于含 0. 1 %BSA的Tris-HCL，pH7. 2)和浓度增加的mAbs。 将板在室温下温育90分钟。每次温育步骤期间，用清洗缓冲液（10mMTris-HCl，pH7. 2 和0? 05%Tween20)清洗板。利用AttoPhos底物（Roche)检测AP-Nogo66的结合，并在 Polarstar(BMG)装置中测量荧光单位。图2显示在0分钟和30分钟针对mAb50和mAb51 所获测量值的相对荧光单位（RFU)。结合被mAb50和mAb51完全阻断，而抑制AP-Nogo66 与人NgR-Fc结合的50%需要10倍摩尔过量的所述两种抗体。剩余抗体，除了mAb1外的 Mab52、Mab53、Mab54、Mab55、Mab56、Mab57、Mab58、Mab59、Mab60、Mab61 和Mab 62,以类似于mAb50和51的浓度范围阻断AP-Nogo66与可溶性Nogo受体的结合。
[0155] 实施例5.mAB50和mAB51与AP-N〇g〇66结合HEK293f细朐h表汰的人和大鼠NgR 的竞争
[0156] 为进一步表征如实施例1所述产生的mAbs的结合和竞争特性，使用瞬时表达 人或大鼠NgR的HEK293f细胞的悬液。转染后48小时，将细胞种于96孔微量滴定板 (NuncMaxisorb)，并用磷酸缓冲盐溶液（包含1 %BSA的PBS)清洗。添加1yg/200y1 AP-Nogo66 (终浓度40nM)和不同浓度的单克隆抗体（20yg，4,0. 8和0. 16yg/200y1)，并 在4°C温育1小时。将具有相同同种型的单克隆抗体作为阴性对照。AP-N〇g〇66的结合利用 抗碱性磷酸酶抗体（Sigma)检测，所述抗体用Zenon小鼠IgG2a标记试剂盒（Invitrogen) 标记有AlexaFluor。在4°C温育二抗1小时。温育结束后，用PBS清洗细胞并进行FACS 分析。在20yg/200y1浓度（20倍摩尔过量），多克隆抗NgR抗体和NgR-Fc(均购自R&D 578七61118)封闭60%到70%的4?4(^〇66结合，而滅&50和51封闭大约90%的4?4(^〇66 结合。对于mAb50和mAB51在浓度为20mg的大鼠和人NgR中的抗体同种型对照显示于 图3a。抗体同种型对照用黑线表示（最左边的信号），无任何抗体条件下的AP-N〇g〇66结 合用红线表不（最右边的信号）。人和大鼠NgR与AP-Nogo66的结合非常一致。在所述两 种抗体均存在的条件下，AP-N〇g〇66荧光在表达人和大鼠NgR的HEK293f细胞中变为较低 的强度（阴影；绿色区域）。利用不同的抗体浓度，通过Kolmogorov-Smirnov(K-S)分析法 确定，对于人和大鼠NgR来说利用2倍摩尔过量的单克隆抗体50和51对AP-N〇g〇66观察 到IC5。。
[0157] 图 3b显示不同浓度mAb50 和mAb51(即 20. 0yg，4. 0,0. 8 和 0. 16yg/200yl) 的结果。本发明的其他mAbs以类似于mAb50和51的浓度范围阻断AP-Nogo66与HEK293f 细胞表达的Nogo受体的结合。参见表5,其指示AP-N〇g066结合HEK293f细胞表达的人NgR 的50 %竞争所需的抗体量。
[0158] 表5.AP-N〇g〇 66与人和大鼠HEK293f细朐的竞争。
[0159]
[0160] 实施例6.NTera2细朐中mAB50和mAb51对N〇g〇66诱导的轴突牛长抑制的中和。
[0161] 利用人NTera-2细胞和嗤齿类动物（小鼠皮层神经兀，大鼠皮层神经兀和大鼠小 脑颗粒神经元）细胞类型，及AP-N〇g〇66和髓磷脂作为配体，在紧密模拟体内情况的功能性 系统中研究本发明抗体对轴突生长的影响。
[0162] 利用视黄酸可以将NTera2细胞（人畸胎癌细胞系）分化为神经元样细胞，其表达 NgRmRNA(PCR)和细胞表面蛋白，这通过多克隆抗体与NgR的适度结合证实（FACS结合）。 分别利用同种型对照抗体（无阴影区）及mAb50和mAb51 (阴影区），通过FACS分析法检 测NTera-2中天然人NgR在细胞表面的表达（图4)。通过阴影区显示两种抗体与Ntera-2 细胞表面表达的NgR的结合。
[0163] 在尽可能接近人神经元的体外系统中分析这些分化细胞中的轴突生长或生长锥 萎缩。将NTera2 细胞（来自GermanNationalResourceCenterforBiologicals，DMSZ，Braunschweig)解冻，种于含DMEM培养基（Gibco#31966-021+10%胎牛血清（FCS)+5%马血 清（PS))的175cm2培养瓶（Greinerbi〇-〇ne#660175)中。培养数天后，重新种植细胞。为 此目的，用PBS(Gibco#14190-094)清洗细胞一次，再用胰蛋白酶/EDTA(Gibco#25300-054) 清洗，与胰蛋白酶/EDTA温育5分钟。为了进行分化，重悬细胞，将2. 5X106个细胞种于 175cm2瓶，所述瓶中含DMEM(Gibco31966-021，Lot.Nr. 3092594)加 10%FCS+5%PS，加 1% 青霉素/链霉素（5000/5000单位/mL)，加终浓度10yM的视黄酸（SIGMA#R2625)。
[0164] 为了进行分化，在3周时间内，每周两次向NTera2细胞中添加终浓度10yM的视 黄酸（SIGMA#R2625)。分化21天后，重新种植细胞。为此目的，用PBS清洗细胞一次，再用 胰蛋白酶/EDTA清洗，然后与胰蛋白酶/EDTA温育5分钟。将细胞重悬，按1 : 6拆分，， 种于 6 个含DMEM(Gibco31966-021，Lot.Nr. 3092594)+10%FCS+5%PS+1%PenStr印）的 175cm2瓶2-3天。2-3天后细胞用PBS清洗，物理法解离，在lOOOrpm离心5分钟，重悬于 Neurobasal培养基（Gibco#21103-049)加 2mML-谷氨酰胺（Gibco#25030-024)加青霉素 / 链霉素加B27_Supplement)，在Erlenmeyer烧瓶中（Corning#431143)预聚集。然后将 106 细胞/mL添加到 2X15mL聚集培养基（Neurobsalmedium(Gibco#21103-〇49)加 2mML-谷氨 酰胺（Gibco#25030-024)加青霉素/链霉素加B27-Supplement))，37°C5%C02条件下温和 搅动过夜，并种于用抑制型和对照底物预包被的96孔板（BiocoatPoly-D-LysinCellware 96-WellBlack/ClearPlateBectonDickinson#354640(35 6640))。对于抑制型底物来 说，96孔板的一半用溶于无菌PBS的100yLAP_Nogo66 (AP_Nogo66浓度是15yg/mL)加 层粘连蛋白（Sigma，L-2020，Lot014K4060,（母液lmg/mL))预包被；每孔层粘连蛋白的最 终量是20yg。对于允许型底物（permissivesubstrate)来说，板的另一半用lOOyl层 粘连蛋白（20yg)包被。温育2小时后，板用PBS清洗两次，将50y1预聚集的细胞悬液种 于添加40y1培养基的每孔。板在37°C温育2小时，最终添加10y1预稀释的mAb50或 mAb51溶液，得到1到100yg/mL之间的最终抗体浓度。将细胞在37°C，5% 0)2条件下温 育过夜，之后那天用2%多聚甲醛（SIGMA#P-6148)固定，4°C保存用于后续分析。利用软件 AxioVisionLERel.4. 1进行轴突生长的分析，借此使用标准鉴定参数（聚集区及聚集区& 轴关生长区）。
[0165] 利用如上所述的方法定量来自NTera2聚集物的轴突生长。结果显示于图5,在 2yg/ml的mAb50和1yg/ml的mAb51处观察到轴突生长的显著改善。对Nogo66治疗的显 著性：* =P-值< 0. 05 ;*** =p-值< 0. 001。
[0166] 对于抗体Mab52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,60,61和62来说，也获得轴突生长抑制 的改善。Mabl和Mab4不改善AP-Nogo66对轴突生长的抑制。
[0167] 实施例7.hNgR的缺失突夺体：抗体的表汰、纯化和结合。
[0168] 通过缺失C末端氨基酸以防止GPI-接头形成（最后450个氨基酸）和膜吸附，及 利用有可能增加分泌蛋白量的分泌信号，可以将hNgR表达为可溶性蛋白。使用的表达系统 基于表达质粒在293F细胞中的瞬时转染。利用Ni-NTA(Nickel-次氮基三乙酸）珠子捕获 His标记的分泌蛋白。通过PAGE和利用his标记无关蛋白（RGMA-His)作为阴性对照的 Western印迹，分析洗脱蛋白的纯度和大小。为了更好的调整这些制品中的NgR蛋白，利用 预期能检测所有缺失突变体的针对hNgR的多克隆抗体（AF1208)通过斑点印迹测量NgR的 量。利用针对不同NgR缺失突变体的蛋白校正量进行斑点印迹。斑点印迹用于所列抗体的 免疫检测。
[0169] 利用表达NgR缺失突变体的293F细胞的细胞培养上清作为未纯化NgR的来源，进 一步表征抗体与NgR缺失突变体的结合。
[0170] (i)根据Fournier等（TruncatedSolubleNogoReceptorBindsNogo_66and BlocksInhibitionofAxonGrowthbyMyelin(截短的可溶性Nogo受体结合Nogo-66 并阻断髓磷脂对轴突生长的抑制）；AlysonE.Fournier，GrahamC.Gould，BettyP.Liu， StephenM.Strittmatter；TheJournalofNeuroscience,October15,2002,22 (20)： 8876-8883)制备NgR缺失突变体。文献中（Fournier等人）已经描述了人NgR的七（7) 种缺失突变体。从pSecTag2AIgK/hNgR27-450/Myc/His产生7种突变构建体。该构建体 在pSecTag2A载体中包含与IgK前导肽融合的人NgR的氨基酸27-450的编码区及C末端 Myc-和His标签。产生下列构建体：
[0171] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/Myc/His
[0172] ?PSecTag2AigK/hNgR58-450/Myc/His
[0173] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A58-106/Myc/His
[0174] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/Al〇6-155/Myc/His
[0175] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A155-202/Myc/His
[0176] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A203-250/Myc/His
[0177] ?PSecTag2AigK/hNgR27-450/A260-310/Myc/His
[0178] ?PSecTag2AigK/hNgR27-310/Myc/His
[0179] 利用QuikChangeIIxL定点诱变试剂盒（Stratagene，#200521)产生除 PSecTag2AigK/27-310/Myc/His以外的所有构建体，并在E.coliXLlOGold细胞中进行转 化。对于pSecTag2AigK/NgR/27-310/Myc/His来说，扩增编码序列的相应区域并将其克隆 入pSecTag2A。下列诱变和扩增引物用于缺失NgR编码区的不同部分。
[0180] 1.pSecTag2AigK/hNgR58-450/Myc/His
[0181] Mey1008:正义引物
[0182] GCCAGGCGCGCCGTACGAAGCTTATGCGCCAGCCAGCGCATCTTCCTGCACGGC
[0183] 载体序列
[0184] hNgR序歹!丨，起始于氨基酸A58
[0185] Mey1009:反义引物
[0186] GCCGTGCAGGAAGATGCGCTGGCTGGCGCATAAGCTTCGTACGGCGCGCCTGGC
[0187] 载体序列
[0188] hNgR序列，起始于氨基酸A58
[0189] 2.pSecTag2AigK/hNgR27-450/A58-106/Myc/His
[0190] Mey1014:正义引物
[0191] GCTGTGCCCGTGGGCATCCCTGCTGCCCTCCTGGAGCAGCTGGACCTCAGCGATAATGC
[0192] hNgR序列，直至氨基酸A58
[0193] hNgR序列，起始于氨基酸L106
[0194] Mey1015:反义引物
[0195] GCATTATCGCTGAGGTCCAGCTGCTCCAGGAGGGCAGCAGGGATGCCCACGGGCACAGC
[0196] hNgR序列，直至氨基酸A58
[0197] hNgR序列，起始于氨基酸L106
[0198] 3.pSecTag2AigK/hNgR27-450/Al〇6-154/Myc/His
[0199] Mey1021 :正义引物
[0200] GCGGCTGCCTTCACTGGCCTGGCCGCCCTGCAGTACCTCTACCTGCAGGACAACGC
[0201] hNgR序列，直至氨基酸A105
[0202] hNgR序列，起始于氨基酸A155
[0203] Mey1022:反义引物
[0204] GCGTTGTCCTGCAGGTAGAGGTACTGCAGGGCGGCCAGGCCAGTGAAGGCAGCCGC
[0205] hNgR序列，直至氨基酸
[0206] hNgR序列，起始于氨基酸_
[0207] 4.pSecTag2AigK/hNgR27-450/A155-202/Myc/His
[0208] Mey1023:正义引物
[0209] CGGGGCTGTTCCGCGGCCTGGCTAGCCTCGACCGTCTCCTACTGCACCAGAACCGC
[0210] hNgR序列，直至氨基酸MM
[0211] hNgR序列，起始于氨基酸S203
[0212] Mey1024:反义引物
[0213] GCGGTTCTGGTGCAGTAGGAGACGGTCGAGGCTAGCCAGGCCGCGGAACAGCCCCG
[0214] hNgR序列，直至氨基酸A154
[0215] hNgR序列，起始于氨基酸S203
[0216] 5.pSecTag2AigK/hNgR27-450/A203-250/Myc/His
[0217] Mey1025:正义引物
[0218] GAGCGCGCCTTCCGTGGGCTGCACGCCCTGCAGTACCTGAGGCTCAACGACAACC
[0219] hNgR序列，直至氨基酸H202
[0220] hNgR序列，起始于氨基酸
[0221] Mey1026:反义引物
[0222] GGTTGTCGTTGAGCCTCAGGTACTGCAGGGCGTGCAGCCCACGGAAGGCGCGCTC
[0223] hNgR序列，直至氨基酸_
[0224] hNgR序列，起始于氨基酸A251
[0225] 6.pSecTag2AigK/hNgR27-450/A260-310/Myc/His
[0226] Mey1027:正义引物
[0227] GCGTGCCCTGCAGTACCTGAGGCTCAACGACGTGGCCACCGGCCCTTACCATCCCATCTG
[0228] hNgR序列，直至氨基酸D259
[0229] hNgR序列，起始于氨基酸V311
[0230] Mey1028:反义引物
[0231] CAGATGGGATGGTAAGGGCCGGTGGCCACGTCGTTGAGCCTCAGGTACTGCA
[0232] hNgR序列，直至氨基酸D259
[0233] hNgR序列，起始于氨基酸mi
[0234] 7.pSecTag2AigK/hNgR27-310/Myc/His
[0235] Mey1016:正义引物
[0236] CCCCAAGCTTATGCCCAGGTGCCTGC
[0237] hNgR序列，起始于氨基酸￡21
[0238] Mey1030:反义引物
[0239] CCCCGAATTCCAGCGCAGCCCTGCAGGTC
[0240] hNgR序列，直至氨基酸
[0241]