生产力，通过在染色体中将野生型spec改变成为具有增加 的腐胺转化活性的ODC(speC)来制备突变体菌株。
[0116] 具有改进的腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌化CCM11240P)菌株是在国际专利公布 号W02013/105827中公开的菌株，并且其使用具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物 化CCM11138P)作为母菌株(mother S化ain)制备，公开在国际专利公布号W02012/077995 中。更详细地，通过W下过程制备菌株:基于ATCC13032菌株的NCgl 1469基因的碱基序列，将 NCgll469的N-末端区域和C-末端区域克隆入pDZ载体，通过电穿孔将该载体引入具有腐胺 生产力的棒状杆菌属某种微生物化CCM11138P)，并且之后在包含卡那霉素（2扣g/mL)的培 养基上铺板菌株，然后选择。通过在包含X-gal(5-漠-4-氯-3-吗I噪基-β-D-半乳糖巧）的培 养基上选择蓝色菌落来确认载体的成功的染色体插入。在营养培养基中培养初次 (prima巧)染色体插入的菌株，接着在包含X-gal并且不包含抗生素的培养基上涂布稀释的 菌株，并且选择W相对低的比率出现的白色菌落。最后，通过交换选择NCgll469基因缺失的 菌株。如此制备的最终KCCM11138PANCgll469菌株是与母菌株KCCM11138P相比具有改进的 腐胺生产力的腐胺过表达菌株，KCCM11138PANCgl 1469菌株具有编码NCgl 1469的基因的缺 失，所述NCgll469是参与在细胞中将腐胺分解为N-乙酷腐胺的途径的蛋白质。
[0117] 详细地，使用W下表7中给出的speC_起始(BamHI )_5和speCj冬止(Xbal )_3引物， 扩增在实施例巧日4中制备的ODC(speC)突变体的DNA片段。具体地，使用制备的祀T28a-speC 突变体(I163S、I163V、I163S E165V)载体作为模板和W下表7中给出的两条引物speC_起始 (BamHI)_5 和 speCj冬止(甜 al)_3 进行 PCR。
[011 引[表7]
[0119]
[0120] 使用限制酶BamHI和Xbal处理通过PCR获得的基因片段和载体pDZ(37°C，3小时）， 并且然后将spec突变体的基因片段通过一般连接方法分别插入pDZ载体。通过测序分析确 认如此制备的用于染色体插入的重组载体(pDZ-speC_I163S、pDZ-speC_I163V、pDZ-speC_ I163S E165V)。
[0121] 为了获得其中spec突变体被插入染色体的菌株，将制备的pDZ-speC_I163S、pDZ- speC_I163V和pDZ-speC_I163S E165V重组载体中的每个通过电穿孔转化入KCCM11240P菌 株，并且然后涂布在BHIS平板培养基(每1L中37g/L的脑屯、浸液、91g/L的山梨醇和2%琼脂+ 25yg/mL的卡那霉素)上。
[0122] 通过检验在包含X-gal(5-漠-4-氯-3-吗I噪基-β-D-半乳糖巧）的固体培养基上蓝 色菌落的出现来测定载体的成功的染色体插入。将初次染色体插入的菌株在营养培养基中 伴随震荡培养(30°C，8小时），接着连续稀释并涂布在包含X-gal的固体培养基上。大多数菌 落是蓝色的，而白色菌落W相对低的比率出现。从选择的菌落中，最终获得通过二次交换在 染色体中具有spec突变体的菌株。通过突变体的测序分析最终鉴定运些菌株。鉴定的菌株 被命名为KCCM11240P: :speC_I163S、KCCM11240P: :speC_I163V和KCCM11240P: :speC_I163S E165V。在运些中，KCCMl 1240P: : speC_1163S E165V被命名为谷氨酸棒状杆菌CCOl-0578，并 且在2013年6月10日依照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中屯、（KCCM)保藏，登录号为 KCCM11425P。
[0。引 6-2.测量具有ODC突变体的产腐胺菌株的腐胺生产力
[0124] 为了检验ODC(speC)突变体对产腐胺菌株的腐胺生产力的作用，评估在实施例6-1 中制备的菌株的腐胺生产力。
[0125] 详细地，制备的菌株在30°C下在包含ImM精氨酸的CM平板培养基(每1L中1%葡萄 糖、1 %聚腺、0.5%酵母提取物、0.5%牛肉膏、0.25%化C1、0.2%尿素、100化的50%化0H、 2%琼脂，pH 6.8)中培养16小时，并且然后将一接种环（loop)的细胞培养物接种在25mL的 W下表8的效价培养基中，并且在30°C、200rpm下震荡培养24小时。在发酵期间在培养基中 添加 ImM精氨酸，培养全部制备的菌株。
[0126] [表 8]
[0127]
[0128] ~如表9中所示，引入具有改进的活性的ODC(speC)突变体的每种菌株显示在24小时' 37%至105%的腐胺生产的增加。
[0129] 运些结果显示具有0DC突变体的产腐胺菌株与已知的菌株相比能够相对于糖消耗 产生高浓度的腐胺。
[0130] [表 9]
[0131]
[0132]
[0133] 基于上面的描述，本领域技术人员将理解可WW不同的具体形式实施本发明，而 不改变其技术精神或基本特性。因此，应当理解上面的实施方式在全部方面不是限制性的， 而是说明性的。本发明的范围由所附的权利要求限定，而不是由之前的描述所限定，并且因 此落入权利要求的边界和界限或运样的边界和界限的等价物内的全部变化和修改，因此意 欲被权利要求所涵盖。
[0134] 国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
[0135] 国际表格
[0136] 原始保藏接收证明
[0137] 由该页下部确定的国际保藏机构根据第7.1条发出 [013引至:CJ第一制糖株式会社
[0139] CJ第一制糖中屯、，
[0140] 330，D0NGW-R0，
[0141] JUNG-GU，首尔 100-400
[0142] 大韩民国
[0143]
[0144] 1如果第6.4(d)条适用，该日期是获得国际保藏机构资格的日期;如果在获得国际 保藏机构资格的日期之后在布达佩斯条约之外的保藏被转化成在布达佩斯条约之下的保 藏，该日期是由该国际保藏机构收到该微生物的日期。
[0145] BP/4 表单页
【主权项】
1. 修饰的鸟氨酸脱羧酶(ODC)蛋白，其在一个或多个氨基酸残基处具有突变，所述一个 或多个氨基酸残基选自距0DC的N-末端163位的异亮氨酸和165位的谷氨酸，所述0DC具有由 SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其中所述165位的谷氨酸被替换为丙氨酸、甘 氨酸、丝氨酸或缬氨酸。3. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其中所述163位的异亮氨酸被替换为丙氨酸、 甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸。4. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其中所述163位的异亮氨酸和所述165位的谷 氨酸分别被替换为丙氨酸-丙氨酸、丙氨酸-缬氨酸、丝氨酸-缬氨酸或缬氨酸-缬氨酸。5. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其具有SEQ ID N0:34至57的任何氨基酸序 列。6. 编码权利要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白的多核苷酸。7. 包括编码权利要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白的多核苷酸的载体。8. 转化有权利要求7所述的载体的转化体。9. 制备腐胺的方法，所述方法包括使L-鸟氨酸、包含L-鸟氨酸的混合物或L-鸟氨酸发 酵液与权利要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白反应的步骤。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述修饰的0DC蛋白是纯化的修饰的0DC蛋白或包 含所述修饰的0DC蛋白的微生物发酵液。11. 重组微生物，其通过改变成为具有产腐胺活性的棒状杆菌属某种微生物中的权利 要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性。12. 根据权利要求11所述的重组微生物，其中所述棒状杆菌属某种微生物是谷氨酸棒 状杆菌。13. 生产腐胺的方法，其包括以下步骤： (a) 培养棒状杆菌属某种微生物，其通过改变成为权利要求1至5中任一项所述的修饰 的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性;和 (b) 从在步骤(a)中获得的培养物回收腐胺。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述棒状杆菌属某种微生物是谷氨酸棒状杆菌。
【专利摘要】本发明涉及具有改进的腐胺生产力的新型突变体鸟氨酸脱羧酶蛋白和其用途。KCCM11425P20130610
【IPC分类】C12N15/60, C12P13/04, C12N9/88
【公开号】CN105555953
【申请号】CN201480050697
【发明人】崔香, 郑熙景, H·S·金, H·H·京, J·M·崔, J·J·李, H·D·苏
【申请人】Cj第一制糖株式会社, 韩国科学技术院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年7月17日
【公告号】EP3023493A2, US20160168605, WO2015009074A2, WO2015009074A3