reCollection(Manassas，Virginia，USA)获得的SP-2 或X63_Ag8_653 细胞。用 于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述（K〇zb〇r，J. Immunol. 133:3001(1984) ;Brodeur等人，〈〈MonoclonalAntibodyProductionTechniques andApplications》，51-63,MarcelDekker,Inc.，NewYork，1987)〇
[0101] 对于其中生长着杂交瘤细胞的培养基，测定培养基中针对抗原的单克隆抗体的生 成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定，诸如放射性免疫测定法（RIA)或酶联免 疫吸附测定法（ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
[0102] 单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem. 107:220 (1980) 的30Scatchard分析来测定。
[0103] 在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所 述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养（Goding，《Monoclonal Antibodies:PrinciplesandPractice》，59-103，AcademicPress，1986)〇适于这一目的 的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤 进行体内培养。
[0104] 可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-S印harose、羟磷灰石层析、凝 胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
[0105] 编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序（例如使用能够特异性结 合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针）。杂交瘤细胞是所述DNA的优选来 源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到宿主细胞中，诸如原本 不产生免疫球蛋白蛋白质的大肠杆菌细胞、猴C0S细胞、中国仓鼠卵巢（CH0)细胞或骨髓 瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的 重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.OpinioninImmunol. 5:256-262(1993)和 Pluckthun,Immunol.Revs. 130:151-188(1992)〇
[0106] 另一种生成针对CDH3反应性的特异性抗体或抗体片段的方法是用CDH3蛋白 或肽筛选在细菌中表达的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库。例如，可以使用噬 菌体表达文库在细菌中表达整个Fab片段、VH区和Fv区。参见例如Ward等，Nature， 341:544-546 (1989);Huse等，Science，246:1275-1281 (1989);及McCafferty等，Nature， 348:552-554(1990)。用例如⑶H3肽筛选此类文库能鉴定出与⑶H3反应性的免疫球蛋白 片段。或者，可使用SCID-hu小鼠（可得自Genpharm)来生成抗体或其片段。
[0107]在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature348:552-554(1990) 所述技术构建的抗体菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等，Nature 352:624-628 (1991)和Marks等，J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991)分别描述了使用噬菌 体文库分离鼠源和人源抗体。后续出版物描述了通过链改组（Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992))，以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组 (Waterhouse等，Nuc.AcidsRes. 21:2265_2266(1"3))，生成高亲和力（nM范围）的人源 抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方 法。
[0108] 还可以修饰DNA，例如通过用人重链和轻链恒定区的编码序列替代同源鼠源序列 (美国专利 4, 816, 567;Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851 (1984))，或通过共 价偶联免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。
[0109] 典型地，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一 个抗原结合位点的可变域，以产生这样的嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的 一个抗原结合位点，和对另一种不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
[0110] 本发明提供适合于治疗或诊断疾病，和/或抑制表达⑶H3的细胞生长的抗体。本 发明还提供适于诊断CDH3相关疾病的抗体。在本发明中，成功地建立了鼠源单克隆抗体克 隆#3、#4和#5,而且这些抗体，尤其是#3,被证明可有效抑制表达⑶H3的细胞（例如癌细 胞）生长。进一步，这些抗体在它们的可变区中没有糖基化位点。该性质对于治疗药的开 发是有利的，因为它可以支持抗体的均一性。
[0111] 此外，在本发明中，成功建立了克隆#6的没有糖基化位点的变体。克隆#6已经被 证明是具有抑制多种表达CDH3的细胞生长的能力的抗体，但是它在H链V区的CDR2中具 有一个糖基化位点。本发明的变体的天冬酰胺残基被改变为丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或谷氨 酰胺残基。
[0112] 小鼠单克隆抗体#3、克隆#4和#5的H链V区的氨基酸序列分别示于SEQIDN0:4、 20、36。小鼠单克隆抗体克隆#3、克隆#4和#5的L链V区的氨基酸序列分别示于SEQID N0:12、28、44。进一步，克隆#6的变体的H链V区的氨基酸序列分别示于SEQIDN0:68、 72、76和80。克隆#6的变体的L链V区的氨基酸序列示于SEQIDNO:60。
[0113] H链V区和L链V区中所含的⑶R可以根据本领域公知的方法来确定。例如，Kabat 等人（KabatE.A.etal. (1991)SequenceofProteinsofImmunologicalInterest. 5th Edition)或Chothia等人（Chothiaetal.J.Mol.Biol. (1987) 196 ;901-917)描述的方法 通常被用来确定⑶R。
[0114] 因此，本发明提供抗体或其片段，包含H链V区和L链V区，其中所述H链V区和 L链V区选自下组：
[0115] (a)包含具有SEQIDN0:4所示的氨基酸序列的H链V区中所含的互补决定区 (⑶R)或与之功能上等同的⑶R的H链V区，以及包含具有SEQIDN0:12的氨基酸序列的 L链V区中所含的⑶R或与之功能上等同的⑶R的L链V区；
[0116] (b)包含具有SEQIDN0:20所示的氨基酸序列的H链V区中所含的⑶R或与之功 能上等同的⑶R的H链V区，以及包含具有SEQIDN0:28的氨基酸序列的L链V区中所含 的⑶R或与之功能上等同的⑶R的L链V区；
[0117] (c)包含具有SEQIDN0:36所示的氨基酸序列的H链V区中所含的⑶R或与之功 能上等同的⑶R的H链V区，以及包含具有SEQIDN0:44的氨基酸序列的L链V区中所含 的⑶R或与之功能上等同的⑶R的L链V区；和
[0118] (d)包含具有SEQIDN0:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H链V区中所含的 ⑶R或与之功能上等同的⑶R的H链V区，以及包含具有SEQIDN0:60的氨基酸序列的L 链V区中所含的⑶R或与之功能上等同的⑶R的L链V区，
[0119] 且其中所述抗体能够结合⑶H3多肽或其部分肽。
[0120] 在优选的实施方案中，CDR可根据Kabat定义（KabatE.A.etal. (1991)Sequence ofProteinsofImmunologicalInterest. 5thEdition)来确定。每个克隆的根据Kabat 定义确定的CDR如下所述。
[0121] 克隆#3的各CDR的氨基酸序列为H链V区中的CDR1:SFWIH(SEQIDN0:6)，CD R2:NIDPSDSETHYNQYFKD(SEQIDN0:8)和CDR3:GGTGFSS(SEQIDN0:10);L链V区中的 CDR1:KASQDIDSYLS(SEQIDN0:14)，CDR2:RANRLVD(SEQIDN0:16),和CDR3:LQYDEFPRT(SEQ IDNO:18)。
[0122] 克隆#4的各CDR的氨基酸序列为H链V区中的CDR1:SYWMH(SEQIDNO: 21)，CDR2:NIDPSDSETHYNQNFND(SEQIDN0:24)和CDR3:GGTGFAY(SEQIDN0:26); L链V区中的CDR1:KASQDINNYLG(SEQIDN0:30)，CDR2:RTDRLIE(SEQIDN0:32),和 CDR3:LQYDEFPRM(SEQIDN0:34)。
[0123] 克隆#5的各CDR的氨基酸序列为H链V区中的CDR1: SYWMH(SEQIDNO: 3 8)，CDR2:NIDPSDSETHYNQKFNDRA(SEQIDN0:40)和CDR3:GGTGFAY(SEQIDN0:42); L链V区中的CDR1:KASQDINNYLG(SEQIDN0:46)，CDR2:RTDRLIE(SEQIDN0:48),和 CDR3:LQYDEFPRM(SEQIDN0:50)。
[0124] 克隆#6的变体的各⑶R的氨基酸序列为H链V区中的⑶R1:SYWIH(SEQ IDN0:54),CDR2:EIDPSDSYTYYNQNFKG(SEQIDNO:70),EIDPSDTYTYYNQNFKG(SEQ IDN0:74),EIDPSDAYTYYNQNFKG(SEQIDN0:78)或EIDPSDQYTYYNQNFKG(SEQID N0:82)及CDR3:SGYGNLFVY(SEQIDN0:58);L链V区中的CDR1:SATSSVTYMY(SEQID NO:62),CDR2:RTSNLAS(SEQIDNO:64),和CDR3:QHYHIYPRT(SEQIDNO:66)。
[0125]因此，本发明还提供抗体或其片段，其中所述抗体包含H链V区和L链V区，其中 所述H链V区和L链V区选自：
[0126] (&)包含具有如3￡0 10勵:6所示的氨基酸序列的〇)1?1、具有如3￡0 10勵:8所 示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDN0:10所示的氨基酸序列的CDR3的H链V区，以 及包含具有如SEQIDN0:14所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQIDN0:16所示的氨基 酸序列的⑶R2、和具有如SEQIDN0:18所示的氨基酸序列的⑶R3的L链V区；
[0127] (b)包含具有如SEQIDN0:22所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDN0:24 所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQIDNO: 26所示的氨基酸序列的⑶R3的H链V区， 以及包含具有如SEQIDN0:30所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQIDN0:32所示的氨 基酸序列的⑶R2、和具有如SEQIDN0:34所示的氨基酸序列的⑶R3的L链V区；
[0128] (c)包含具有如SEQIDN0:38所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDN0:40 所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQIDNO:42所示的氨基酸序列的⑶R3的H链V区， 以及包含具有如SEQIDN0:46所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQIDN0:48所示的氨 基酸序列的⑶R2、和具有如SEQIDN0:50所示的氨基酸序列的⑶R3的L链V区；和
[0129] (d)包含具有如SEQIDN0:54所示的氨基酸序列的⑶Rl、具有如SEQID N0:70,74,78或82所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDN0:58所示的氨基酸序列 的⑶R3的H链V区，以及包含具有如SEQIDN0:62所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQ IDN0:64所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQIDN0:66所示的氨基酸序列的⑶R3的 L链V区。
[0130] 上述"包含具有如SEQIDN0:6所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDN0:8 所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQIDNO: 10所示的氨基酸序列的⑶R3的H链V区" 的H链V区（VH)的一个例子是具有如SEQIDN0:4所示的氨基酸序列的VH。上述"包含 具有如SEQIDN0:14所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQIDN0:16所示的氨基酸序列 的⑶R2、和具有如SEQIDN0:8所示的氨基酸序列的⑶R3的L链V区"的L链V区（VL) 的一个例子是具有如SEQIDN0:12所示的氨基酸序列的VL。
[0131] 上述"包含具有如SEQIDNO: 22所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDNO: 24 所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQIDNO: 26所示的氨基酸序列的⑶R3的H链V区" 的VH的一个例子是具有如SEQIDN0:20所示的氨基酸序列的VH。上述"包含具有如SEQ IDN0:30所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQIDN0:32所示的氨基酸序列的⑶R2、和具 有如SEQIDN0:34所示的氨基酸序列的⑶R3的L链V区"的VL的一个例子是具有如SEQ IDN0:28所示的氨基酸序列的VL。
[0132] 上述"包含具有如SEQIDN0:38所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDN0:40 所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQIDNO: 42所示的氨基酸序列的⑶R3的H链V区" 的VH的一个例子是具有如SEQIDN0:36所示的氨基酸序列的VH。上述"包含具有如SEQ IDN0:46所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQIDN0:48所示的氨基酸序列的⑶R2、和具 有如SEQIDN0:50所示的氨基酸序列的⑶R3的L链V区"的VL的一个例子是具有如SEQ IDN0:44所示的氨基酸序列的VL。
[0133] 上述"包含具有如SEQIDN0:54所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQID NO:70, 74, 78或82所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQIDNO:58所示的氨基酸序列的 CDR3的H链V区"的VH的一个例子是具有如SEQIDN0:68, 72, 76,或80所示的氨基酸序 列的VH。上述"包含具有如SEQIDN0:62所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQIDN0:64 所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQIDNO: 66所示的氨基酸序列的⑶R3的L链V区" 的VL的一个例子是具有如SEQIDN0:60所示的氨基酸序列的VL。
[0134]因此，在一个实施方案中，本发明提供抗体或其片段，其中所述抗体包含具有选 自SEQIDN0:4, 20, 36, 68, 72, 76和80的氨基酸序列的H链V区，和/或具有选自SEQID 勵:12、28、44和60的氨基酸序列的1链￥区。
[0135] 在优选的实施方案中，本发明的抗体包含：
[0136] (a)具有如SEQIDN0:4所示的氨基酸序列的H链V区，和具有如SEQIDN0:12 所示的氨基酸序列的L链V区；
[0137] (b).具有如SEQIDN0:20所示的氨基酸序列的H链V区，和具有如SEQIDN0:28 所示的氨基酸序列的L链V区；
[0138] (c)具有如SEQID N0:36所示的氨基酸序列的H链V区，和具有如SEQID N0:44 所示的氨基酸序列的L链V区；或
[0139] (d)具有如SEQID NOs:68, 72, 76或80所示的氨基酸序列的H链V区，和具有如 SEQID N0:60所示的氨基酸序列的L链V区。
[0140] 本发明的抗体可以通过常规方法制备。例如，所述抗体可以通过将编码抗体多肽 的多肽整合到合适的载体中，将该载体导入宿主，并根据常规基因重组技术从所述宿主产 生抗体来制备（参见，例如，Vandamme,A.M.etal.，Eur.J.Biochem. (1990) 192, 767-75) 〇
[0141] 编码本发明抗体的V区的多核苷酸的核酸序列可以从本发明的抗体的V区的 氨基酸序列推导出来。例如，SEQIDN0:3和11所示的核酸序列可以分别用作编码克 隆#3的VH和VL的核酸序列。例如，SEQIDN0:19和27所示的核酸序列可以分别用作 编码克隆#4的VH和VL的核酸序列。例如，SEQIDN0:35和43所示的核酸序列可以分 别用作编码克隆#5的VH和VL的核酸序列。例如，SEQIDN0:67、71、75或79,和59所 示的核酸序列可以分别用作编码克隆#6的变体的VH和VL的核酸序列。编码本发明抗 体的V区的多核苷酸可基于所述序列信息通过常规方法如固相技术（BeaucageSL&Iyer RP,Tetrahedron(1992)48, 2223-311;Matthesetal.，EMBOJ(1984)3, 801-5)和寡核苷酸 合成技术（Jonesetal.Nature(1986) 321, 522-5)来合成。
[0142] 编码抗体V区的多核苷酸整合到含有编码抗体恒定（C)区的多核苷酸的表达载体 中。
[0143] 为了制备本发明中使用的抗体，将编码抗体的多肽（抗体基因）整合到表达载体 中，使得抗体基因能够在表达控制元件（例如增强子、启动子）的控制下表达。用该表达载 体转化宿主细胞以表达抗体。
[0144] 在抗体基因的表达中，可以将编码H链的多核苷酸和编码L链的多核苷酸整合到 不同的表达载体中，然后用所得的重组表达载体共转化宿主细胞。或者，可以将编码H链的 多核苷酸和编码L链的多核苷酸一起整合到一个表达载体中，然后用所得的重组表达载体 转化宿主细胞（例如，W094/11253)。
[0145] 抗体基因可以用已知的方法表达。为了在哺乳动物细胞中表达，可以将常规的有 用启动子、要表达的抗体基因和多聚（A)信号（位于抗体基因的3'端的下游）可操作地连 接。例如，作为有用的启动子/增强子系统，可以使用人巨细胞病毒立即早期启动子/增强 子系统。
[0146] 其他启动子/增强子系统，例如，源自病毒（例如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和 猿病毒40(SV40))者和源自哺乳动物细胞者（例如人延伸因子la(HEFla)，也可以用于在 本发明中表达抗体。
[0147] 当使用SV40启动子/增强子系统时，可以容易地利用Mulligan等人 (Nature(1979) 277, 108-14.)的方法来进行基因表达。当使用HEF1a启动子/增强子系统 时，可以容易地利用Mizushima等人（NucleicAcidsRes. (1990) 18,5322.)的方法来进行 基因表达。
[0148] 对于在大肠杆菌中进行表达，可将常规可用的启动子、用于分泌目标抗体的信号 序列和抗体基因操作性连接在一起。作为启动子，可使用lacZ启动子或araB启动子。 当使用lacZ启动子时，可以按照Ward等人（Ward等，Nature(1098) 341，544-6;FASBE J. (1992)6,2422-7)所述的方法进行基因表达，而当使用araB启动子时，可以按照Better 等人（Better等，Science(1988) 240,1041-3)所述的方法进行基因表达。
[0149] 对于用于分泌抗体的信号序列而言，当须将目标抗体分泌到大肠杆菌周质间隙 时，可使用pelB信号序列（Lei，S.P?等，J.Bacteriol. (1987) 169,4379-83)。将分泌至周 质间隙的抗体分离出来，然后重折叠，使抗体呈合适构型。
[0150] 可使用来自病毒（例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒（BPV))等的复制 起点。为了增加宿主细胞系统中的基因拷贝数，表达载体还可含有选择标记基因，例如氨基 糖苷磷酸转移酶（APH)基因、胸苷激酶（TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶（Ecogpt)基因和二氢叶酸还原酶（dhfr)基因。为了产生本发明所用的抗体，任何表达 系统（包括真核细胞系统和原核细胞系统）都可使用。真核细胞包括已建立的动物细胞系 (例如哺乳动物、昆虫、霉菌和真菌、酵母）。原核细胞包括细菌细胞例如大肠杆菌细胞。优 选本发明所用的抗体在哺乳动物细胞（例如CHO、C0S、骨髓瘤、BHK、Vero和HeLa细胞）中 表达。
[0151] 然后，在体外或体内培养转化宿主细胞以产生目标抗体。可采用任何已知方法进 行宿主细胞的培养。本文所用的培养基可以是DMEM培养基、MEM培养基、RPMI1640培养基 或頂DM培养基。培养基可含有血清补充物，例如胎牛血清（FCS)。
[0152] 在重组抗体的产生中，除了上述宿主细胞外，转基因动物也可用作宿主。例如，将 抗体基因插入到原本在动物乳汁中产生的蛋白质（例如酪蛋白）的编码基因的预定位 置上，以制备融合基因。将含有引入抗体基因的融合基因的DNA片段注射到非人类动物胚 胎中，然后将胚胎引入雌性动物中。带有胚胎的雌性动物怀有转基因非人类动物。转基因 非人类动物或其后代的乳汁分泌出目标抗体。为了增加含抗体乳汁的量，可将合适激素给 予转基因动物（Ebert，K.M?等，Bio/Technology(1994) 12,699-702)。
[0153] 可将如上所述表达和产生的抗体从细胞或宿主动物体内分离出来并纯化。本发明 所用的抗体的分离和纯化可在亲和柱上进行。常规使用的抗体分离和纯化的其它方法也可 采用；因此并不具体限定方法。例如，各种色谱、过滤、超滤、盐析和透析方法都可单独使用 或组合使用，以分离纯化目标抗体（Antibodies