。
[0086] 制剂
[0087] 取决于最佳的施用途径，可W使用不同制剂(无菌制剂、缓冲制剂、缓慢释放制剂、 控制释放制剂、稳定剂、油膏等）。参见例如，Niazi S.K.化ndbook of Pharmaceutical Manufacturing F'ormulations Informa Healthcare 2012。与消炎剂相同，CX化 17/CXCR8 相互作用的激动剂或括抗剂可W与其它确定的药物组合使用W优化治疗结果。此外，所述 化合物可W与其它治疗剂组合用于单一制剂策略中。可W使用药理学变体来获得所希望的 药物动力学结果(分泌、半衰期、溶解性或优化排泄途径）。
[0088] 确切剂量将取决于治疗目的，并且可W由本领域技术人员使用已知技术确定。参 见例女日，Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery;Lieberman α992)PharmaceuticalDosage化rms(第l-3卷），De化er，ISBN 0824770846,082476918X， 0824712692,0824716981;Lloyd(1999)The A;rt,Science and Technology of 曲armaceutical Compounding;and Picka;r(1999)Dosage Calculations。如本领域中所 知，可能需要针对蛋白质降解、全身递送对比局部递送及新蛋白酶合成的速率，W及年龄、 体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用及病症的严重程度作调整，并且 运可W由本领域技术人员通过一些实验确定。
[0089] 本领域众所周知各种药学上可接受的赋形剂。如本文所使用，"药学上可接受的赋 形剂"包括运样一种材料，该材料当与组合物的活性成分组合时使该成分能获得生物活性， 而且不会引起与受试者免疫系统的破坏性反应。此类材料可W包括稳定剂、防腐剂、盐或糖 络合物或结晶等。参见例如，Niazi S.K.化ndbook of 曲armaceutical Manufacturing Formulations Informa Healthcare 2012。
[0090] 示例性药学载体包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液及乳液。实例包括但不限于， 标准药物赋形剂，如憐酸盐缓冲生理盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)及各种类型的润湿 剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油（如橄揽油)及可注射有机醋（如油酸乙 醋）。水性载剂包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠胃外媒剂包 括氯化钢溶液、林格氏右旋糖、右旋糖及氯化钢、乳酸林格氏溶液或非挥发性油。静脉内媒 剂包括流体和养分补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。在其它实施方 案中，所述组合物将并入固体基质中，该固体基质包括缓慢释放颗粒、玻璃珠、細带、眼上的 插入物及局部形式。施用途径可W包括W下：局部、全身、呼吸道、口、眼、植入物、阴道、肛 口、栓剂、控制释放装置、舌下、颊、鼻、吸入、肠胃外、器官内、皮下、皮内、肌肉内、静脉内等。 [0091 ]实施例
[0092]通过参照所附实施例可W更好地了解本发明，运些实施例只意图用于说明目的， 并且不应在任何意义上解释为限制本发明的范围。尽管本发明的说明包括了一个或多个实 施方案W及某些变化形式和修改的说明，但在了解了本公开内容之后，其它变化形式和修 改也在本发明的范围内，例如，可W在本领域的技术和知识范围内。本文所引用的所有出版 物、专利、专利申请、Genbank编号及网站都通过全文引用并入本文中用于所有目的。
[OOW] 实施例1
[0094] 首先，鉴别对CX化17起反应的细胞。为此，使用基于化answell的趋化作用检验测 量多个细胞系对重组CX化17的反应。利用THP-1人细胞系观察到由CX化17所诱导的最佳趋 化反应之一（图1AKTHP-1细胞来源于急性单核细胞性白血病患者（18)并且被广泛用于单 核细胞/巨隧细胞研究。
[0095] 由于已知CX化17募集单核细胞和树突状细胞(2)，故得出结论，THP-1细胞应当表 达CXCL17受体。重要的是，还发现THP-1细胞对CXCL17的反应在用前列腺素 E2(PGE2)处理后 增加（图1A)。先前的报道观察到THP-1在PGE2处理之后对其它趋化因子(例如，CX化14)具有 类似趋化反应(19)。另外，THP-1细胞的趋化反应对百日咳杆菌毒素(PTX)敏感(图1A)。已知 PTX可抑制Gai/。蛋白质信号传导路径(20-21)。由于大多数趋化因子受体经由Gai/。蛋白引起 其反应，故运一观察结果表明，CX化17受体使相同信号传导路径活化。
[0096] 趋化因子与其受体的结合使胞质巧特征性增加，运是在细胞中响应配体结合其同 源受体而发生的最早生物化学事件之一（21-22)。因此，提出假说：THP-1细胞应当展现 CX化17介导的Ca"流动。如图IB中所示，在休眠细胞和PGE2处理的细胞中添加 CX化17之后观 察到较强的化"流动。与趋化反应一致，PGE2处理的THP-1细胞也引起较强的化"流动信号 (图 1B)。
[0097]若干调控步骤管理细胞对趋化因子的反应。运些调控过程的实例包括控制激动剂 和趋化因子受体合成或趋化因子降解(23)。另外，还存在一个快速机制，该机制设及受体失 活信号传导路径的活化，称为去敏化。运一现象是由包括抑制蛋白和G蛋白偶合受体激酶在 内的反馈抑制剂级联的活化引起(24)，并且可W被设计用于防止延长的活化作用的潜在损 害作用。因此，趋化因子受体在活化后去敏化一段时间。
[009引使用THP-1细胞测试CX化17驱动的去敏化。如图1C中所示，CX化17使自身而非由 (XL2 (在THP-1细胞中诱导较强反应的另一趋化因子)诱导的化"流动去敏化(25)。相反地， CCL2不会使CXCL17介导的反应去敏化，表明运两个趋化因子是经由不同受体进行信号传导 ((：化2结合0：尺2)。
[0099] 先前的结果指示，CX化17通过由CX化17应答细胞表达的未鉴别的受体进行信号传 导。如W上所提到的，CXCL17诱导单核细胞和树突状细胞的趋化作用（图1A，（2))。因此，使 用了综合人类基因表达微阵列数据库，即'基因表达的身体指数（Body Index of Gene E邱ression，BIGE)'数据库（26-27)来鉴别由单核细胞表达的GPCR。运一筛选得到接近90种 GPCR，其中10种注释为嗅觉的，60种是已知的（经过注释），并且20种是孤儿（内源配体未知 的GPCR)(图8,表2)。为了研究其受体，首先测试CXCL17是否结合或活化其它已知的趋化因 子受体，包括已知由巨隧细胞表达的那些。结合和/或信号传导研究证实，CX化17不与CCR2、 CCR5、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7 及 CCX-CKR 结合或进行信号传导。此外，CX 化 14 或 CCL28 也 不结合GPR35(图7)。因此，预期CX化17应当结合一种新的但尚未得到鉴别的趋化因子受体。 我们决定进行旨在鉴别CX化17雙体的实验。
[0100] 研究集中在孤儿GPCR并且优先筛选与其它趋化因子受体显示结构相似性而且表 达模式与CX化17类似的那些GPCR。运些标准缩窄了候选物清单。首先通过产生转染子，在化 "流动检验中用CX化17测试来筛选CCRL2,运种GPCR展现与许多趋化因子受体相同的特征并 且在巨隧细胞和DC中表达(28)。与近期的报道一致(29)，未观察到响应于CX化17的巧流动 (数据未显示）。接下来的候选物是GPR35dGPR35最先被鉴别为A类孤儿GPCR基因（30)dGPR35 在若干粘膜组织中表达，包括胃肠道(31)，W及一些造血细胞，如单核细胞(32)、嗜碱细胞 和嗜曙红细胞(33);并且还在成年肺中显示相对较高的表达(34)。已发现，在用I巧抗体刺 激后的人肥大细胞（33)、用苯并[a]巧处理的人巨隧细胞（35)及胃癌细胞（31)中GPR35上 调。
[0101] 犬尿哇嘟酸(犬尿氨酸路径的色氨酸代谢物）、2-酷基溶血憐脂酸(2-酷基-LPA)及 一些酪氨酸代谢物已经被鉴别为GPR35的激动剂(36-37);然而，是否存在替代性内源GPR35 激动剂仍有待商権。
[0102] BIGE数据库中GPR35的表达掲露，前几个表达GPR35的位置/细胞包括休眠单核细 胞(图5,表1);如所预期的，休眠 DC也存在于此清单中并显示相对较高的GPR35表达（图5,表 1)。运些免疫细胞类型响应于CX化17而显示趋化作用（（2)和未公布的数据）。在该清单上其 余组织中受体的表达在粘膜中较强并且与已知的CX化17表达模式相关(3)。
[0103] GPR35基因位于染色体2长臂上的2q37.3处（图2A)。有趣的是，编码CXCR7的基因位 于相邻基因座中。运一观察结果值得关注，因为系统发生序列分析指示，CXCR7与GPR35密切 相关（图2B)。又，CX化17不结合CXCR7,因为其并不置换CXCR7表达性细胞中的i25I-CX化12。 随后有关GPR35蛋白质序列的检查掲露，在第二细胞内环处存在DRY盒（图2C)。运一基序存 在于大多数已知的功能性趋化因子受体中的相应位置，是G蛋白与运些跨膜分子偶合的主 要位点（38)并且还与调控配体依赖性受体内化的β-抑制蛋白募集相关(39)。此外，还检测 到在第二跨膜结构域处保守的Asp残基和ΤχΡ(化r-Xaa-Pro)基序的存在。运些特征是趋化 因子受体中高度保守的结构决定子并且在受体活化中起到重要作用(40-41)"GPR35的运些 结构特征W及其组织表达模式有力地表明，GPCR35可W作为CX化17受体。
[0104] 使用定量实时PCR(qRT-PCR)证实，GPR35在休眠 THP-1单核细胞中表达并且在PGE2 刺激之后显著上调（图3A)。流式细胞术证实了 GPR35在THP-1细胞中的表达（图3B)。我们试 图证明，通过将运一受体转染到不含GPR35的细胞系中可W在先前非反应性细胞中建立响 应于CX化17的巧流动。小鼠前体B细胞系Ba/F3不表达GPR35(42)，因此使用运些细胞进行转 染实验。当用重组人CX化17刺激人GRP35转染的小鼠 Ba/F3细胞时，观察到稳定的巧流动反 应（图4A)。重要的是，在模拟转染的对照细胞中未检测到运一反应。另外，还注意到CX化17 剂量-反应模式，其中Ca"峰值增加对应于CXCL17浓度的增加（图4B)。当将GPR35转染到其它 细胞中时，获得类似结果（图6)。另外，对其它粘膜表达的趋化因子，如CX化14或(XL28是否 能诱导通过GRP35进行信号传导进行测试，未得到成功（图7)。总的说来，运些观察结果表 明，GPR35是CX化17受体。
[01化]CX化17属于C-X-C趋化因子亚家族并且运些配体通常结合C-X-C趋化因子受体 (43)。屯个GPCR成员构成了趋化因子受体的运一子类:CXCR巧ljCXCR7(l)。考虑到GPR35功能 性响应于CX化17的能力，提出对GPR35趋化因子(C-X-C基序)受体8(CXCR8)重新命名。
[0106] CXCR8鉴别为CX化17受体是趋化因子领域的一个重要贡献，因为距离最后一次报 道趋化因子结合受体(CXCR7-结合CX化U和CX化12)已过去八年(44)。粘膜部位中CX化17/ CXCR8轴的生理学意义仍有待探索。然而，GPR35已经被鉴别为胃肠疾病的潜在地重要祀 (31)。重要的是，全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS)鉴别出GPR35 错义单核巧酸多态现象与原发性硬化性胆管炎及随后发生的溃瘍性结肠炎密切关联(5)。 总的说来，运些观察结果有力地表明，CXCL17/CXCR8轴是呼吸系统和消化系统中的重要巨 隧细胞募集信号，并且还表明运一轴设及肠道炎性疾病的发病机理，而且观察到在IPF(3) 中W及肺病变中CX化17明显上调。鉴于炎症在肺和胃肠病变中的重要性，预期CX化17/ CXCR8轴将在各种人类疾病中显示重要作用。
[0…7] 实施例2: 陶]细胞与试剂
[0109] 将人THP-1急性单核细胞性白血病细胞（American Type Culture Collection, Rockville，MD)W及鼠类骨髓源性前体B细胞系Ba/F3(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Braunschweig,Germany)的不依索负 于IL-3的克隆保持在完全RPMI培养基（10%胎牛血清、lOOOU/mL青霉素、lOOOU/mL链霉素及 20mmol/L谷氨酷胺，分别来自Co;rning-Cellg;ro，Manassas，VA)中。所提供的用于不同实验 的试剂包括：纯化的兔IgG( Jackson ImmunoResearch, West Grove ,ΡΑ)和多克隆兔抗人 GPR35(Cayman Chemicals，Ann Arbor,MI)。人GPR35克隆可W从The Missouri S&T cDNA Resource Center (Ro 11a, MO)获得，该克隆是被克隆到pcDNA3. 1 +表达载体化if e Technologies, Carlsbad, CA)中 EcoRI (5'）和趾 ol (3'）处的 G 蛋白偶合受体 35(GPR35)(野生 型）的cDNA。利用PCR由人基因组DM扩增开放阅读框。插入序列大小= 930bp。基因库登录 号:AY275467。
[0110] BIGE 数据库
[0111] BIGE数据库的构建已经得到描述(3,27)。简单地说，在死后5小时内获得对应于人 体105个不同部位的组织或细胞。如所描述的那样制备RNA并使用其来制备cDNAW与U133 2.0基因阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA)杂交。将所得数据标准化，并使用对应于GPR35 (210264_at)的探针集来确定人体中GPR35的表达。
[0112] 定量实时PCR分析
[0113] 用Roche Li曲tcycler 480,使用基于Universal Probe UbraiT的系统（此处需 要Roche注释)生成定量实时PCR(qRT-PCR)数据。简单地说，使用Qiagen的RNeasy RNA纯化 试剂盒从THP-1细胞提取总RNA。使用等浓度的总RNA进行逆转录反应W产生cDNA(Qiagen， 化lencia，CA)。使用50ng的每种cDNA执行40个周期的PCR。每一反应使用基因特异性引物和 对应的化iversal Probe L化ra巧W定量检测每一组织样品中CX化17和对照基因转录物的 量。使用Gra地Pad Prism软件（见World Wide Web的.gra地pad.com)处理并分析结果。
[0114] 趋化作用检验
[0115] 使用24孔化answell迁移板（Corning, NY)进行趋化作用检验，运些板含有上部插 入物和下部小室。将含有200ng/mL重组趋化因子(R&D Systems,Minneapolis，MN)的600μ1 趋化作用缓冲液（C缓冲液）（不完全RPMI，Mediatech,Manassas,VA)添加到hanswell板的 底部小室中。运些检验中使用的化answell板具有5.0皿大小的孔(Corning, Corning, NY)。 除非另作说明，否则使用0.5-1.OX ΙΟ6个细胞作为测试的所有细胞系的细胞输入数量。在 将其添加到顶部插入检验板之前，在C缓冲液中洗涂细胞Ξ次。该检验在37°C和5%C02下解 育18到20小时。使用显微镜定期监测趋化作用。当观察到趋化作用时，用200ng/mL百日咳毒 素(PTX)(Sigma，Saint Louis，M0)或ΙΟμΜ前列腺素 E2(PGE2)(Sigma)处理细胞24小时，随后 开始趋化作用检验。
[01W 通过流式细胞术对趋化作用进行定量
[0117]运一方案改编自Prou壯oot等人(45)。简单地说，在趋化作用检验结束时，从所述 板的底部小室收集受趋化的细胞，在FACS管中进行离屯、，并且再悬浮于2(Κ)化的lx PBS中。 可W通过在20化L的lx PBS中制备范围从1.0 X 106到1.0 X 102个细胞的10倍细胞稀释液来 产生标准品。标准品及所有受趋化细胞的细胞计数被记录作为在30秒内计数的事件数量。 由于已知标准品的细胞的精确数量，故使用其细胞计数来生成标准曲线。使用由运一标准 曲线得到的趋势线和等式来计算所分析的每一细胞系或原代细胞中受趋化的细胞的相对 数量。运些定量实验中使用了FACShlibur机器(Becton Dickinson,Rranklin Lakes ,NJ)。 [011引 GPR35转染检验
[0119]将Ba/F3细胞再悬浮于巧tomix缓冲液（120mM KCl，0.15mM CaCl2,25mM 皿PES/ ΚΟΗ,ρΗ 7.6,2mM EGTA，5mM MgCl2)中，最终密度是2X107个细胞/mL，将500化悬浮液转移到 0.4cm电击管化SA Scientif ic，0cala，FL)中。接着，将二十微克PCDNA3.1+/GPR35 DNA转染 到细胞中。在该电击管中，将质粒DNA添加到细胞悬浮液中并通过轻柔地抽吸进行混合。随 后使用Bio-Rad化ercules，CA)脉冲系统使混合物暴露于电容是96化F的300V的单次电脉 冲。在37°C(5%C02氛围）下将细胞回收于完全培养基中，保持48小时，随后收集并进行化" 调动检验。
[0120] 巧调动检验
[0121] 为了在THP-1或转染的Ba/F3细胞中进行巧研究，在37°C下，在无补充的RPMI 1640 中向5 X 107个细胞/mL负载最终染料浓度是10皿ol/L的calcium green-1-AM和fura-red- AM化ife Technologies,Carlsbad,CA)，保持30分钟。在含有0.14g/L CaCb的汉氏平衡盐 溶液化anks balanced salt solution,皿SSiCorning-Cellgro)中洗涂经过负载的细胞一 次，将其W1.5 X 106个细胞/mL再悬浮于皿SS中并立即放到冰上，避光保存。在活化之前，使 细胞升溫到37°C，保持15分钟。在30秒的数据采集之后，通过添加不同量的人重组CX化17 (R&D Systems, Minneapolis，MN)来刺激细胞，在最后阶段使用100μΜ离子霉素（Sigma, Saint Louis,MO)进行刺激，W确定所分析的每个细胞群的活力，运表示阳性对照物刺激 物。在添加活化剂之前和之后，借助于FACS化libur流式细胞仪(Becton Dickinson)测量个 别细胞中calcium green与fura red巧光比率，并借助于Flowjo FACS软件（Tree Star Inc.)进行分析。数据是W任意单位表示的巧光度(相对细胞内巧)相对于时间的变化。 [01。] 实施例3:
[0123] 术语"表位"意指能够特异性结合到抗体或结合结构域(如基于支架的蛋白质或受 体蛋白质的一个或多个环)的蛋白质决定子。
[0124] 运些表位通常由分子的