新趋化因子受体cxcr8的鉴别的制作方法
【专利说明】
[0001] 有关联邦资助的研究或开发的声明
[0002] 本发明是依据美国国家卫生研究院(化tional Institutes of Health)的授权号 R01-AI093548在政府的支持下提出。美国政府在本发明中享有某些权利。
[0003] 有关序列表的参考
[0004] 序列表是W名为"1279588SE化1ST"的ASCII文本文件与本发明一起提交，该序列 表于2014年9月30日创建，并且大小是51千字节。序列表全文通过引用并入本文中。
技术领域
[0005] 本发明设及趋化因子巧化17及其受体巧CR8/GPR35。
【背景技术】
[0006] 人趋化因子超家族包括某些48种配体和19种已知的受体。大部分配体的受体已得 到鉴别，但有一些仍是"孤儿(0巧han)"(l)。趋化因子(C-X-C基序)配体17(CX化17)是描述 的最新趋化因子配体(2)。发明人先前报道，CXCL17是在特发性肺纤维化（IPF)患者的支气 管肺泡灌洗液中显著上调的粘膜相关趋化因子(3)。重要的是，它还是受体尚未得到鉴别的 少数"孤儿"趋化因子配体之一(另一个是CX化14) (1)。
【发明内容】
[0007] 趋化因子是引导白细胞和其它细胞在体内运输的趋化性细胞因子家族。趋化因子 结合到在祀细胞表面上表达的G蛋白偶合受体(GPCR)，由此起始细胞内信号传导级联并诱 导趋化作用。尽管大多数趋化因子的同源受体已经得到表征(4)，但最近报道的趋化因子配 体CX化17的受体仍不明确。如本文所描述，已显示GPR35是CX化17的受体。已知CX化17可对 巨隧细胞和树突状细胞发挥趋化作用（2KGPR35是由CXCL17反应性人单核细胞、树突状细 胞(DC)表达或在其上表达，并且在THP-1单核细胞样细胞系中有表达。另外，如通过巧调动 检验所测量，将GPR35转染到Ba/F3细胞中使运些细胞对CX化17起反应。CX化17是在粘膜组 织中表达的趋化因子(3) ;GPR35表达反映了运一粘膜表达模式。GPR35还展现出趋化因子受 体的若干结构特征，包括DRY盒及ΤχΡ基序。由此得出结论，GPR35是一种新的趋化因子受体， 并因此提出应当将其命名为趋化因子(C-X-C基序)受体8(CXCR8)dGPR35与人类疾病有关； GWAS研究已将其与炎性肠病（I抓)联系在一起巧）。总的说来，运些观察结果有力地表明，运 一新的粘膜趋化因子CX化17/CXCR8轴是呼吸系统或消化系统病理生理学或发炎过程中治 疗干预的重要祀标。该配对在人体中得到证实，而且在不同物种中对应物将W类似方式配 对。不同物种的对应物可能配对，并且可能显示正常的交叉反应性，或可能具有与天然配对 不同的亲和力或信号传导能力。
[0008] 在一方面，提供了一种治疗受试者的与CXCR8信号传导增加相关的病症的方法。该 方法包括破坏受试者体内由配体CX化17引起的受体CXCR8的活化。在所述方法中：a)所述破 坏可W包括向受试者施用干扰CX化17与CXCR8的结合的物质;b)所述病症可W是胃肠病症、 呼吸系统病症、代谢病症、感染性病症或肿瘤病症，在具体实施方案中，该病症可w是肺、消 化系统或生殖系统炎性疾病；C)此类炎性疾病的实例包括但不限于，克罗恩氏病(Crohn's disease, CD)、原发性硬化性胆管炎、溃瘍性结肠炎、脂泻病或肠易激综合症（IBS)、溃瘍、缺 血性结肠炎、放射性结肠炎、乳糜泻、支气管肺发育异常、特发性肺纤维化、过敏性肺炎、非 特异性间质性肺炎、慢性阻塞性肺病、肺炎、哮喘、支气管炎、肺气肿、亚临床间质性肺病(亚 临床ILD)、囊性纤维化、肉样瘤病、子宫内膜异位、平滑肌瘤、子宫腺肌病、细菌性阴道炎，或 者尿道感染或炎症;d)或a)-c)的任何组合。
[0009]在另一方面，提供了一种筛选破坏受体CXCR8与配体CX化17之间的缔合的物质的 方法。该方法包括将CX化17添加到表达CXCR8的细胞中，及测量在所述物质存在下细胞中 CXCR8信号传导的减少。举例来说，可W使用实施例中描述的Ba/F3细胞系的CXCR8转染子来 筛选CXCR8/CX化17相互作用的激动剂和括抗剂。
[0010]在又一方面，提供了一种筛选破坏受体CXCR8与配体CX化17之间的缔合的物质的 方法。该方法包括将CX化17添加至化XCR8中，及测量在所述物质存在下CX化17与CXCR8结合 的减少。
[0011]在本文所描述的运些或其它方法中，所述物质可W是:a)结合到CX化17或CXCR8的 抗体或其片段;b)展现CXCL17的天然或变体序列的多肤;c)CXCL17的非肤偶联变体;d)结合 到CX化17或CXCR8的小分子;e)结合到CX化17或CXCR8的适体;或a) - e)的任何组合。
[0012]在其它方面，提供W下内容：
[0013] a)提供了 CXCR8的配体，其中所述配体选择性结合到CXCR8受体。该配体可W是通 过所述受体进行信号传导的配体，如激动剂；对少于85%、90%、95%或更高百分比的人 CX化17进行信号传导的配体，如括抗剂;反向激动剂(抑制CXCR8的基础活性的激动剂）；别 构调节物（改变CXCR8的信号传导活性，但不干扰该配体(CXCL17)的结合的调节物）；与人 CX化17具有至少约85%、90%、95%或更高序列同一性的配体，如突变蛋白；包含了与人 CX化17展现至少94%同一性的具有至少17、19、23、27、31或更多个氨基酸的区段的配体； 和/或结合到灵长类动物的CXCR8受体的配体。所述配体可呈无菌组合物形式;被配制用 于全身或局部施用；呈治疗性组合物形式;处于单剂量容器中；和/或与人CX化17具有至少 90%序列同一性。在与人CX化17包括约85%、90%、95%或更高序列同一性的一些实施方案 中，运些实施方案不包括与天然存在的人CX化17序列同一的序列。
[0014] b)提供了选择性结合到CXCR8的配体的抗体。该抗体可W阻断与CXCR8受体的结 合;和/或阻断由CXCR8受体进行的信号传导。
[0015] C)提供了人CXCL17的受体或结合蛋白。该受体或结合蛋白可在结合所述人 CX化17后进行进一步信号传导；与人CXCR8相比较，在结合CX化17后对至少约80%的信号进 行信号传导；与人CXCR8具有至少约95%同一性；和/或结合到灵长类动物CX化17。在与人 CXCR8包括至少约95 %或更高序列同一性的一些实施方案中，运些实施方案不包括与天然 存在的人CXCR8序列同一的序列。
[0016] d)还提供了一种抑制CX化17通过CXCR8进行的信号传导的方法。该方法包括:曰)使 CXCR8 (受体)与CX化17 (配体)括抗剂接触;b)使CX化17 (配体)与阻断剂接触;和/或C)使表 达CXCR8的细胞与细胞信号传导阻断剂接触。CX化17 (配体）括抗剂可W选自：a)结合到 CXCR8(受体)的抗体(或其片段)或物种变体;b)CXCL17(趋化因子)变体(例如结合但不进行 信号传导;包括物种变体及对应物）；或C)小分子化合物。阻断剂可W选自：a)结合到CX化17 的抗体(或其片段）（例如趋化因子并阻断结合;包括物种变体）；b)所述受体的片段，该片段 可W是该受体的可溶性部分;和/或C)小分子化合物。细胞信号传导的阻断剂可W是:a)信 号传导路径成员的例如RNAi、CRISPR、TALEN化合物;b)阻断信号传导路径的抗体;或C)小分 子化合物。
[0017] e) -种诱导CXCR8(受体)信号传导的方法，所述方法包括使所述受体与其同源配 体接触，该配体可W是CXCL17或其激动剂。该激动剂可W是CXCL17的多肤序列变体或 CX化17的非肤偶联变体，或其片段。
[0018] f) 一种筛选所述CX化17括抗剂的方法，其中所述筛选使用了利用巧光成像板读取 器(fluorescent imaging plate reader JLIPR)或相关检测系统的基于细胞的检验，包括 选自W下各项的检验:FLIPR、基于细胞的检验、生物化学检验等等。在所述方法中，所述筛 选可W针对一种或多种化合物，运些化合物包括：i)结合到CX化17的抗体，包括物种变体或 对应物；ii)CX化17的多肤序列变体，包括物种变体；iii)CX化17的非肤偶联变体，例如糖基 化或其它修饰;iv)小分子括抗剂候选物;或V)适体文库。
[0019] g) -种筛选（f)中所述的阻断剂的方法，其中所述筛选使用了如F LIPR(参见 World Wide Web的mo 1 eculardevices.com/Products/Instrum ents/FLIPR- Systems . html)、基于细胞的检验或生物化学检验等检验；i)结合到CXCR8的抗体或物种变 体；i i) CX化17的多肤序列变体，例如可溶性受体片段或物种变体；i i i)CX化17的非肤偶联 变体，如糖基化或其它修饰;iv)小分子括抗剂候选物;和/或V)适体文库。
[0020] h)-种筛选所述CX化17括抗剂或阻断剂的方法，其中使用了 Ba/F3细胞系的CXCR8 转染子来筛选CXCR8/CX化17相互作用的激动剂和括抗剂。在某些实施方案中，所述筛选使 用了利用FLira或相关检测系统的基于细胞的检验，该检验可W是基于细胞的检验、生物化 学检验等等。在其它实施方案中，所述筛选是针对一种或多种化合物，运些化合物包括:a) 结合到CX化17的抗体或物种变体;b)CX化17的多肤序列变体或物种变体;c)CX化17的非肤 偶联变体，包括糖基化或其它修饰;d)小分子括抗剂候选物;或e)适体文库。类似地提供了 一种方法，其中所述筛选使用了化IPR、基于细胞的检验或生物化学检验。另外的实施方案 包括了所述筛选针对一种或多种化合物的情形，运些化合物包括:a)结合到CXCR8的抗体或 物种对应物或变体;b)CX化17的多肤序列变体，包括可溶性受体片段和物种对应物或变体； c)CX化17的非肤偶联变体，包括糖基化或其它修饰;d)小分子括抗剂候选物;或适体文库。 在一个具体实施方案中，使用了 Ba/F3细胞系的CXCR8转染子来筛选CXCR8/CX化17相互作用 的激动剂或括抗剂。
[0021] i)与CXCR8信号传导增加相关并能够通过所述方法治疗的各种胃肠病症包括:a) 克罗恩氏病(CD)、溃瘍性结肠炎化C)、脂泻病或肠易激综合症(IBS)、缺血性结肠炎、放射性 结肠炎、脂泻病;b)胃癌、膜腺癌、结肠直肠癌或肝细胞癌、食道癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胃 肠间质瘤;C)自体免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、其它(非自体免疫性)肝硬化、原发性 硬化性胆管炎或肝纤维化;或d)丙型肝炎病毒化CV)介导的肝硬化、由幽口螺杆菌引起的消 化性溃瘍。参见例如，化user,S.C.Mayo Clinic Gastroenterology and Hepatology Board Review,第四版,Mayo Clinic Scientific Press,2013;Hawkey等人,Clinical and Gastroenterology and Hepatology,第二版，Wiley-Blackwell,2012;及Yamada T.等人， Yamada's 化η化ook of Gastroenterology,第3版，Wil巧-Blackwell,2013。
[0022] j)与CXCR8信号传导增加有关并能够通过所述方法治疗的代谢病症包括1型糖尿 病或2型糖尿病。参见例如，Fonseca, V.A. Clinical Diabetes .Elsevier ,2012。
[0023] k)与CXCR8信号传导增加有关并能够通过所述方法治疗的致癌性代谢病症包括白 血病、淋己瘤或成胶质细胞瘤，或相关脑肿瘤。参见例如，Mughal，Τ. I .Understanding Leukemias , Lymphomas and Myelomas ,第2片反，Informa 2012;及Kaye , A .H.和Laws E.R.Jr.Brain Tumors,第3版,Elsevier 2012。
[0024] 1)与CXCR8信号传导增加有关并能够通过所述方法治疗的呼吸系统病症可W选 自：a)肺癌(6)，包括小细胞(7)或非小细胞肺癌(8)或间皮瘤(9)(恶性）;b)特发性肺纤维化 (10)、过敏性肺炎（11)或非特异性间质性肺炎;C)与间质性肺病有关的呼吸系统疾病，包括 自体免疫性疾病，如类风湿性关节炎或硬皮病;d)慢性阻塞性肺病(C0PDK12)、支气管肺发 育异常(BPD) (13)，或哮喘（14);和/或e)其它呼吸系统癌症，包括气管癌、喉癌、食道癌、支 气管癌或鼻/窦癌。参见例如，Judd, S,J,Respiratory Disorders Sourcebook,第2版， Health Reference Series ,2012;及Lechner,A.Respiratory,An integrated approach to disease;McGrawHi11 LANGE,2012。
[0025] m)所述施用可W是a)局部、局部性或全身性的;b)W气雾剂或薄雾形式吸入;或c) 与另一治疗剂组合。
[0026] η)提供了一种疫苗，该疫苗包含CX化17激动剂例如作为佐剂和/或激动剂，或包含 正别构调节物，也就是说，提供了无改变受体(CXCR8)的信号传导能力的激动剂或括抗剂活 性(对于CX化17)的分子。该疫苗可W包括保护性抗原，如针对乙型肝炎、人乳头瘤病毒、DPT 和/或麻疹病毒的疫苗中的那些。在一些情形中，祀抗原是肿瘤相关抗原(包括选自W下癌 症的肿瘤:肺癌、膜腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳癌、肝细胞癌、软组织肉瘤和/或成胶质 细胞瘤），或在弥散性白血病和淋己瘤中。所述疫苗可W用于选自肺癌、膜腺癌、结肠直肠 癌、前列腺癌、乳癌、肝细胞癌、软组织肉瘤或成胶质细胞瘤的癌症。所述疫苗可W施用给受 试者。参见例如，Pl〇tnA，S.A.等人，化ccines,第6版，Elsevier 2012。在其它实施方案中， 所述疫苗可W包括能够抑制耐受性细胞募集的适合浓度的CX化17括抗剂。
[0027] 0) -种调节受试者升高的血压的方法，所述方法包括施用适量的CXCR8激动剂W 调节所述血压。在一些实施方案中，升高的血压可W是高血压。所述激动剂可W选自：a)重 组人CX化17;b)人CX化17的多肤变体(包括物种变体）；c)CX化17的非肤偶联变体(例如糖基 化或其它修饰）。
[00%] P)-种募集巨隧细胞或树突状细胞的方法，所述方法包括施用CXCR8括抗剂(例如 并收集所述细胞）；所述方法可W另外包括施用CCR2激动剂，如CCL2，定义为在表达CCR2的 细胞中引起巧流动的分子。
[0029] q) -种使用CXCR8作为人类疾病发病机理中所设及的细胞标记物的方法，所述疾 病包括胃肠疾病、代谢疾病及呼吸系统疾病和癌症，所述CXCR8是白血病、淋己瘤、胃癌、结 肠直肠癌或膜腺癌的转移性细胞的生物标记物、包括小细胞或非小细胞肺癌在内的肺癌或 恶性间皮瘤的转移性细胞的生物标记物，或浸润性胃肠道或呼吸系统癌症的细胞的预后生 物标记物。
[0030] r)一种治疗或预防动脉粥样硬化（参见例如，George , S.J. Atherosclerosis : Molecular and Cellular Mechanisms,Wiley-Blackwell 2012)，或者治疗或预防多发性 硬化（参见例如，Hoi land, N.等人,Multiple Sclerosis,第4 版,Demos Health, 2012)的方 法，所述方法包括向受试者施用有效量的：a)CXCR8括抗剂；或CXCR8表达的抑制剂；或b) CXCL17括抗剂；或CXCL17表达的抑制剂。CXCR8括抗剂可W选自：a)结合至化XCR8的抗体(或 物种变体;例如结合但不传送信号）；b)CX化17的多肤序列变体(例如可溶性受体片段;物种 变体）；c)CX化17的非肤偶联变体（例如糖基化或其它修饰）；d)小分子括抗剂；或e)适体。 CXCR8表达或下游信号传导的抑制剂可W使用RNAi、CRISPR、TALEN化合物等。CX化17括抗剂 可W选自：a)结合到CX化17的抗体(或物种变体;结合但不传送信号）；b)CX化17的多肤序列 变体(包括物种变体）；c)CX化17的非肤偶联变体(例如糖基化或其它修饰）；d)小分子括抗 剂;或e)适体。CX化17表达或信号传导的抑制剂可W使用RNAi、CRISPR、TALEN化合物等。
[0031] S) -种抑制CX化17通过CXCR8进行的信号传导的方法，所述方法包括使用抑制 CXCR8(受体)表达的RNAi、CRISPR或TALEN化合物来减少CXCR8受体。同样，一种抑制CX化17 通过CXCR8进行的信号传导的方法，所述方法包括使用抑制CX化17[配体]表达的RNAi、 CRISPR或TALEN化合物来减少CX化17。
[0032] t) 一种分离表达CXCR8的细胞的方法，该方法包括将抗CXCR8抗体与外周血单核细 胞制剂混合，及分离所述抗体所结合的CXCR8阳性细胞。在所述方法中，抗CXCR8抗体可W是 单克隆抗体、中和抗体或人源化抗体，或其组合;该分离可W通过巧光活化细胞分选进行； 和/或该分离可W通过磁珠分离进行。
[0033] 在包括治疗受试者的与CXCR8信号传导增加相关的病症的方法在内的方法的一些 实施方案中，所述物质、激动剂或括抗剂不包括W下各物:犬尿哇嘟酸、2-酷基溶血憐脂酸、 色甘酸、双香豆素、毛地黄黄酬、尼氣灭酸、NPPB、双径糞酸盐及帕莫酸(pamoic acid)、搬皮 酬、酪氨酸憐酸化抑制素（地7巧11〇31:;[]1)-51、扎普司特^日91'；[]1日31:)、]\1]^144、]\1]^145或〔10- 2765487ο
[0034] 在本申请通篇，分子GPR35又称为巧CR8。
[0035] 受试者可W是人类或其它动物，并且典型地是灵长类动物或哺乳动物。
[0036] 来自各种物种的CX化17的序列具有W下登录号（全部通过引用并入本文中）： HGNC: 19232(人CX化17KHUG0基因命名委员会数据库；同源物:MGI :2387642(小鼠 Cxcll7) (MGI数据库）；RGD: 1304717(大鼠 Cxcl 17) (RGD数据库）；核巧酸序列：Ref Seq:匪 198477 (NCBI参考序列数据库）；蛋白质序列：UniProtKB:Q6UXB2化niProt Knowledgebase)。另参 见 GENBANK、NCBI、化 est、Swiss-p;rot、Unigene、Refseq、n;r-aa、PRF或PDBSTR。
[0037] 来自各种物种的CXCR8/GPR35的序列具有W下登录号（全部通过引用并入本文 中）：HGNC:4492(人GPR35KHUG0基因命名委员会数据库；同源物:MGI:1929509(小鼠 Gpr35) (MGI数据库）；RGD:1309404(大鼠 Gpr35)(RGD数据库）；核巧酸序列：RefSeq:醒 001195382 (NCBI参考序列数据库）；蛋白质序列：UniProtKB:Q9HC97化niProt Knowledgebase)。另参 见 GENBANK、NC