新型突变体鸟氨酸脱羧酶蛋白和其用图
【技术领域】
[0001] 本公开内容设及新型修饰的鸟氨酸脱簇酶蛋白和其用途。
【背景技术】
[0002] 腐胺(或1,4-下二胺)是用于生产包括尼龙-4、6在内的聚酷胺-4、6的重要原料，并 且主要通过班巧腊的加氨W工业规模生产，所述班巧腊通过氯化氨的加成自丙締腊产生。 此化合物的化学合成需要不可再生的石油化学产品作为原料、和多步骤与多反应器设计中 相对高的溫度和压力、W及使用昂贵的催化剂体系。另外，因为运些原料是高毒性和易燃 的，所W已知的化学合成工艺是不利于环境的。因此，作为化学生产工艺的替代选择，需要 从源自可再生的生物质的碳源生产腐胺的方法。近来，通过环境友好的微生物生产腐胺的 生化方法已经受到很多关注。腐胺是在从细菌到动物和植物范围的广谱的生物体中发现的 一种多胺。大肠杆菌中腐胺的浓度已知为极其高，多达大约2.8g/L。同样地，微生物具有对 高浓度多胺的潜在的良好抗性，并且因而它们能够在其高浓度的存在下生长和生存。例如， 已经报道谷氨酸棒状杆菌甚至可W在大于30g/L的尸胺的存在下生长。因此，已经持续地进 行研究W在可工业获得的高浓度多胺的生产中使用微生物。然而，对使用微生物生产多胺 的研究还不足够先进而可工业应用。因此，需要开发出能够W高产量生产多胺的菌株(Qian ZG等，Biotechnol Bioeng,104:651-662,2009;Schneide;r J等，Appl Microbiol Biotechnol,88:859-868,2010)。
[0003] 同时，鸟氨酸脱簇酶(ODC)是在大多数微生物中发现的酶，其将鸟氨酸转化为腐 胺。大肠杆菌中的0DC通常形成同型二聚体，并且在二聚体界面(dimerinterface)处形成活 性位点。0DC的反应机制需要憐酸化唉醒(PLP)作为辅助因子，并且PLP在酶的活性位点的赖 氨酸残基处形成希夫碱，其随后被经历脱簇的底物鸟氨酸替换。当产生腐胺时，0DC再次与 PLP形成希夫碱。
[0004] 当0DC被引入产腐胺菌株一一棒状杆菌属一一时，其是由大肠杆菌spec基因编码 的蛋白质，并且其活性被报道为非常低。因此，为了开发W高产量生产腐胺的菌株，0DC-一 其是参与腐胺生物合成途径的最后步骤的酶一一的改进是非常重要的。至今，仅对0DC蛋白 的结构或反应机制进行了突变研究，并且还没有关于其活性增加的报道。
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006] 本发明人已经做出了许多努力W改进0DC蛋白，其在腐胺的生产中发挥重要的作 用但显示低活性。结果，本发明人发现了新型突变位点，并且在该位点上引入了突变W制备 具有改进的产腐胺活性的修饰的0DC蛋白，并且他们发现当该修饰的0DC蛋白被引入产腐胺 微生物时，微生物能够W高产量生产腐胺，从而完成本申请。
[0007] 技术方案
[000引本发明的目标是提供新型修饰的鸟氨酸脱簇酶(0DC)蛋白。
[0009] 本发明的另一个目标是提供编码该修饰的ODC蛋白的多核巧酸、包括所述多核巧 酸的载体和转化有所述载体的转化体。
[0010] 本发明的仍另一个目标是提供制备腐胺的方法，所述方法包括W下步骤:使レ鸟 氨酸、包含k鸟氨酸的混合物或k鸟氨酸发酵液与该修饰的0DC蛋白反应。
[0011] 本发明的仍另一个目标是提供重组微生物，其通过改变为具有产腐胺活性的棒状 杆菌属某种微生物中的修饰的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性。
[0012] 本发明的仍另一个目标是提供生产腐胺的方法，所述方法包括W下步骤:培养通 过引入修饰的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性的棒状杆菌属某种微生物;和从在上面的 步骤中获得的培养物回收腐胺。
[OOU]有益效果
[0014] 根据本发明的修饰的鸟氨酸脱簇酶蛋白具有比天然形式高21倍的腐胺转化活性。 当修饰的鸟氨酸脱簇酶蛋白被引入产腐胺菌株时，腐胺生产力显著地增加。因此，其可W作 为已知的化学合成途径的替代选择，广泛地应用于腐胺的高效大批量生产。
【附图说明】
[0015] 图1显示了源自天然的大肠杆菌的0DC蛋白和具有I163A或E165A突变的0DC蛋白之 间的腐胺转化活性的比较。详细地，当发生转化反应时，抑增加，并且当通过酪红检验pH增 加时，观察到吸光度的增加。发现具有I163A或E165A或全部两种突变的0DC蛋白与天然的 0DC蛋白相比显示卓越的腐胺转化活性。
[0016] 发明的最佳模式
[0017] 在实现上面目标的方面中，本发明提供新型修饰的0DC蛋白，该修饰的0DC蛋白在 一个或多个氨基酸残基处具有突变，所述氨基酸残基选自距鸟氨酸脱簇酶(0DC)的N-末端 163位的异亮氨酸氨基酸残基和165位的谷氨酸氨基酸残基，所述鸟氨酸脱簇酶(0DC)具有 由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列。
[0018] 如本文使用的，术语"鸟氨酸脱簇酶(ODCr是指催化W下反应的酶，所述反应是从 鸟氨酸合成多胺的第一步和腐胺合成途径的最后一步。在使用心鸟氨酸作为底物生产腐胺 中，憐酸化唉醒(PLP)起辅助因子的作用。
[0019][反应方案]
[0020] k鸟氨酸 < =〉腐胺+C〇2
[0021] 在本发明中，鸟氨酸脱簇酶(0DC)可W具体地是源自大肠杆菌的0DC，并且更具体 地是具有由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列的0DC，其源自大肠埃希杆菌。
[0022] 在本发明中，获得0DC(鸟氨酸脱簇酶）的方法可W通过应用本领域中已知的各种 方法进行。例如，可W通过基因合成技术一一其包括通常在酶表达中使用的用于在大肠杆 菌中W高产量获得酶的密码子优化、和基于微生物的基因组信息通过生物信息学筛选有用 的酶资源的方法一一获得0DC，但不限于此。
[0023] 如本文使用的，术语"修饰的0DC蛋白"是指其中0DC蛋白的氨基酸序列中的一个或 多个氨基酸被添加、缺失或置换的0DC蛋白。具体地，修饰的0DC蛋白是指其中通过0DC蛋白 的修饰其活性与野生型的活性相比高效地增加的蛋白质。在本发明中，可W非限制性地使 用本领域中已知的改进酶的任何一般方法进行修饰，并且方法由策略比如合理设计和定向 进化示例。例如，合理设计策略可w包括在特定位点处的氨基酸的突变(位点定向诱变），并 且定向进化策略可W包括随机诱变。进一步，天然修饰(一个或多个)可W在SEQ ID NO: 1的 163位和/或165位的氨基酸残基(一个或多个)处发生，而没有外部操纵。如本文使用的，术 语"修饰的0DC蛋白"、"0DC突变体"和"spec突变体"可W互换地使用。
[0024] 具体地，本发明的修饰的0DC蛋白可具有在距鸟氨酸脱簇酶(0DC)的N-末端163位 的异亮氨酸氨基酸残基和/或165位的谷氨酸氨基酸残基的修饰(一个或多个），所述鸟氨酸 脱簇酶(0DC)源自大肠埃希杆菌并具有由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列。例如，165位的谷 氨酸可用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或鄉氨酸替换，或者163位的异亮氨酸可用丙氨酸、甘氨 酸、丝氨酸或鄉氨酸替换。进一步，修饰的0DC蛋白可具有163位的异亮氨酸和165位的谷氨 酸的双重修饰，其中163位的异亮氨酸和165位的谷氨酸可W分别用选自丙氨酸、鄉氨酸、丝 氨酸和甘氨酸的氨基酸替换。具体地，163位的异亮氨酸和165位的谷氨酸可W分别用丙氨 酸-丙氨酸、丙氨酸-鄉氨酸、丝氨酸-鄉氨酸或鄉氨酸-鄉氨酸替换。
[0025] 在本发明的实施方式中，当发现对野生型0DC的163和165位的氨基酸的突变的多 种组合导致增加腐胺生产力时，建议运些位置在制备具有改进的腐胺生产力的0DC突变体 中非常重要。具体而言，当在重要的突变位点处存在的氨基酸被替换为小的氨基酸残基(丙 氨酸、丝氨酸、鄉氨酸或甘氨酸)时，腐胺生产力增加。
[0026] 进一步，本发明的修饰的0DC蛋白可W由SEQ ID N0:34至SEQ ID N0:57中的任一 个氨基酸序列组成，和具体地，由沈Q ID NO: 34至SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO:45和沈Q ID N0:49和SEQ ID N0:57中的任一个氨基酸序列组成，其是修饰的ODC蛋白的氨基酸序列，其 中分别距N-末端163或165位的异亮氨酸或谷氨酸被替换为小的残基。修饰的0DC蛋白可W 包括具有与上面的序列50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%或更高 的同源性的任何多肤，只要其具有上面的修饰并且相对于野生型的腐胺转化活性具有卓越 的腐胺转化活性。
[0027] 如本文使用的，术语"同源性"是指两个多核巧酸或多肤部分之间的同一性的百分 比。可W通过本领域中已知的技术确定从一个部分至另一个的序列对应。例如，通过使用容 易获得并且能够比对序列信息的计算机程序，可W通过直接比对两个多核巧酸分子或两个 多肤分子的序列信息来测定同源性。此外，可W通过W下过程测定同源性:使多核巧酸在用 于形成稳定的双链的条件下在同源区中杂交，并且然后通过单链特异性核酸酶消化杂交的 链W测定消化片段的大小。
[0028] 如本文使用的，术语"同源的"是指蛋白质之间的相关性，其中全部语法形式和拼 写变化包括源自超家族的蛋白质和具有"共同进化起源