附加到ORF上。PCR产物模板的储备物保持在约100ng/uL的浓度。
[0088]实施例2-生产mRNA混合物
[0089]mRNA合成过程总结在图5中。使用4:1比例的ARCA帽类似物与GTP在IVT反应中生成合成mRNA，来获得高百分比的加帽转录物。在核苷三磷酸(NTP)混合物中用5m-CTP来全部替换CTP和用假-UTP来全部替换UTP以减少RNA产物的免疫原性。帽类似物和修饰的NTP是从Trilink B1technologies购买。制备2.5倍的NTP混合物(ARCA:ATP:5m-CTP:GTP:假-UTP比例为15:15:3.75:3.75:3.75mM)，以取代用于执行IVT反应的MEGAscript T7试剂盒(Amb1n)提供的标准NTP。每40uL IVT反应包括16uL NTP混合物、4uL 10 XT7缓冲液、16uLDNA模板和4uL T7酶。反应在37°C下温育4-6小时，然后用2uL TURBO DNA酶在37°C下处理另外15分钟，然后在MEGAclear(Amb1n)离心柱上纯化，RNA产物被洗脱在10uL的体积中。为从未加帽的转录物除去免疫原性5’三磷酸基团，向每个制备物中加入1uL南极磷酸酶反应缓冲液和3uL南极磷酸酶(NEB)。磷酸酶反应物在37°C温育30分钟，将IVT产物再纯化。RNA的产量通过Nanodrop(Thermo Scientific)进行定量，随后通过加入pH值为7.(^tlTE(Amb1n)将制备物调整至100ng/uL的标准化工作浓度。RNA混合物通过将代表了各种RF的制备物以所需的化学计量比混合而汇集在一起。所使用的每种RF的分数考虑了相应转录物的预测的分子量，所有RF是等摩尔的，除了0ct4和其衍生物，其以3X摩尔浓度包括在内。向混合物中快速加入10%的编码短暂的、核化的(nuclearized)单体LanYFP焚光蛋白的mRNA以便于监测重编程过程期间的转染效率。在其他实施方式中，mRNA也通过使用总尿嘧啶的25%或10%的2-硫代尿嘧啶而产生(参见图6)。
[0090]实施例3-细胞和培养基
[0091 ]用于重编程的细胞包括BJ新生儿成纤维细胞(ATCC)、HDF-f胎儿成纤维细胞、HDF-n新生儿成纤维细胞和HDF-a成体成纤维细胞(ScienCell )，和XFF无异种新生儿成纤维细胞(Millipore)。对于BJ、HDF和XFF细胞来说，分别在BJ培养基(DMEM+10%FBS)、ScienCell成纤维细胞培养基和FibroGRO无异种人成纤维细胞扩展培养基(MiIIipore)中进行扩增培养。使用的饲养层细胞是300IG辐射的人类新生儿包皮成纤维细胞(GlobalStem)和FibroGRO丝裂霉素C灭活的无异种人新生儿成纤维细胞(MiIIipore)。使用TrypLE Select(Gibco)、一种不含动物产物的细胞解离试剂进行与无异种的基于饲养层的和无饲养层的重编程试验有关的细胞传代步骤。
[0092]实施例4-人成纤维细胞的重编程
[0093]描述的所有重编程实验都按照制造商的指示在涂覆有CELLstart(Gibco)无异种底物的6孔组织培养板中进行。在初始BJ重编程实验中，使用含FBS的BJ培养基，以25万每孔接种Global Stem饲养层。在一些后续的基于饲养层的实验中，播种密度增加和饲养层在换培养基时临时增补，以在响应采用新型RF混合物时遇到的高流失率时努力维持接近融合的饲养层。使用时，无异种饲养层接种在基于Pluriton的无血清的重编程培养基中。将靶细胞接种在加有抗生素、Pluritor^i^|^l^P200ng/ml B18R干扰素抑制剂(eB1science)的Pluriton无血清培养基(Stemgent)中。在重编程期间和之后每天更换培养基，在最终转染后的那天停止增补B18R。在重编程期间细胞分裂到新鲜饲养层上的实验中，将ΙΟμΜ的Y27632(Stemgent)加入到用于重接种的培养基中。靶细胞播种后当天转染开始，并在文中所指出的持续时间中以24小时的间隔进行重复。除非另外注明，每日更换培养基前4小时使用RNAiMAX(Invitrogen)向每个孔递送1200ng剂量的RNA。通过在无钙/镁的DPBS中将100ng/uL的RNA稀释5倍和在同一稀释剂中将5uL的RNAiMAX每ug RNA稀释10倍，汇集以产生I Ong/uL的RNA/介质悬浮液，并在15分钟室温下温育之后分配到培养基中而制成基于RNAiMAX的转染混合物。对于使用Stemfect试剂(Stemgent)的转染，将RNA和Stemf ect(4uL每ug RNA)混合在Stemfect缓冲液中，得到的RNA浓度为10ng/uL。将混合物温育15分钟，然后递送到培养基中或冷藏以备后用。
[0094]在其他实施方式中，人成纤维细胞重编程也在非pluriton的培养基上进行，例如，Allele的重编程培养基(参见图7)。在一些实验中，B18R完全不使用，在其它的实验中，它仅在某些转染中使用。
[0095]实施例5.1PSC集落的表征
[0096]为了评估iPSC集落的产率，用4%多聚甲醛的DPBS溶液(含钙/镁)固定重编程培养物并用在(含钙/镁)DPBS中稀释 100倍的StainAlive TRA-l_60Alexa 488抗体(Stemgent)进行免疫染色。进行集落挑选，增殖，以及随后的免疫染色和用于对多能性进行分子和功能验证的三系分化检测。进行DNA指纹图谱和染色体核型分析。在多于一组的小鼠模型中进行并证实畸胎瘤的形成。从而表明干细胞的多能性。
[0097]揭示了一种新颖的方法，其通过使靶细胞接触工程化的重编程因子和非工程化的重编程因子的组合而将非干细胞高效地重编程为多能干细胞，使得可以在约9天内、有时短至6天、或甚至5天制备iPSC。这些iPSC可制成无饲养层、无异种、和无足迹的iPSC。本发明的方法除了显著提高了重编程的效率外，该新技术也不同于所有先前已知的技术，因为由此生成的iPSC是“干净”的，因为它们没有与任何病毒或载体接触。本发明可以在几乎所有涉及干细胞的建立、分化、应用于细胞和发育研究、以及临床应用领域中找到应用。类似的程序也可用于定向分化或转分化。
[0098]实施例6-食蟹猴成纤维细胞的重编程
[0099]利用食蟹猴成纤维细胞的重编程的实验根据制造商的指示在涂覆有CELLstart(Gibco)底物的6孔组织培养板中进行。靶细胞接种在Allele B1tech的添加抗生素的无血清培养基中。培养基在重编程期间和之后每日更换，并用2-硫代改性的mRNA/转染试剂混合物与新鲜培养基一起在使用或不使用B18R下连续输送12天(图8)。猴iPSC的集落在第9天开始出现，在第12天达到了成熟、紧凑的集落阶段的阶段。
【主权项】
1.一种对体细胞进行去分化或重编程的方法，其包括:用组合物转染分离的体细胞，所述组合物包含: 有效量的在选自0(^4、3(?2、1(]^4、015^、他1108和1^1128的任意一种或多种合成mRNA重编程因子与反式激活结构域之间形成的融合产物，由此体细胞被重编程或去分化。2.权利要求1的方法，其中对所述合成mRNA进行纯化以从转录中除去任何污染性非mRNA ο3.权利要求1的方法，其中所述细胞以密度梯度接种在孔内。4.权利要求1的方法，其中所述细胞是非人灵长类动物细胞。5.权利要求1的方法，其中所述细胞是食蟹猴细胞。6.权利要求1的方法，其中所述细胞是恒河猴细胞。7.权利要求1的方法，其中所述细胞是狒狒细胞。8.权利要求1的方法，其中所述细胞是犬细胞。9.权利要求1的方法，其中所述细胞是马细胞。10.权利要求1的方法，其中所述细胞是牛细胞。11.权利要求1的方法，其中所述细胞是猪细胞。12.权利要求1的方法，其中所述细胞是绵羊细胞。13.权利要求1的方法，其中所述组合物包括融合到N-末端MyoD反式激活结构域的0ct4o14.权利要求2的方法，其中0ct4融合到三倍串联形式的N-末端MyoD反式激活结构域。15.对哺乳动物细胞进行重编程的方法，其中所述方法包括: 在标准6孔板中在无饲养层表面上以2.5万到25万细胞每孔的密度生长靶细胞;和 用权利要求1的重编程因子的合成mRNA中的任意一种或多种以约50ng/ml到约800ng/ml的剂量转染所述细胞。16.权利要求4的方法，其中所述方法包括: 在标准6孔板中在无饲养层表面上以5万、7.5万、10万、或15万细胞每孔的密度生长靶细胞;和 用权利要求1的重编程因子的合成mRNA中的任意一种或多种以约50ng/ml到约800ng/ml的剂量转染所述细胞，其中在较早的时间点比较晚的时间点使用较低的剂量；以及无需传代而获得iPSC。17.权利要求4的方法，其中所述方法包括: 在标准6孔板中在无饲养层表面上以选自1.5万、3万、5万、7.5万、10万、15万、25万、50万细胞每孔的任何一个的密度生长靶细胞;其中每个孔的体积调整到合适培养基的0.5ml到5ml之间；以及 用权利要求1的重编程因子的合成mRNA中的任意一种或多种以约50ng/ml到约800ng/ml的剂量转染细胞，其中在较早的时间点比较晚的时间点使用较低的剂量;以及 无需传代细胞而获得iPSC。18.权利要求4的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。19.权利要求4的方法，其中所述方法无异种。20.权利要求1的方法，其中所述一种或多种因子选自mRNA、调控RNA、si RNA、mi RNA、及其组合。21.权利要求1的方法，其中使用至少两种不同的RNA转染所述体细胞。22.权利要求1的方法，其中所述体细胞选自单能细胞、专能细胞、多能细胞、和分化细胞。23.权利要求1的方法，其中所述一种或多种RNA诱导所述体细胞去分化为单能细胞、专能细胞、或多能细胞。24.权利要求4的方法，其中至少一种所述因子选自0CT4mRNA、S0X2mRNA、NANOGmRNA、LIN28mRNA、KLF4mRNA和MYC mRNA。25.权利要求4的方法，其中0CT4mRNA、S0X2mRNA、NANOGmRNA和LIN28mRNA组合施用。26.权利要求4的方法，其中0CT4mRNA、S0X2mRNA、KLF4mRNA和MYCmRNA组合施用。27.权利要求1的方法，其中将转染的细胞保持在培养物中作为诱导多能干(iPS)细胞。28.权利要求1的方法，其中转染的细胞形成诱导多能干细胞进一步包含诱导所述iPS细胞形成分化细胞。29.治疗或抑制患者中的疾病或病症的一种或多种症状的方法，其包括根据权利要求1的方法在体外对细胞进行去分化，并将所述细胞施用至所述患者。30.权利要求2的方法，其中所述组合物还包括Rarg和LrH-1反式激活结构域。31.权利要求1的方法，其中所述组合物包含融合到VP16反式激活结构域的0ct4。
【专利摘要】本公开主要涉及用于通过动力学受控过程使用工程化的重编程因子来产生诱导多能干细胞(iPSC)的新方法和组合物。具体地，本公开涉及建立重编程因子的组合，包括在常规重编程因子间与反式激活结构域之间的融合，其经优化用于重编程各种细胞。更具体地，本文所公开的示例性方法可用于从各种哺乳动物细胞类型，包括人成纤维细胞产生诱导多能干细胞。还公开了使用合成信使RNA，无饲养层衍生人诱导多能干细胞的示例性方法。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105555949
【申请号】CN201480033794
【发明人】王继武
【申请人】美国绿阳生物技术及医药公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年5月30日
【公告号】EP2997130A2, US20130302295, WO2014190361A2, WO2014190361A3