显示反应进行至约73％转化。该反应混合物随后在水(100mL)和乙酸乙酯(100mL)间分开。有机层依次用2％w/v氯化铁溶液(100mL)，水(100mL)，2％w/v偏二硫化钠溶液(100mL)，水(100mL)和盐水(100mL)洗涤。然后将有机层在硫酸镁上干燥，滤过以去除干燥剂，在减压下蒸发干燥并将残留物在硅胶(MerckArt.9385)上进行柱层析，用1∶8乙酸乙酯/正己烷洗脱。收集相关级分并合并以提供合约72.7mCi(相当于1.21mmol，188mg，72.7％收率)3-氯-4-氟苯并〔14C〕腈的溶液。
3-氯-4-氟苯并〔14C〕羧酸的合成3-氯-4-氟苯并〔14C〕腈(在60mCi.mmol-1的比活下36mCi；0.6mmol，94.5mg)的乙酸乙酯/正己烷1∶8v/v(85mL)溶液被还原后在减压下干燥。残留物被悬溶于浓盐酸(8.0mL)并加热至100℃，同时搅拌，在氮气下，6小时。约每间隔1小时搅拌混合物以使升华的物质洗涤入混合物中。该混合物冷却并在室温下过夜。该混合物随后水(30mL)乙酸乙酯(40ml)间分层。水层用乙酸乙酯(40mL)再次提取；合并有机层提取入2M氢氧化钠溶液(40mL)。将有机层再提取两次入2M氢氧化钠溶液(2×20ml)。合并的碱性水溶液通过加入浓盐酸小心地酸化至pH1。将水溶液随后提取两次入乙酸乙酯(2×80mL)合并层，在硫酸镁上干燥并滤过以去除干燥剂。用小量乙酸乙酯(总量50mL)洗涤沉淀数次并将洗涤物与滤过物合并。所有溶剂随后在减压下蒸发以提供固体(75mg，0.43mmol，71.7％收率)3-氯-4-氟苯并〔14C〕羧酸。
(3S，4S)-6-乙酰基-3，4-二氢-2，2-二甲基-4-(3-氯-4-氟-苯基〔14C〕羰基氨基)-2H-苯并〔b〕吡喃-3-醇的合成3-氯-4-氟苯并〔14C〕羧酸(75mg，0.43mmol)被溶于DMF(2.5mL)。向此溶液加入羟基苯并三唑(82.6mg，0.61mmol，1.42eq)〔在真空下在室温干燥24小时〕和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(113.8mg，0.59mmol，1.37eq)〔在真空下在室温干燥24小时〕并将混合物在室温搅拌30分钟。加入(3S，4S)-6-乙酰-3，4-二氢-2，2-二甲基-4-氨基-2H-苯并〔b〕吡喃-3-醇(150mg，0.64mmol，1.49eq)的DMF(2.5mL)溶液并将混合物在室温搅拌过夜。将混合物在水(50mL)和乙酸乙酯间分配；水层再次提取入乙酸乙酯(80mL)。合并有机层，用水(50mL)洗涤，在硫酸镁上干燥并滤过以去除干燥剂。干燥剂在滤器上用乙酸乙酯洗涤(50mL)；合并滤过液和洗涤并在减压下蒸发至干燥，残留物在硅胶进行柱层析，用乙酸乙酯/正-己烷1∶1v/v洗脱。合并相关柱级分，在减压下蒸发至干燥，如此获得的泡沫状残留物从丙酮/正-己烷再结晶以提供一种白色固体产物，它在真空干燥以得到123.5mg，0.31mmol，72％收率的(3S，4S)-6-乙酰基-3，4-二氢-2，2-二甲基-4-(3-氯-4-氟苯基〔14C〕羧基氨基)-2H-苯并〔b〕吡喃-3-醇。该产物具有98.7％的放射化学纯度。99.4％的化学纯度(“如是”)，99.9％的手性纯度和59.4mCi.mmol-1的比活。1H NMR谱与结构一致并且与按照前述专利中所描述制备的未标记化合物相同。实施例4〔125I〕化合物B未标记化合物B与二(三丁基锡)的钯(II)催化偶联产生三丁基锡烷衍生物。随后在3％乙酸的醇溶液中在存在1.0-2.0μg氯胺-T作为氧化剂时，通过用5.0mCi碘-〔125I〕化钠对100μg部分的丁基锡烷衍生物进行放射性碘脱锡烷化而获得且目标碘-125标记化合物，即化合物B-〔125I〕。此方法产生3.4-3.9mCi(68-78％放射化学收率)的〔125I〕化合物B，在HPLC(Baher硅胶柱，4.6mm ID×25cm，98∶2己烷/异丙醇，以1.0ml/分洗脱，在230nm处用紫外线监测)纯化后放射化学纯度至少为99％，比活(来自对质量和放射活性浓度的测定)测定为1775-1800 Ci/mmol。
实施例5〔3H〕化合物A将化合物D(1.0-1.2mg，1.9-2.4μmol)溶于1.0ml 9∶1(v/v)DMF(Baker)/三乙胺(Aldrich)。向此溶液中加入1.0-1.2mg(100重量％)的10％披钯碳(Aldrich)。此反应混合物在环境温度中在3.6-4.9Ci氚气环境下搅拌。
通过加入甲醇(3×2ml)继以真空转移去除挥发性成分。留下108-146mCi的粗产物。放射HPLC分析显示此物质含61-60％〔3H〕化合物A。此物质以4至次注射通过反相HPLC提纯(Beckman Octyl，4.6×250mm柱，乙腈/水/三氟乙酸(40∶60∶0.1)，在220-240nm处紫外线检测，1ml/分流速)。对应于产物的洗脱液被冷冻干燥随后溶于乙醇以提供24-25mCi〔3H〕化合物A。分析得到21.5-29Ci/mmol的特异活性(通过化学电离作用-质谱测定的同位素丰度，NH3试剂气体)和至少99％的放射化学纯度(Ultrasphere ODS 5μm，4.6×250mm柱，乙腈/水/三氟乙酸线性梯度从34∶66∶0.1至90∶10∶0.1大于10分钟，速度为1.0ml/分，在230nm处紫外线检测。并通过在线放射活性流式闪烁监测仪检测放射活性活性)。
化合物D3H化合物A实施例6化合物C
通过在标准条件下ipso取代导入放射标记{Na[125I]I(不加载体)/氯胺-T}8-三丁基锡烷制备光亲合标记〔125I〕6-乙基-3，4-二氢-2，2-二甲基-8-〔125I〕碘-4S-〔3-{三氟甲基-3H-diazirin-3基}苯甲酰基〕-2H-苯并[b]吡喃-3R-醇，并将粗〔125I〕6-乙酰基-3，4-二氢-2，2-二甲基-8-〔125I〕碘-4S-〔3-{三氟甲基-3H-diazirin-3基}-苯甲酰氨基〕-2H-苯并[b]吡喃-3R-醇，通过HPLC{Novapak C18用0.1％TFA水溶液/乙腈(1∶1v/v)}〔125I〕SB-224172提纯，通过将6-乙酰基-3，4-二氢-2，2-二甲基-8-碘-4S-氨基-2H-苯并[b]吡喃-3R-醇与六丁基锡和二溴钯二(三苯膦)反应并随后与3-〔3-(三氟甲基)-3H-diazirin-3-基〕苯甲酸缩合而制备锡烷。流程图
实施例7a)3-(1，1-Diazirino-2-三氟乙基)苯甲酸向二噁烷(10ml)和0.2MKOH(63ml)溶液中的按照M.Ceruso和G.D.Prestwich，Bioorg和Med Cgem Letts，1994，4-2179-2184制备的2.7g 3-(1，1，diazirino-2-三氟乙基)苄醇搅拌溶液中分批在2.5h内加入KMNO4(2.45g)。该混合物随后通过硅藻土垫滤过以去除过剩的MnO2并将滤过液用醚提取。水性层用1M H2SO4(25ml)酸化用醚提取。有机层用水，盐水洗涤并在无水Na2SO4上干燥。滤过并在真空中蒸发以得到浅黄色固体的化合物(2.45g)。b)反式-6-乙酰-4S-(3-(1，1-diazirino-2-三氟乙基)-苯甲酰氨基)-3，4-二氢-2，2-二甲基-8-碘-2H-1-苯并吡喃-3-醇(化合物C)向干燥DMF(2ml)中的上述diazirinyl苯甲酸(0.124g)溶液加入乙基二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐(0.095g)和1-羟基苯并三唑(0.067g)。此溶液在室温搅拌10分钟。将反式6-乙酰基-4R-氨基-3，4-二氢-2，2-二甲基-8-ido-2H-1-苯并吡喃-3S-醇(0.015g，按照PCT/EP/95/02249)的描述1和实施例8制备)加入此溶液中并继续搅拌3小时。将混合物倒入水中并用乙酸乙酯提取。有机层用稀盐酸，水，饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤并在无水Na2SO4上干燥。滤过并在真空中蒸发以得到粗固体(0.37g)并将它从乙酸乙酯正己烷重结晶以产生作为晶体的实施例7的化合物。熔点109-100℃[α]D25+55.3°(MeOH，c＝1.1)
权利要求
1.一种获自大鼠前脑组织的基本纯的受体，其特征在于a)对于大鼠前脑组织，化合物A以Kd 40nM与其结合，b)对于大鼠前脑组织，化合物A以Bmax220pmol/g蛋白与其结合，c)对于大鼠前脑组织，化合物B以Kd 2nM与其结合，d)对于大鼠前脑组织，化合物B以Bmax220pmol/g蛋白与其结合，以及与大鼠前脑组织有至少85％同源性的来自其它来源的同源受体。
2.按权利要求1所定义的受体的可溶形式。
3.按权利要求1所定义的受体，其分子量经凝胶电泳(SDS-PAGE)分析在130K道尔顿左右。
4.按权利要求2所定义的受体可溶形式作为治疗剂的应用。
5.按权利要求2所定义的受体可溶形式在药物制备中的应用，这些药物用于治疗和/或预防焦虑、躁狂、抑郁、与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应。用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病，如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血。
6.一种方法，用于治疗和/或预防焦虑，躁狂，抑郁、与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应。用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病，如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血，该方法包含向需要的患者施用有效量或预防量的按权利要求2的定义的可溶性受体。
7.一种药物组合物，用于治疗或预防焦虑、躁狂，抑郁、与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应。用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血，它包含与药学上可接受载体混合的按权利要求2所定义的可溶性受体。
8.一种方法，用于筛选具有与结合于按权利要求1所定义受体相关的治疗活性的化合物；它包含使被测化合物与存在新受体的物质相接触并测定结合度。
9.一种放射标记化合物，它结合于按权利要求1所定义的受体并可使用按权利要求8中所定义的筛选方法被取代。
10.一种新化合物及其可药用的盐，水合物或溶剂化物，它在按权利要求8所定义的筛选方法中被鉴定。
11.权利要求10的化合物或其可药用的盐，水合物或溶剂化物作为治疗剂的应用。
12.一种治疗或预防疾病的方法，它包含向需要的患者施用有效和/或预防量的按权利要求10所定义的化合物或其可药用的盐，水合物或溶剂化物。
13.按权利要求10所定义的化合物在药物制造中的应用，这些药物用于治疗或预防焦虑、躁狂，抑郁、与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应。用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血。
14.一种药物组合物，用于治疗或预防焦虑、躁狂，抑郁、与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应。用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血，它包含将按权利要求10所定义的化合物与一种可药用的载体混合。
15.一种单克隆或多克隆抗体，它结合于按权利要求1所定义的受体。
16.按照权利要求15所定义的结合于新受体的单克隆或多克隆抗体作为治疗剂的应用。
17.按权利要求15所定义的结合于新受体的单克隆或多克隆抗体在药物制造中的应用，这些药物用于治疗或预防焦虑、躁狂，抑郁、与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应。用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血。
18.一种方法，用于治疗或预防焦虑、躁狂，抑郁、与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应。用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血，它包含施用有效量和/或预防量的按权利要求15所定义的结合于新受体的单克隆或多克隆抗体。
19.一种药物组合物，用于治疗或预防焦虑、躁狂，抑郁、与蛛网膜下出血或神经性休克相关的疾病，与滥用物质如可卡因、尼古丁，酒精和苯二氮类的撤药相关的效应。用抗痉厥药物可治疗和/或预防的疾病如癫痫，帕金森氏病，精神病，偏头痛和/或大脑缺血，它包含将按权利要求15所定义的单克隆或多克隆抗体与可药用的载体混合。
20.一种放射活性标记的化合物，它结合于按权利要求1定义新受体。
21.按权利要求20所定义的结合于新受体的放射标记化合物作为诊断工具的应用，用于检测按权利要求1所定义的新受体的改变或异常。
全文摘要
一种获自大鼠前脑组织的基本纯的受体,其特征在于:a)对于大鼠前脑组织,化合物A以Kd40nM与其结合,b)对于大鼠前脑组织,化合物A以B
文档编号C07D311/68GK1175262SQ95197647
公开日1998年3月4日 申请日期1995年12月11日 优先权日1994年12月17日
发明者H·J·赫登, J·C·杰曼, W·N·陈 申请人:史密丝克莱恩比彻姆有限公司