针对程序性死亡-1(pd-1)的抗体的制作方法
【专利说明】针对程序性死亡-1(PD-1)的抗体
[0001] 对W电子形式提交的材料的参考并入
[0002] 与本申请同时提交的计算机可读的核巧酸/氨基酸序列表通过引用整体并入本 申请，并明确为如下：一个45, 084字节的ASCII(文本）文件，命名为"716746_ST25.TXT"， 创建于2014年5月1日。 阳00引发明背景
[0004] 程序性死亡l(PD-l)(也称为程序性细胞死亡1)是具有268个氨基酸的I型 跨膜蛋白，其最初是通过对发生调亡的小鼠T细胞系的消减杂交而被鉴定的（Ishida etal.，EmboJ.，11:3887-95 (1992))。PD-1 是T细胞调节物CD28/CTLA-4 家族的成 员，并且在活化的T细胞、B细胞和髓系细胞上表达（Greenwaldetal.,Annu.Rev. Immunol., 23:515-548 (2005);和化arpeetal.,化t.Immunol., 8:239-245 (2007))。
[0005] 已经鉴定了PD-1的两种配体：PD配体1 (PD-Ll)和PD配体2 (PD-L2)， 两者都属于B7蛋白超家族（Greenwaldetal.,同上）。PD-Ll在多种细胞类型 中表达，包括肺细胞、屯、脏细胞、胸腺细胞、脾细胞和肾细胞（参见，例如，化eeman etExp.Med. ,192(7):1027-1034(2000);和Yamazakietal.,J.Immun ol.，169(10) :5538-5545(2002))。用脂多糖（LP巧和GM-CSF处理后巨隧细胞和树突细 胞值C)上PD-L1的表达上调，并且经由T细胞和B细胞受体信号转导，T细胞和B细胞 上PD-L1的表达得到上调。PD-L1还在多种鼠肿瘤细胞系中表达（参见，例如，Iwaiet al.'Proc.化tl.Acad.Sci.USA, 99(19):12293-12297(2002);和Blanketal.,Cancer Res.，64(3) : 1140-1145(2004))。与此相反，PD-L2呈现出更受局限的表达模式并且主要由 抗原呈递细胞（例如，树突细胞和巨隧细胞）和某些肿瘤细胞系表达（参见，例如，Latchman etal.,化t.Immunol. , 2(3) :261-238(2001))。无论在肿瘤微环境内的肿瘤细胞、间质或是 其他细胞上，肿瘤中PD-L1的高表达都与较差的临床预后相关，据推测运是由于其在肿瘤 中抑制效应T细胞并上调调节性T细胞灯reg)。
[0006] PD-1负调节T细胞的活化，并且运种抑制功能与胞质结构域内的基于 免疫受体酪氨酸转换基序（ITSM)有联系（参见，例如，Greenwaldetal.，同 上；和Par巧etal.，Mol.Cell.Biol. ,25:9543-9553 (2005))。PD-1 的缺乏会 导致自身免疫。例如，已经显示PD-1敲除的巧7BL/6小鼠发展出狼疮样综合 症（参见，例如，Nishimuraetal. ,Immunity, 11:141-1151 (1999)。在人类 中，PD-1基因上的单核巧酸多态性与W下疾病的高发生率相关：系统性红斑狼 疮、1型糖尿病、类风湿性关节炎和多发性硬化发展（参见，例如，Nielsenet al.,TissueAntigens, 62 (6) :492-497 (2003)；Bertsiasetal. ,Arthritis Rheum. ,60 (1):207-218 (2009);Nietal.，Hum.Genet. ,121 (2):223-232 (2007); Tahoorietal. ,Clin.Exp.Rheumatol. , 29(5):763-767 (2011);和Kroneretal. ,Ann. Neurol.，58(1) :50-57(2005))。PD-1的异常表达也参与一些病理（例如肿瘤的免疫逃逸和 慢性病毒感染）中的T细胞障碍（参见，例如，Barberetal.，化Uire, 439:682-687(2006); 和化a巧eetal.,同上）。
[0007] 最近的研究证实，PD-1诱导的Τ细胞抑制还参与抑制抗肿瘤免疫。例如，PD-Ll 在多种人和小鼠肿瘤上表达，并且在肿瘤上PD-1与PD-L1的结合导致T细胞的抑制W及 肿瘤的免疫逃避和保护作用值ongetal.，化t.Med. ,8:793-800(2002))。肿瘤细胞表 达PD-L1与其在体外抵抗抗肿瘤T细胞的裂解作用直接相关值ongetal.，同上；and Blanketal.,CancerRes. ,64:1140-1145(2004))。PD-1 敲除小鼠能抵抗肿瘤侵袭（Iwai etal.，Int.Immunol.，17:133-144(2005))，并且当来自PD-1敲除小鼠的Τ细胞被过继 转移到带有肿瘤的小鼠中时，能高度有效地产生肿瘤排斥度lanketal.，同上）。使用 单克隆抗体阻断PD-1的抑制性信号能增强小鼠中宿主的抗肿瘤免疫（Iwaietal.，同 上；andHiranoetal.,CancerRes.,65:1089-1096(200?5))，并且肿瘤中PD-Ll的高表 达水平与许多人癌症类型的预后不良相关（Hamanishietal.,P;roc.化tl.Acad.Sci. USA, 104:3360-335(2007),E5;rownetImmunol., 170:1257-1266(2003);andFlies etal.,YaleJournalofBiologyandMedicine, 84(4):409-421(2011))〇
[0008] 鉴于上述情况，已经开发出了用于抑制PD-1活性来治疗各种类型癌症w及用于 免疫增强（例如，来治疗感染性疾病）的策略（参见，例如，Asciedoetal.，Clin.Cancer. Res.，19巧）：1009-1020 (2013))。在运方面，已经开发了祀向PD-1的单克隆抗体用于治疗 癌症（参见，例如，Weber,Semin.Oncol.,37(5):430-4309(2010);和Tangetal.,Qi;rrent OncologyRepOTts, 15(2) :98-104(2013))。例如，在I期临床试验中，nivolumab(也称 为BMS-936558)在非小细胞肺癌、黑素瘤和肾细胞癌中产生了完全应答或部分应答（参 见，例如，Topalian,New化glandJ.Med. ,366:2443-2454 (2012))，且其目前正处于III期 临床试验。MK-3575是针对PD-1的人源化单克隆抗体，其已经在I期临床试验中显示出 抗肿瘤活性的证据（参见，例如，化tnaiketal.,2012Ame;ricanSocietyofClinical Oncology(ASCO)AnnualMeeting,摘要编号2512)。另外，最近的证据表明，祀向PD-1的疗 法能增强针对病原体（例如HIV)的免疫应答（参见，例如，化richisetal.，化rr.HIV/ AIDSR巧.，9(1) :81-90 (2012))。尽管有运些进展，然而，运些潜在疗法在人体中的效力可 能是有限的。
[0009] 因此，需要W高亲和力结合PD-1并且有效地中和PD-1活性的PD-1结合剂（例如， 抗体）。本发明提供了运样的PD-1结合剂。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肤，其包括SEQIDNO: 1所示的互补 决定区1佑0时氨基酸序列，569 10^:2所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:3所示的 CDR3氨基酸序列，其中任选地，（a)SEQIDN0:1的第9位残基被不同的氨基酸残基替换， (b)SEQIDN0:2的第7、8和9位残基中的一个或多个被不同的氨基酸残基替换，（c)SEQID N0:3的第1、2和5位残基中的一个或多个被不同的氨基酸残基替换，或者（d) (a)至（c)项 的任意组合。
[0012] 本发明提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肤，其包括SEQIDNO: 12所示的互补 决定区1仰时氨基酸序列，569 10^:13所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:14所示 的CDR3氨基酸序列，其中任选地，（a)SEQIDNO: 12的第9位残基被不同的氨基酸残基替 换，（b)SEQIDNO: 13的第8位残基和/或第9位残基被不同的氨基酸残基替换，（c)SEQID NO: 14的第5位残基被不同的氨基酸残基替换，或者（d) (a)至（c)项的任意组合。
[0013] 本发明提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肤，其包括SEQIDNO: 19所示的互补 决定区1佑0时氨基酸序列，569 10^:20所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:21所示 的CDR3氨基酸序列。
[0014] 本发明还提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肤，其包括与SEQIDN0:4-11、SEQ IDNO: 15-18和沈QIDN0:22-25中的任一具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0015] 本发明提供了一种分离的免疫球蛋白轻链多肤，其包括SEQIDN0:26所示的互补 决定区1 (CDR)氨基酸序列和SEQIDN0:27所示的CDR2氨基酸序列。
[0016] 本发明提供了一种分离的免疫球蛋白轻链多肤，其包括SEQ ID N0:30所示的互补 决定区l(CDR)氨基酸序列和SEQ ID N0:31所示的CDR2氨基酸序列，其中任选地，SEQ ID NO:30的第12位残基被不同的氨基酸残基替换。
[0017] 本发明提供了一种分离的免疫球蛋白轻链多肤，其包括SEQIDN0:35所示的互补 决定区1佑0时氨基酸序列，569 10^:36所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:37所示 的CDR3氨基酸序列，其中任选地，（a)SEQIDNO: 36的第5位残基被不同的氨基酸残基替 换，和/或化)SEQIDN0:37的第4位残基被不同的氨基酸残基替换。
[0018] 本发明提供了一种分离的免疫球蛋白轻链多肤，其包括与SEQIDNO:28、SEQID NO:29、沈QIDNO:32、沈QIDNO:33、沈QIDNO:34、沈QIDNO:38、沈QIDNO:39、沈QID N0:40或者SEQIDN0:41具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0019] 此外，本发明提供了编码前述免疫球蛋白多肤的分离的或纯化的核酸序列、包括 运种核酸序列的载体、包括前述免疫球蛋白多肤的分离的PD-1结合剂、编码运种PD-1结合 剂的核酸序列、包括运种核酸序列的载体、包括运种载体的分离的细胞、包括运种PD-1结 合剂或者运种载体的并且具有药学上可接受的运载体的组合物、和通过向哺乳动物施用有 效量的运种组合物W在哺乳动物中治疗癌症或者感染性疾病的方法。
[0020] 附图简述
[0021] 图1示意性地描绘了用于生成如实施例1所述的抗PD-1单克隆抗体的不同的 PD-1抗原构建体。 阳02引图2显示的实验结果证实了在存在低水平的抗PD-1抗体APE2058的条件下，在人CD4叮细胞MLR测定法中抗TIM-3的括抗剂抗体升高的活性。
[0023] 图3显示的实验结果证实了在存在低水平的抗PD-1的APE2058的条件下，在人 CD4叮细胞MLR测定法中抗LAG-3的括抗剂抗体升高的活性。
[0024] 发明详述
[0025] 本发明提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肤和/或一种分离的免疫球蛋白轻 链多肤，或其片段（例如，抗原结合片段）。本文使用的术语"免疫球蛋白"或"抗体"，是指 见于脊椎动物血液或者其他体液中的蛋白，其被免疫系统用来识别和中和外来物体，例如 细菌和病毒。所述多肤是"分离的"，是指其被移除出其天然环境。在优选的实施方案中， 免疫球蛋白或抗体是包括至少一个互补决定区（CDR)的蛋白。所述CDR形成抗体的"高变 区"，其负责抗原结合（在下文中进一步讨论）。完整的免疫球蛋白通常由四条多肤组成：两 条具有相同拷贝数的重化）链多肤和两条具有相同拷贝数的轻（L)链多肤。所述重链中的 每一条含有一个N-末端可变（Vh)区和Ξ个C-末端恒定（CJ、0)2和0)3)区，并且每条轻 链含有一个N-末端可变（\)区和一个C-末端恒定（CJ区。基于其恒定结构域的氨基酸 序列，可将抗体的轻链归入两种不同类型中的一种，kappa(K)或lambdaa)。在典型的免 疫球蛋白中，每条轻链通过二硫键连接重链，并且所述两条重链通过二硫键彼此相互连接。 所述轻链可变区与所述重链可变区对齐，并且所述轻链恒定区与所述重链的第一恒定区对 齐。所述重链的其余恒定区彼此互相对齐。
[00%] 每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。所述Vh和Vl区具有相同的基 本结构，其中每个区域包括四个框架（FW或FR)区。本文所用的术语"框架区"是指在所述 可变区内的相对保守的氨基酸序列，其中所述框架区位于高变区或者互补决定区（CDR)之 间。每个可变结构域有4个框架区，命名为FR1、FR2、FR3和FR4。所述框架区形成β片层，其 提供所述可变区的结构框架（参见，例如，C.Α.Janewayetal. (eds. ),Immunobiology, 5th Ed.'GarlandPublishing,化wYork,NY(2001))。
[0027] 所述框架区由Ξ个互补决定区（CDR)相连。如上讨论，所述Ξ个CDR,即CDRUCDR2 和CDR3,形成抗体的"高变区"，其负责抗原结合。所述CDR形成环，所述环连接，并且在某 些情况下包括部分的，由框架区形成的β-片层结构。尽管所述轻链和重链的恒定区不直 接参与所述抗体与抗原的结合，但是所述恒定区能影响可变区的方向。所述恒定区还显示 出各种效应功能，例如通过与效应分子和细胞的相互作用参与抗体依赖的补体介导的裂解 或抗体依赖的细胞毒性。
[0028] 理想地，本发明所述分离的免疫球蛋白重链多肤和分离的免疫球蛋白轻链多肤结 合PD-1。如上讨论，程序性死亡-1 (PD-1)(也称为程序性细胞死亡1)是具有268个氨基酸 的I型跨膜蛋白（Ishidaetal.，同上）dPD-1是Τ细胞调节物CD28/CTLA-4家族的成员， 并且在活化的T细胞、B细胞和髓系细胞上表达（Greenwaldetal.,同上；and化a巧eet al.，同上）。PD-1包括胞外的IgV结构域，后跟短胞外柄、跨膜区和胞内尾。所述胞内尾包 含位于基于免疫受体酪氨酸抑制基序和基于免疫受体酪氨酸转换基序中的两个憐酸化位 点，其在PD-1负调节T细胞受体信号的能力方面发挥作用（参见，例如，Ishidaetal.，同 上；和Blanketal.，同上）。本发明所述分离的免疫球蛋白重链多肤和本发明所述分离 的免疫球蛋白轻链多肤能形成运样的试剂：其结合PD-1和另一抗原，产生"双反应性"的结 合剂（例如，双反应性抗体）。例如，所述试剂能结合PD-1和免疫系统的另一负调节物如， 例如，淋己细胞激活基因3 (LAG-3)和/或T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3蛋白 0?Μ-3)。 W29] 结合PD-1的抗体及其组分在本领域是已知的（参见，例如，美国专利号8, 168, 757;Topalianetal.,同上；和化tnaiketal.,同上）。抗PD-1的抗体也可购自 如，例如，Abeam(Cambridge,MA)等来源。
[0030]氨基酸"替换"或"取代"是指位于给定位置上的一个氨基酸或者残基被位于相同 位置的另一氨基酸或者位于多肤序列内的残基替换。
[0031] 氨基酸大致分为"芳香族"或"脂肪族"。芳香族氨基酸包括芳香环。"芳香族"氨 基酸的实例包括组氨酸化或His)、苯丙氨酸（F或化e)、酪氨酸灯或Tyr)和色氨酸（W或 Trp)。非芳香族氨基酸大致归为"脂肪族"。"脂肪族"氨基酸的实例包括甘氨酸（G或Gly)、 丙氨酸（A或Ala)、鄉氨酸（V或Val)、亮氨酸化或Leu)、异亮氨酸（I或lie)、甲硫氨酸 (M或Met)、丝氨酸（S或Ser)、苏氨酸灯或化r)、半脫氨酸（C或切S)、脯氨酸（P或Pro)、 谷氨酸巧或Glu)、天冬氨酸（A或Asp)、天冬酷胺（N或Asn)、谷氨酷胺怕或Gin)、赖氨酸 化或Lys)和精氨酸巧或Arg)。
[0032] 脂肪族氨基酸可W再分为四个亚组。"大脂肪族非极性亚组"由鄉氨酸、亮氨酸和 异亮氨酸组成。"脂肪族微极性亚组"由甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸和半脫氨酸组成。"脂肪 族极性/带电亚组"由谷氨酸、天冬氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、赖氨酸和精氨酸组成。"小残 基亚组"由甘氨酸和丙氨酸组成。带电/极性氨基酸组可W再分为Ξ个亚组：由赖氨酸和 精氨酸组成的"带正电亚组"、由谷氨酸和天冬氨酸组成的"带负电亚组"、W及由天冬酷胺 和谷氨酷胺组成的"极性亚组"。
[0033] 芳香族氨基酸可W再分为两个亚组：由组氨酸和色氨酸组成的"氮环亚组"和由苯 丙氨酸和酪氨酸组成的"苯基亚组"。
[0034] 氨基酸替换或取代可W是保守的、半保守的、或者不保守的。短语"保守的氨基酸 取代"或者"保守的突变"是指一个氨基酸被另一具有共同特性的氨基酸替换。一种明确个 体氨基酸之间共同特性的功能性方法是分析同源生物相应蛋白之间氨基酸变化的基准化 步页率（SchulzandSchirmer,PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag,New York(1979))。根据运种分析，可W定义氨基酸的组别，其中组内的氨基酸优先与彼此交换， 并且因此在其对蛋白质总体结构的影响上彼此最为相似（SchulzandSchirmer,同上）。
[0035] 保守的氨基酸取代的实例包括上述亚组内的氨基酸的取代，例如，赖氨酸取代精 氨酸，反之亦然，使得可W保留正电荷；谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，使得可W保留负电 荷；丝氨酸取代苏氨酸，使得可W保留游离的-〇H;W及谷氨酷胺取代天冬酷胺，使得可W 保留游离的-畑2。
[0036] "半保守突变"包括上面列出的相同组、而非相同亚组中氨基酸的氨基酸取代。例 如，天冬氨酸对天冬酷胺的取代，或者天冬酷胺对赖氨酸的取代，设及同组内但在不同亚组 内的氨基酸。"不保守突变"设及不同组间的氨基酸取代，例如，赖氨酸取代色氨酸，或者苯 丙氨酸取代丝氨酸等。
[0037] 本发明提供了一种免疫球蛋白重链多肤，其包括SEQIDNO: 1所示的互补决定区 1 (CDR)氨基酸序列，SEQIDNO: 2所示的CDR2氨基酸序列，和SEQIDNO: 3所示的CDR3氨 基酸序列。在本发