法的前景。重编程因子的表达可通过应用整合到基因组中的病毒载体来实现，并且iPSC的产生仍然通常由整合逆转录病毒或慢病毒进行。随之带来的基因组的修改意味着iPSC的治疗应用的一个重要的障碍，而来自整合的病毒表达盒的表达被重新激活的可能性即使对于体外研究也是关注的问题。在缓解或消除基因组修改问题的新型表达载体的应用上，最近已经有相当大的进展。现在可使用慢病毒载体，其在两侧有1x重组位点的单个多顺反子表达盒中编码iPSC诱导所需的多种因子，所述重组位点使得在重编程后通过Cre重组酶的瞬时表达可以几乎无缝地切除转基因。转基因的插入及随后切除也可以通过使用转座子载体随后短暂表达转座酶实现。已经使用了可瞬时表达重编程因子足够时间以诱导多能性的几种不同类型的非整合DNA载体，包括腺病毒、质粒和游离型DNA。也证明了使用重组RF蛋白结合细胞穿透肽通过重复转导细胞有可能产生iPSC，尽管效率低。现在可以使用仙台病毒以及通过编码山中因子(Yamanaka Factors)的合成mRNA转录本的持续转染来实现相对有效的iPSC转化，所述仙台病毒具有完全基于RNA的生殖周期。
[0036]将mRNA转染应用于重编程(和潜在地定向分化和转分化)有吸引力，因为简单地通过改变加入到细胞培养基中的转录物，该系统允许每天对重编程混合物和甚至单个组分因子的表达进行调控。一旦一个特定的因子的转染终止，由于mRNA在细胞质中迅速衰减，靶细胞内异位表达在短期内停止。与非整合DNA载体或RNA病毒相比，不需要对mRNA转染进行清理，也不存在基因组随机整合或持续性病毒感染的任何风险。如果我们设想，多轮异位RF表达可能最终用于从病人活检通过iPSC的中间形态成为一个所需类型的特化细胞，这些优势意味更大的意义。然而，目前实行的基于mRNA的重编程有缺点。尽管在mRNA转染后RF的强势表达通常为24小时量级的，但需要大约两个星期的因子表达以诱导人类细胞中的多能性，因此该种技术重编程细胞实际操作所需的时间相对高。并非所有的细胞类型和培养基都同样有利于高效的mRNA递送，而这是目前某些特定关注细胞类型，包括血细胞的基于mRNA的重编程的障碍。目前，还证明有必要采用有丝分裂停滞的成纤维细胞的饲养层，从而使用mRNA方法成功地将细胞重编程为iPSC。在iPSC诱导所需的较长的时间段期间，随着靶细胞从低起始密度的生长，这些饲养层细胞缓冲培养物的群体密度，使RNA和转染试剂(两者都有相关的毒性)的递送剂量变得均衡和支撑靶细胞活力来面对由重编程过程造成的促凋亡和细胞抑制力。这种要求增加了过程的复杂性和操作时间，并引入了技术变化的一个重要来源，特别是考虑到饲养层本身受到转染。饲养层的存在还妨碍了对重编程过程的监测和分析。最后，虽然人饲养细胞目前是对于mRNA重编程的标准，但当使用非人源动物产品用于衍生或增殖时，即使这些细胞也是异种生物污染的潜在来源。
[0037]因此，鉴于与先前已知的过程相关联的问题，本文中提供了生产iPSC的新方法、材料、和流程，其重编程的效率提高和所得到的细胞质量提高。本发明的实施方式通过增强递送至细胞中的RF混合物而成功地用于实现显著令人惊奇和意想不到的改进。本发明实施方式还提供了一个新的流程，该流程压缩和简化了 mRNA重编程过程，以及支持从人成纤维细胞生产无足迹iPSC而不使用饲养层细胞或任何其他可能被异种污染了的试剂。本文所提供的新的方法和组合物将延续先前已知的mRNA方法的好处和帮助清除iPSC技术应用于治疗的剩余障碍。
[0038]本公开主要涉及通过动力学受控方法使用一种或多种工程化的重编程因子来生成诱导多能干细胞(iPSC)的方法。更具体地，本发明涉及建立重编程因子的组合，所述组合包括常规重编程因子与反式激活结构域间的融合，其经优化用于重编程不同类型的细胞；通过导致适当的转基因表达水平的方法，将作为合成的信使RNA(mRNA)的这些因子引入到优选密度的培养的哺乳动物细胞中；在限定条件下维持细胞以产生以前无法实现的重编程效率。相比于本领域已知的其它方法，本发明极大地减少了重编程需要的时间、成本和精力，可以选择成为完全无饲养层和无异种的，而且无需传代。本文公开的材料和步骤适用于从不同类型的哺乳动物细胞，包括人成纤维细胞产生诱导多能干细胞。
[0039]本公开的一些方面还提供用于生成能够产生人体各种不同组织的干细胞的方法，所述方法通过使用信使RNA分子，不需使用病毒载体、动物产品或饲养细胞。本文所公开的新方法在最佳条件下可以以令人惊奇和意想不到的效率用于将人成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)。
[0040]本公开提供了用编码本文中描述的示例性重编程因子的“清理过的”mRNA的混合物处理非人哺乳动物细胞(例如成纤维细胞)的有用方法和组合物。所述mRNA组合物的使用不会导致处理的细胞经历与引入所述mRNA分子相关联的细胞死亡。在一个实施方式中，所述非人哺乳动物细胞是食蟹猴细胞。在另一个实施方式中，食蟹猴细胞按梯度接种在孔内，使细胞以不同的局部密度生长。
[0041 ]
[0042]如本文所用，适合本方法中使用的细胞包括，但不限于，原代细胞和建立的细胞系、胚胎细胞、免疫细胞、干细胞、和分化的细胞，包括但不限于源自外胚层、内胚层和中胚层的细胞，包括成纤维细胞、实质细胞、造血细胞和上皮细胞。如本文所用，干细胞包括单能细胞、专能细胞、和多能细胞;胚胎干细胞、和成体干细胞，如造血干细胞、间质干细胞、上皮干细胞、及肌卫星细胞。在一个实施方式中，体细胞被去分化或重编程。可以使用任何合适的体细胞。代表性的体细胞包括成纤维细胞、角质细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、器官和组织细胞，以及各种血细胞，包括但不限于造血细胞包括造血干细胞，和提供短期或长期造血移植的细胞。最优选的细胞类型包括，但不限于，人成纤维细胞、角质细胞和造血干细胞。该方法特别可用于使细胞去分化和任选的再分化，无需细胞基因组的永久改变。
[0043 ] 所公开的方法中有用的RNA包括mRNA、调控RNA、或小RNA例如s i RNA或m i RNA，其中所述一种或多种mRNA编码起到使细胞去分化或重编程作用的多肽。转染的效率较高。通常，超过90%的转染的细胞群将表达所引入的RNA。因此，有可能用一种或多种不同的RNA转染细胞。例如，细胞群可以用一种或多种不同的mRNA、一种或多种不同的siRNA、一种或多种不同的miRNA、或它们的组合进行转染。细胞群可以在单次施用中同时转染多种RNA，或可以错开相距数分钟、小时、天或周地多次施用。多种不同RNA的转染可错开。例如，如果希望第一种RNA在一种或多种其它的RNA表达之前表达的话。
[0044]通过改变输入的RNA的量，可以在很宽的范围内控制转染的RNA表达水平，使得可以单独地调节每种转染的RNA的表达水平。输入的RNA的有效量基于所需的结果来确定。此夕卜，基于PCR的mRNA生成技术有利于设计不同结构和结构域组合的mRNA。可用于所公开的方法中的RNA是本领域已知的，并且其选择基于靶宿主细胞的类型，及待操纵的途径或细胞活性，或治疗应用。可用于去分化细胞，例如，将成体分化的体细胞转化为干细胞的构建物，可以基于公知的基因、mRNA、或其它核苷酸或蛋白质序列而构建。
[0045]本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于，单、双或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的、或衍生的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常指的是单链或双链DNA的约5至约100个核苷酸的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也被称为低聚物或寡核苷酸，并且可以从基因分离，或通过本领域已知的方法化学合成。
[0046]如本文所使用的，术语“微RNA”是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于，内源性的微RNA和人工微RNA(例如，合成的miRNA)。内源性的微RNA是基因组中天然编码的小RNA，它们能调节mRNA的生产利用。人工微RNA可以是除内源性的微RNA外的任何类型的RNA序列，并能够调节mRNA的活性。微RNA序列可以是这些序列的任何一个或多个组成的RNA分子。
[0047]“微RNA前体”(或“前miRNA”)是指具有茎-环结构、其中结合了微RNA序列的核酸。“成熟微RNA”(或“成熟miRNA”)包括已从微RNA前体(S卩“前miRNA”)切割的微RNA，或已合成(例如，通过无细胞合成在实验室合成)的微RNA，并具有约19个到约27个核苷酸，例如长度为约19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸24个核苷酸25个核苷酸26个核苷酸或27个核苷酸的长度。一个成熟微RNA可以结合到靶mRNA和抑制勒mRNA的翻译。
[0048]0CT4的示例性的基因组，mRNA (cDNA)，和蛋白序列是本领域已知的，参见，例如，(0CT4)P0U5F1P0U，5类同源框[智人(Homo sapiens)]，基因号:5460，其提供的mRNA(cDNA)序列Genbank登录号NM-001173531.1，标题为智人POU 5类同源框I (P0U5F1)，转录本变体3，mRNA(Homosapiens POU class 5homeobox I(P0U5F1),transcript variant 3,mRNA)；Genbank登录号匪-002701.4，标题为智人POU 5类同源框I (P0U5F1)转录本变体I，mRNA(Homo sapiens POU class 5homeobox I(P0U5F1)transcript variant I,mRNA);和Genbank登录号匪-203289.4，标题为智人POU 5类同源框I (P0U5F1)，转录本变体2，mRNA(Homo sapiens POU class 5homeoboxl(P0U5F1),transcript variant 2,mRNA)oS0X2的示例性的基因组、mRNA(cDNA)、和蛋白序列也是本领域已知的，参见，例如，S0X2SRY(性别决定区Y)-框2[智人]，基因号:6657，其提供的mRNA(cDNA)序列Genbank登录号NM-003106.2，标题为mRNA序列智人SRY(性别决定区Y)-框2(S0X2)，mRNA(mRNA sequence Homo sapiensSRY(sex determining reg1n Y)_box 2(S0X2) ,mRNA) qNANOG的不例性的基因组、mRNA(cDNA)、以及蛋白质序列也是本领域已知的，参见例如NANOG Nanog同源框[智人]，基因号:79923，其提供的mRNA(cDNA)序列Genbank登录号匪-024865.2，标题为智人Nanog同源框(NANOG), mRNA (Homo sapiens Nanog homeobox (NANOG) ,mRNA) <^ΙΝ28 的不例性的基因组、mRNA(cDNA)、和蛋白序列也是本领域已知的，参见例如LIN28A同源基因Α(秀丽隐杆线虫(C.elegans))[智人]，基因号:79727，其提供的mRNA(cDNA)序列Genbank登录号NM-024674.4标题为智人I in-28同源基因A(秀丽隐杆线虫)(LIN28A)，mRNA (Homo sapienslin-28homolog A(C.elegans) (LIN28A) ,mRNA) JLF4的示例性的基因组、mRNA(cDNA)、和蛋白序列也是本领域已知的，参见例如，KLF4Kruppel样因子4(肠)[智人]，基因号:9314，其提供的mRNA( cDNA)序列Genbank登录号NM-004235.4，标题为智人Kruppel样因子4(肠)(KLF4)，mRNA (Homo sap