使用电穿孔的哺乳动物基因修饰方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及有效地修饰哺乳动物的任意祀基因的技术，该技术包括:将具有完整 透明带的原核阶段哺乳动物合子浸入含有某种RNA分子的溶液中，和通过在Ξ个步骤中施 加多个方波脉冲来执行电穿孔处理，其中在预定范围内调节第一个电脉冲的总电能。
【背景技术】
[0002] 迄今，为了执行哺乳动物的基因修饰已经必须使用ES细胞，且因此除了一些可W 利用其ES细胞系的动物(诸如小鼠）W外已经非常难W建立遗传修饰的个体。但是，近年来， 已经出现了设及利用例如锋指核酸酶(ZFN)、TALEN或CRISPR的新基因修饰技术，W使哺乳 动物中的基因组编辑通过仅胚胎操作容易地执行，而不使用任何ES细胞(参见，例如，非专 利文献1-4)。
[0003] 设及利用ZFN等的技术是一种突破性技术，其使用基因组上的特定序列作为祀标 且通过核酸酶的作用来实现特定基因的破坏或同源重组。另外，该技术使祀序列的基因修 饰(基因组编辑)能够容易地执行，即使对于不存在确立的ES细胞系统的任何动物。
[0004] 但是，基于ZFN等的基因组编辑技术的利用需要将核酸转移进合子中的操作。所述 核酸转移操作通常通过需要特殊装置(显微操作器)的显微注射方法(显微注射)来执行。也 就是说，相关技术方法已经指出了基于ZFN等执行等的基因组编辑技术中的成本问题。
[0005] 另外，需要熟练技术人员来执行显微注射方法，并且已经指出了依赖于实验者的 低再现性问题。
[0006] 如上所述，基于ZFN等的基因组编辑技术用于哺乳动物的用途设及成本和技术问 题。因此，需要可W被任何人容易地采用且可W在哺乳动物中高效率地实现基因组编辑的 技术。
[0007] 引文列表 非专利文献
[NPL 1] Tomoji Mashimo: New Gene Modification Technology "Zinc Finger Nuclease (ZFN)": KAGAKU TO SEIBUTSU, Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry编，第220-222页（2011)
[NPL 2] Tomoji Mashimo和Tadao Serikawa: Zinc Finger Nuclease (ZFN): Cell Technology 第 31 (3)卷第 296-301 页（2012)
[NPL 3] Genome Editing Revolution (监督人：Takashi Yamamoto和Sumihare Noji): Cell Technology第32 (5)卷（2013)
[NPL 4] Ryan Μ. Walsh和Konrad Hochedlinger, PNAS,第110卷，第39期，15514- 15515 (2013)。
【发明内容】
[000引技术问题 本发明的一个目的是开发一种技术，其能够仅仅通过非常简单的操作来利用可广泛应 用于哺乳动物的技术，该技术不需要利用ES细胞，并且其包括通过祀向基因组上的特定序 列来修饰特定基因（基于ZFN等的基因组编辑技术）。
[0009] 本发明的另一个目的是W高效率和良好再现性建立遗传修饰的哺乳动物个体，不 限于特定哺乳动物物种。
[0010] 问题的解决方案 本发明的发明人为了完成上述目的已经进行了广泛研究，并由此已经发现，可W如下 有效地修饰充当祀标的期望的哺乳动物基因：将具有完整透明带的原核阶段哺乳动物合子 浸入含有某种RNA分子的溶液中；然后执行电穿孔处理，其包括，在使它的总电能落在预定 范围内的条件下施加具有高电压的方波电脉冲(第一电脉冲)短时间段，然后施加具有低电 压的方波电脉冲(第二电脉冲)长时间段2次或更多次，然后施加具有低电压的、具有与所述 第二电脉冲相反的极性的方波电脉冲(第Ξ电脉冲）长时间段2次或更多次(在Ξ个步骤中 的多个方波脉冲:参见图1和图2)。
[0011] 具体地，本发明的发明人已经发现，W下技术特征在那些条件下是特别重要的： "使用处于原核阶段的哺乳动物合子作为合子"；"使用处于具有透明带状态的合子作为合 子"；"使用具有特定序列的RNA分子作为核酸分子物质"；和"在预定条件内的电脉冲条件下 在Ξ个步骤中施加多个方波脉冲作为电穿孔的电条件"。
[0012] 本发明的发明人还已经发现，该技术是可广泛应用于一般哺乳动物的技术，不限 于特定哺乳动物物种。
[OOU]应当指出，在相关领域中，没有报道运样的例子:其中通过对'合子'进行'电穿孔' 来建立遗传修饰的哺乳动物个体（已经通过基因转移经历基因组编辑的个体）。例如，在 Joanna B. Grabarek等人，Genesis 32第269-276页（2002)和Hui Peng等人，化0S 0肥 vol. 7 (8) e43748第1-13页（2012)中，报道了其中将DNA或dsRNA转移进合子中的一个例 子。但是，那些文献仅仅报道了转移的核酸的'短暂'基因表达。
[0014] 前述内容的一个可能的原因是W下问题:相关技术电穿孔经常使用运样的方法： 其设及从采用"衰减波系统（指数系统Γ的输出装置施加电脉冲一次（参见，例如， Siimogawara, K.等人，Genetics 148第 1821-1828页（1998))，因此基因转移效率非常 低。
[0015] 另外，在上述的Joanna B. Grabarek等人和Hui Peng等人中，用酸性台氏液 (Tyrode's solution)处理W除去合子的透明带（其造成基因转移中的屏障），其目的是提 高通过电脉冲处理来转移DNA等的效率。但是，当将除去了它的透明带或使它的透明带变薄 的合子移植进假妊娠雌性的输卵管中时，存在运样的问题:合子正常生长成后代的效率显 著地下降。也就是说，存在运样的问题:通过执行用于提高基因转移效率的处理，相反地抑 制正常生长。
[0016] 另外，作为哺乳动物细胞(培养的细胞等)的电穿孔技术，已经公开了运样的方法： 其包括施加两类电脉冲W执行向哺乳动物细胞中的有效基因转移(参见S址harev S.I.等 人，Biophys. J. 63第1320-1327页（1992))。但是，也在该方法中，没有减轻需要除去或薄 化透明带W便实现合子的足够转移效率的问题。
[0017] 已经基于上述发现做出了本发明。
[0018] 也就是说，根据第一方面的发明设及一种哺乳动物基因修饰方法，其包括： 将如在W下项目（A)中定义的合子浸入含有如在W下项目（B)中定义的核酸分子的溶 液中； 将如在W下项目（C)中定义的方波电脉冲施加于所述溶液1次或2次或更多次，使得所 述方波电脉冲具有从0.2 J/100 yL至7.5 J/100 yL的总电能； 然后施加如在W下项目化)中定义的方波电脉冲2次或更多次;和 然后施加如在W下项目巧)中定义的方波电脉冲2次或更多次： (A) 具有完整透明带的、除了人W外的哺乳动物的原核阶段合子； (B) RNA，其起作用从而W序列特异性的方式表现出对基因组DNA的任意区域的内切核 酸酶活性； (C) 具有375 V/cm或更高的电压/脉冲的方波电脉冲； (D) 具有250 V/cm或更低的电压/脉冲和从0.01 J/100化至3.6 J/100化的电能/脉 冲的方波电脉冲;和 (E) 其极性与如在项目（D)中定义的电脉冲相反且具有250 V/cm或更低的电压/脉冲和 从0.01 J/100 yL至3.6 J/100 yL的电能/脉冲的方波电脉冲。
[0019] 另外，根据第二方面的发明设及根据第一方面的方法，其中如在项目（B)中定义的 核酸分子包括如在W下项目（bl)中定义的核酸分子和如在W下项目（b2)中定义的核酸分 子： (bl)编码蛋白的mRNA，所述蛋白具有序列特异性的DNA-结合结构域和当与如在W下项 目化2)中定义的限制性酶活性结构域形成二聚体时表现出限制性酶活性的结构域;和 (b2)编码蛋白的mRNA，所述蛋白具有序列特异性的DNA-结合结构域和当与如在项目 (bl)中定义的限制性酶活性结构域形成二聚体时表现出限制性酶活性的结构域，所述DNA- 结合结构域是如在项目（bl)中定义的蛋白所结合的基因组DNA区域末端附近的区域且结合 其互补链。
[0020] 另外，根据第Ξ方面的发明设及根据第一方面的方法，其中如在项目（B)中定义的 核酸分子包括如在W下项目（b3)中定义的核酸分子和如在W下项目（b4)中定义的核酸分 子： 化3)指导RNA，其具有基因组DNA的任意碱基序列的互补序列和特异性地结合如在W下 项目化4)中定义的蛋白的序列;和 化4)编码蛋白的mRNA，所述蛋白当特异性地结合如在项目（b3)中定义的指导RNA时表 现出内切核酸酶活性。
[0021] 另外，根据第四方面的发明设及根据第一至第Ξ方面中的任一个的方法，所述方 法还包括，在执行电穿孔W后，将得到的合子在培养基中培养成2-16细胞阶段胚胎，然后将 所述胚胎移植进哺乳动物的相同物种或近似物种的雌性的输卵管或子宫中W提供后代。
[0022] 另外，根据第五方面的发明设及根据第一至第四方面中的任一个的方法，其中所 述溶液还含有编码外切核酸酶1化xol)的mRNA。
[0023] 另外，根据第六方面的发明设及根据第一至第五方面中的任一个的方法，其中所 述哺乳动物包括属于晒齿目的物种。
[0024] 另外，根据第屯方面的发明设及根据第一至第六方面中的任一个的方法，其中将 如在项目（D)中定义的方波电脉冲的施加执行5次或更多次，和将如在项目化）中定义的方 波电脉冲的施加执行5次或更多次。
[0025] 另外，根据第八方面的发明设及根据第一至第屯方面中的任一个的方法，其中所 述基因修饰通过基因的破坏而造成功能的缺失或抑制。
[0026] 另外，根据第九方面的发明设及一种建立遗传修饰的哺乳动物个体的方法，其包 括使用第一至第八方面中的任一个的方法。
[0027] 发明的有利效果 本发明能够仅仅通过非常简单的操作来利用可广泛应用于哺乳动物的技术，该技术不 需要利用ES细胞，并且其包括通过祀向基因组上的特定序列来修饰特定基因（基于ZFN等的 基因组编辑技术）。
[0028] 本发明还能够W高效率和良好再现性建立遗传修饰的哺乳动物个体，不限于特定 哺乳动物物种。
[0029] 附图简述 图1的概念图用于解释电穿孔处理，其包括在Ξ个步骤中施加多个方波脉冲。垂直轴代 表电压(V)，且水平轴代表时间（毫秒）。在图1中，"Pp"代表穿孔脉冲，且叮P"代表转移脉冲。
[0030] 图2的概念图用于解释通过电穿孔处理将mRNA转移进合子中的机制，其包括在Ξ 个步骤中施加多个方波脉冲。在图2中，"Pp"代表穿孔脉冲，且叮P"代表转移脉冲。左图的概 念图用于解释，穿孔脉冲在透明带和细胞膜中形成微孔。中图的概念图用于解释，转移脉冲 1造成mRNA迁移进合子的细胞质中。右图的概念图用于解释，转移脉冲2 (极性发生变化的 脉冲)造成mRNA进一步迁移进合子的细胞质中。
[0031] 图3是在实施例中使用的电脉冲产生装置的拍摄照片图像。图3(A)是玻璃室的照 片图像，所述玻璃室具有固定在其上面的培养皿销板电极。图3(B)是电脉冲产生装置 肥PA21 (商标)的主体的照片图像。
[0032] 图4是合子的拍摄照片图像，其已经在测试实施例1中在所述合子中转移进四甲基 罗丹明标记的糊精。上行中的照片图像是用显微镜在明视场中拍摄的照片图像。下行中的 照片图像是用巧光显微镜拍摄的照片图像。
[0033] 图5是在测试实施例5中通过转移祀向II化g基因的ZFN mRNA而建立的敲除大鼠的 拍摄照片图像。在左侧显示了II化g基因敲除的大鼠。在右侧显示了野生型大鼠（F344/Stm 品系）。
[0034] 图6是测试实施例5中的ZFN的概念图，所述ZFN被设计成祀向11化g基因的第二个 外显子附近的特定区域。
[003引图7是测试实施例6中的TALEN的概念图，所述TALEN被设计成祀向I12rg基因的第 二个外显子附近的特定区域。
[0036] 图8是测试实施例7中的CRISPR-化s9系统的概念图，所述CRISPR-Cas9系统被设计 成祀向化y基因的特定区域。
【具体实施方式】
[0037] 在下面详细描述本发明的实施方案。
[0038] 本发明设及有效地修饰哺乳动物的任意祀基因的技术，该技术包括:将具有完整 透明带的原核阶段哺乳动物合子浸入含有某种RNA分子的溶液中，和通过在Ξ个步骤中施 加多个方波脉冲来执行电穿孔处理，其中在预定范围内调节第一个电脉冲的总电能。
[0039] [要进行基因转移的合子] 本发明的基因修饰技术是基本上使用"具有完整透明带的原核阶段哺乳动物合子"的 技术。
[0040] 原核阶段 要进行基因转移的合子需要处于"原核阶段(原核阶段胚胎的状态Γ。本文中使用的术 语'原核阶段'表示运样的合子状态:其中精子的核已经整合进卵的细胞质中，但是卵的核 和精子的核的融合尚未发生。通过显微术可W确定合子是否处于原核阶段。
[0041] 收集原核阶段合子的方法例如如下所述。当允许经受超数排卵处理的雌性个体与 相同物种的雄性个体彼此交配时，可W在交配后的天收集原核阶段合子。可选地，也可W通 过将没有执行交配就收集的未受精卵进行精子卵浆内注射来人工得到原核阶段合子。
[0042] 在本发明中，通过执行向原核阶段的合子中的基因转移，可W得到运样的动物:其 中个体的所有细胞已经W均匀方式进行了遗传修饰。
[0043] 相反，在对已经经过原核阶段的合子进行基因转移的情况下，产生嵌合个体(其中 存在进行了基因转移的细胞和没有进行基因转移的细胞）的可能性显著增加，因此运样的 情况不是优选的。另外，在对未受精卵进行基因转移的情况下，正常发育变得难W发生，运 不是优选的。
[0044] 透明带 要进行基因转移的合子需要处于"具有透明带的状态"。本文中使用的术语'透明带' 表示糖蛋白的基质结构(ma化ix struc化re),其充当用于覆盖和保护哺乳动物的卵母细胞 或合子的外层。
[0045] 在胎盘哺乳动物的早期发育中，受精后的早期胚胎需要在被运样的结构物理上保 护的同时生长成胚泡。在运点上，将透明带视作在哺乳动物的早期胚胎的正常生长中起重 要作用的结构。
[0046] 应当指出，生长成胚泡W后的胚胎会经历透明带破裂的解化过程和植入子宫壁中 W形成胎盘。