专利名称：鞘氨醇单胞菌属细菌菌株和曲霉属真菌菌株的共培养方法、由该共培养方法获得的新型 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)细菌菌株和曲霉属 (Aspergillus ap.)真菌菌株的共培养方法，其中，新型鞘氨醇单胞菌属细菌菌株KMK-001 培养于液体培养基中，并且向上述培养液中加入单独培养于另一液体培养基中的新型曲霉 属菌株KMC-901。本发明还涉及由上述方法生物合成的新型glionitrin，以及包含所述 glionitrin或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物。
背景技术：
为了从天然来源中获得新物质，已经进行了一些研究。然而，对于改进由自然界 中开发具有生物活性的新物质的效率而言，在由原材料进行重复分离过程中花费大量的时 间、金钱和劳动是主要的障碍。开发新型药物的重要因素之一是获得新物质。“使用共培养 的新物质开发技术(Anew material development technique using co-culture) ”最近已 经由斯克里普斯海洋研究所(Scripps Institution of Oceanography，美国)重新引入为 现代技术，该研究所已经成功开发的新物质例如pestaloru^MercedesCueto等人，J. Nat. Prod. 64 1444-1446，2001)、libertellenone (Oh, D, -C.等人，Bioorg. Med. Chem. 13 5267-5273，2005)以及 emericellamide (0h，D, -C 等人，J. Nat. Prod. 70 :515_520，2007)。 pestalone、libertellenone和emericellamide显示出较强的体外抗癌抗菌活性，为开发 新型抗癌剂和抗生素提供了可能。由斯克里普斯海洋研究所(美国)开发的共培养方法包 括向真菌培养液中加入少量细菌培养液的过程，但其与本发明所述的共培养方法有很大不 同，本发明的共培养方法包括向细菌培养液中加入少量真菌培养液的步骤。本发明者首次开发了鞘氨醇单胞菌属细菌菌株和曲霉属真菌菌株的共培养方法， 然后通过证实由本发明的方法所产生的新型化合物glionitrin具有较强的抗癌抗菌作用 而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供新型的鞘氨醇单胞菌属细菌菌株、新型的曲霉属真菌菌株； 提供鞘氨醇单胞菌属细菌菌株和曲霉属真菌菌株的共培养方法；提供由上述方法产生的新 型化合物glionitrin ；以及提供包含glionitrin或其药学上可接受的盐作为活性成分的 抗癌剂或抗菌剂。为实现上述目的，本发明提供一种鞘氨醇单胞菌属细菌菌株，所述菌株以保藏编 号KCCM10888P进行保藏。本发明还提供一种曲霉属真菌菌株，所述菌株以保藏编号KCCM10889P进行保藏。本发明还提供了一种共培养方法，所述方法包括对细菌混合物进行培养的步骤，所述细菌混合物通过向所述鞘氨醇单胞菌属细菌菌株的培养液中加入所述曲霉属真菌菌 株或其培养液进行制备，所述曲霉属真菌菌株单独培养于液体培养基中。本发明还提供了细菌混合物的培养液，所述细菌混合物通过本发明所述的共培养 方法进行培养。本发明还提供了由式1或式2表示的化合物，所述化合物分离自所述细菌混合物 的培养液，所述细菌混合物通过本发明所述的共培养方法进行培养。式1 η表示S的数目，为1-4;以及式2 X为H或烷基，可为不同或相同的基团，并且包括不对称碳原子的异构体。本发明还提供了抗癌剂，所述抗癌剂含有所述细菌混合物的培养液或从该培养液 中生成的化合物，所述细菌混合物通过本发明所述的共培养方法进行培养。本发明还提供了抗菌剂，所述抗菌剂含有所述细菌混合物的培养液或从该培养液 中生成的化合物，所述细菌混合物通过本发明所述的共培养方法进行培养。本发明还提供了所述培养液和从该培养液中提取的化合物在生产抗癌剂方面的 用途。本发明还提供了所述培养液和从该培养液中提取的化合物在生产抗菌剂方面的 用途。本发明还提供了用于预防癌症并改善健康状况的健康食品，所述健康食品包含所 述培养液和从该培养液中分离的所述化合物。本发明还提供了用于预防细菌性感染并改善健康状况的健康食品，所述健康食品 包含所述培养液和从培养液中分离的所述化合物。本发明还提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括将治疗有效剂量的所述培养液和从该培养液中提取的所述化合物给予受试者的步骤。此外，本发明还提供了用于治疗细菌性感染的方法，所述方法包括将治疗有效剂量的所述培养液和从该培养液中提取的所述化合物给予受试者的步骤。在下文中将对本发明进行详细描述。本发明提供一种鞘氨醇单胞菌属细菌菌株KMK-001，所述菌株以保藏编号 KCCM10888P进行保藏。本发明者从Imgok Mine (韩国)的内部收集pH 3. O的水，并进行离心得到沉淀物。 将所得沉淀物悬浮于盐水中进行稀释，然后接种于平板培养基上。在培养期间，分离出单一 菌株并进行选择，再接种于液体培养基中，然后进行培养。分离出所得菌株的染色体DNA，并 进行16S rDNA测序以鉴别所述菌株。结果，菌株KMK-OOl与鞘氨醇单胞菌属AlXXyl 1_5具 有98. 0%的同源性，这表明它是新型的鞘氨醇单胞菌菌株。KMK-001在Capex-Dox培养基 中形成黄色粘液状菌落，并且经证实在生长中需要硝酸盐和硫酸盐，这表明所述菌株是革 兰氏阴性杆菌(参见图1和图2)。所述菌株KMK-001在2007年11月7日保藏于韩国微生 物保藏中心(KCCM)(保藏编号KCCM10888P)。本发明所述的新型菌株KMK-001的16S rDNA序列如下所示AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG AACGAACGCT GGCGGCATGCCTAATACATG CAAGTCGAAC GATCACTTCG GTGGTAGTGG CGCACGGGTGCGTAACGCGT GGGAATCTGC CCTTGGGTTC GGAATAACAG TTGGAAACGACTGCTAATAC CGGATGATGA CGTAAGTCCA AAGATTTATC GCCCAAGGATGAGCCCGCGT AGGATTAGCT AGTTGGTGAG GTAAAGGCTC ACCAAGGCAACGATCCTTAG CTGGTCTGAG AGGATGATCA GCCACACTGG GACTGAGACACGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTA GGGAATATTG GACAATGGGGGCAACCCTGA TCCAGCAATG CCGCGTGAGT GATGAAGGCC TTAGGGTTGTAAAGCTCTTT TACCCGAGAT GATAATGACA GTATCGGGAG AATAAGCTCCGGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGGAGGGAG CTAGCGTTGTTCGGAATTAC TGGGCGTAAA GCGCACGTAG GCGGCGATTT AAGTCAGAGGTGAAAGCCCG GGGCTCAACC CCGGAACTGC CTTTGAGACT GGATTGCTAGAATCTTGGAG AGGCGGGTGG AATTCCGAGT GTAGAGGTGA AATTCGTAGATATTCGGAAG AACACCAGTG GCGAAGGCGG CCCGCTGGAC AAGTATTGACGCTGAGGTGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGTCCACGCCGTA AACGATGATA ACTAGCTGCC GGGGCACATG GTGTTTCGGTAGCGCAGCTA ACGCATTAAG TTATCCGCCT GGGGAGTACG GTCGCAAGATTAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCTGC ACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGA AGCAACGCGC AGAACCTTAC CAACGTTTGA CATCCCTATCGCGGATCGTG GAGACACTTT CCTTCAGTTC GGCTGGATAG GTGACAGGTGCTGCATGGCT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT TAAGTCCCGCAACGAGCGCA ACCCTCGCCT TTAGTTGCCA GCATTTAGTT GGGTACTCTAAAGGAACCGC CGGTGATAAG CCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAGTCCTCATGGCCCT TACGCGTTGG GCTACACACG TGCTACAATG GCGACTACAG
TGGGCAGCCA CTCCGCGAGG AGGAGCTAAT CTCCAAAAGT CGTCTCAGTTCGGATTGTTC TCTGCAACTC AAGAGCATGA AGGCGGAATC GCTAGTAATCGCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC CCAGGCCTTG TACACACCGCCCGTCACACC ATGGGAGTTG GATTCACCTG AAGGCGCTGC GCTAACTCGC
AAGAGAGGCA GGCGACCACG GTGGGTTTAG CGACTGGGGT GAAGTCGTAACAAGGTAGCC GTAGGGGAAC CTGCGGCTGG ATCACCTCCT T(SEQ. ID. NO 1)本发明还提供一种曲霉属真菌菌株KMC-901，所述菌株以保藏编号KCCM10889P进 行保藏。所述菌株KMC-901在2007年11月7日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)(保藏 编号KCCM10889P)。KMC-901的菌落初期看起来像白色的羊毛，接着中间的蓝绿色区域随时间变大，同 时代之以形成灰色中心区域，其与烟曲霉菌菌落的形态相同(参见图3) (Jeong Ga-Jin, Picture book to the microbiology, vol 3 :192—194，2007)。KMC—901 的菌丝体具有隔 膜，并显示出曲霉属真菌典型的分生孢子头(conidial head)(参见图4) (Jeong Ga-Jin, Picture bookto the microbiology, vol 3 :192-194，2007)。通过 HPLC-MS 和 NMR 对 KMC-901的次级代谢产物进行分析，所述次级代谢产物由Capex-Dox培养基中的液体培养 物生成。结果，证实了烟曲霉菌的特定组分胶霉毒素A和pseurotin Adgarash，Y.等人， Journal of Antibiotic，57 :748_754，2004)。通过上面证实的形态特征和化学特征，所述 菌株KMC-901被认定为烟曲霉菌属真菌，并被命名为烟曲霉菌KMC-901。本发明还提供了一种共培养方法，所述方法包括对细菌混合物进行培养的步骤， 所述细菌混合物通过向所述鞘氨醇单胞菌属细菌菌株培养液中加入所述曲霉属真菌菌株 或其培养液进行制备，所述曲霉属真菌菌株单独培养于液体培养基中。在所述共培养方法中，将所述鞘氨醇单胞菌属细菌菌株和曲霉属真菌菌株以 1000 1.0至1000 0.1的比例进行混合，且优选所述比值为1000 0.5，但不总限于此。本发明者将所述新型细菌菌株KMK-001和真菌菌株KMC-901分别接种于液体培养 基中，然后进行培养。将500 μ L真菌菌株KMC-901培养液加入到IL的细菌菌株KMK-001 培养液中，然后进行共培养。通过HPLC分析所述共培养液，以检验是否生成了新的化合物。 将所述细菌菌株KMK-001和真菌菌株KMC-901单独培养15天。然后也对所述培养液进行分 析。结果，未检出glionitrin。与此同时，当将KMK-001和KMC-901共培养15天时，在保留 时间18. 072的峰处检测到glionitrinA，而在保留时间18. 767的峰处检测到glionitrin B。从将KMK-001和KMC-901进行共培养的第二天起，每隔一天对所述共培养液进行检验。 结果，从共培养的第8天起证实了 glionitrin的生成。本发明还提供了细菌混合物的培养液，所述细菌混合物通过本发明所述的共培养 方法进行培养。本发明还提供了由式1或式2表示的化合物，所述化合物分离自所述细菌混合物 的培养液，所述细菌混合物通过本发明所述的共培养方法进行培养。本文所述的新型化合物被本发明者命名为glionitrin。式 1 η表示S的数目，为1-4 ；以及式2 X为!1或C1-C5的烷基，可为不同或相同的基团，并且包括不对称碳原子的异构体。本发明所述的glionitrin可通过包括下述步骤的方法进行制备(1)将IL鞘氨醇单胞菌属菌株KMK-OOl培养液和500 μ L真菌菌株KMC-901培养 液进行共培养，接下来通过向所述培养液中加入有机溶剂或吸附树脂进行提取；(2)在减压下，将步骤(1)的提取物进行干燥，然后用柱层析法得到各个组分；以 及(3)用另外的柱层析法从步骤(2)的组分中分离并纯化目标化合物。在这一方法中，步骤(1)的共培养优选进行10-20天，更优选进行12-18天，但不 总限于此。本文所述的有机溶剂为乙酸乙酯、丁醇、二氯甲烷或氯仿，但不总限于此。本文 所述的提取通过使用提取装置的方法(例如超临界萃取、高压萃取或超声提取)或使用吸 附树脂(例如XAD和ΗΡ-20)的那些方法来进行，但不总限于此。优选所加入的提取溶剂为 所述共培养液体积的1-3倍，更优选为所述共培养液体积的2倍。优选所述提取在室温下 进行，但不总限于此。所述提取的次数优选1-5次，更优选3次，但不总限于此。在这一方法中，步骤(2)中在减压下的干燥使用旋转真空蒸发器进行，但不总限 于此。此时，在减压下进行干燥的温度优选20-400C，更优选30°C，但不总限于此。在这一方法中，步骤(2)或步骤(3)的柱层析法使用填充剂对所述目标化合物 进行分离和纯化，所述填充剂选自于由硅胶、交联葡聚糖凝胶(s印hadex)、RP18、聚酰胺、 Toyopearl和XAD树脂所组成的组。如果必要，所述柱层析法可用适当选定的填充剂重复若 干次。此时，溶剂选自于由氯仿(CHCl3)-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、二氯甲烷-甲醇、甲醇-水 以及乙腈_水所组成的组，但不总限于此。将所述乙酸乙酯提取物在减压下进行干燥得到提取物，将所得到的提取物继续进 行反相柱层析，得到6个组分。用水和乙腈进行洗脱。更准确地说，以20%的乙腈/水开始洗脱，并且乙腈的含量每次增加20%。用100%的甲醇作为最终的溶剂。通过HPLC对所 得到的组分进行分析，结果证实在60%乙腈/水的组分中含有所述新型的glionitrin。在 90%二氯甲烷/乙酸乙酯以及60%二氯甲烷/乙酸乙酯的等度条件下，用乙酸乙酯和二氯 甲烷作为溶剂，通过正相液相色谱纯化所述组分。从保留时间10分钟的组分中得到由式3 表示的glionitrin A，从保留时间15分钟的组分中得到由式4表示的glionitrin B。式3 式 4 所分离出化合物的化学结构用MS和核谱仪进行鉴定。结果证实glionitrin A为 无定形淡黄色粉末，由分子式C13H11N3O5S2表示，分子量为353 ；glionitrin B为无色粘液状 半固态物质，由分子SC15H17N3O5S2表示，分子量为383。当在室温下将glionitrin A溶解于 水、乙腈水溶液、甲醇水溶液或DMSO(二甲亚砜)溶液中时，生成了三硫化物(glionitrinC) 和四硫化物(glionitrin D)，并同样对它们的化学结构进行鉴定。本发明还提供了抗癌剂，所述抗癌剂含有所述细菌混合物的培养液或 glionitrin，所述细菌混合物通过本发明所述的共培养方法进行培养。本文所述的癌症为胃癌、肝癌、结肠癌、肺癌或前列腺癌。使用AGS (胃癌，ATCC CRL-1739 )、H印G2 (肝癌，HB-8065 )、HCTl 16 (结肠 癌，CCL-247 )、A549 (肺癌，CCL-185 )以及 DU145 (前列腺癌，HTB-81 )研究 了所述 glionitrin对癌细胞的细胞毒性，上述细胞系来自于美国模式菌种收集中心(American Type CultureCollection, ATCC, Manassas, VA, USA)。本发明者研究了 glionitrin对癌细胞的细胞毒性作用。为此，进行了体外 MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四氮唑溴盐)分析以使活的癌细胞定量。结 果证实，glionitrin对于胃癌(AGS)、肝癌0fepG2)、结肠癌(HCT-116)、肺癌(A549)和前列 腺癌(DU-145)具有强的抗癌作用。因此，本发明所述的细菌混合物的培养液或glionitrin可有效地用作抗癌剂。本发明还提供了抗菌剂，所述抗菌剂含有所述细菌混合物的培养液或 glionitrin，所述细菌混合物通过本发明所述的共培养方法进行培养。本文所述的抗菌剂对于鞘氨醇单胞菌属细菌菌株具有抗菌作用。本发明者研究了 glionitrin的抗菌作用。更准确地说，进行了纸片扩散分 析(disc diffusion assay)以检验glionitrin对于细菌菌株的抗菌作用。将吸附了 glionitrin (实验组)和吸附了氨苄西林(阳性对照组)的每个纸片培养在涂抹有所述细 菌菌株的琼脂培养基上，然后进行观察。结果，在吸附了 glionitrin的纸片中，所述细菌表 现为黄色，并且在所述纸片的周围观察到了表示无细菌生长的无色环状区域。这一结果表 明，glionitrin显示出与用作阳性对照的氨苄西林类似的抗菌作用。
本发明者用藤黄微球菌(Micrococcus leuteus) IFC 12708、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtil is) ATCC 6633、普通变形杆菌(Proteus vulgaris) ATCC 3851、鼠伤寒 沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC 14028以及3种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)菌株(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 43300、金黄色葡萄球菌 ATCC 700787 以及金黄色葡萄球菌 ATCC 700788)研究了 glionitrin A 和 glionitrin B 的抗菌作用，上述菌种来自于美国模式菌种收集中心(ATCC，Manassas, VA, USA)。结果， glionitrin B对于每一实验组都不具有抗菌作用。同时，glionitrin A对于4种非耐药性 的细菌显示出与阳性对照氨苄西林同样强的抗菌作用。特别地，通过对三种MRSA菌株进行 观察，glionitrin A对于MSRA菌株显示的抗菌作用是阳性对照氨苄西林的15倍。同样研 究了 glionitrin A和 glionitrin B对于烟曲霉菌HIC 6094 和红色毛癣菌(Trichophyton rubrum) IFO 9185的抗真菌活性。结果，glionitrin B不具有抗真菌活性，而glionitrin A显示出与上述类似的抗真菌活性。因此，本发明所述的细菌混合物的培养液或glionitrin可有效地用作抗菌剂(参 见表3和图6)。除由式1或式2表示的化合物外，本发明所述的抗癌剂或抗菌剂可含有其药学上 可接受的盐。所述药学上可接受的盐优选酸加成盐，所述酸加成盐通过使用药学上可接受 的游离酸进行制备。无论是有机酸还是无机酸，只要是药学上可接受的游离酸就可以使用。 所述游离无机酸的实例为盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸。可用的游离有机酸的示例为柠檬 酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甲 磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、半乳糖醛酸、扑酸(embonic acid)、谷氨酸和天冬氨酸。 本发明所述的抗癌剂或抗菌剂不仅可含有药学上可接受的盐，而且可含有通过常规方法制 备的任何盐、水合物和溶剂合物。本发明所述的抗癌剂或抗菌剂可选择性地含有一种或多种由式1或式2表示的化 合物，并可另外含有一种或多种与上述组分具有相同或相似功能的活性成分。本发明所述的抗癌剂或抗菌剂可口服给药或胃肠外给药，并可以药物制剂的普通 形式使用。本发明所述的抗癌剂或抗菌剂可制备用于口服给药或胃肠外给药，所述制备过 程通过与常用的稀释剂或赋形剂(例如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活 性剂)混合来进行。用于口服给药的固体制剂为片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊剂。这些 固体制剂通过将本发明所述的药物组合物与一种或多种适宜的赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等)进行混合而制备。除简单的赋形剂外，可使用润滑剂例如硬脂酸 镁、滑石等。用于口服给药的液体制剂为悬浮剂、溶液剂、乳剂和糖浆剂，除常用的简单稀释 剂例如水和液体石蜡外，上述制剂还可含有各种赋形剂例如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐 齐U。用于胃肠外给药的制剂为无菌水溶液、水不溶性赋形剂、悬浮剂、乳剂、冻干剂和栓剂。 除所述活性化合物外，水不溶性赋形剂和悬浮剂还可含有丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如 橄榄油)、可注射的酯(例如ethylolate)等。除所述活性化合物外，栓剂可含有wit印sol、 聚乙二醇(maCr0g0l)、tween 61、可可脂、月桂脂(laurin butter)、甘油和明胶等。本发明 所述的抗癌剂或抗菌剂可通过胃肠外进行给药，所述胃肠外给药包括皮下注射、静脉注射 和肌肉注射。
本领域技术人员可根据患者的体重和病症、疾病的严重程度、药物的制剂形式、给 药途径和时间来确定本发明所述的抗癌剂或抗菌剂的有效剂量。本发明还提供了所述培养液和从该培养液中提取的化合物在生产抗癌剂或抗菌 剂方面的用途。通过本发明所述的共培养方法所培养的细菌混合物的培养液或glionitrin可有 效地用于生产抗癌剂和抗菌剂。本发明所述的抗癌剂或抗菌剂不仅可含有药学上可接受的 盐，而且可含有通过常规方法制备的任何盐、水合物和溶剂合物。本发明所述的培养液以及 从所述培养液中分离出的化合物可作为关键组分用于所述药物组合物的制剂。如同上文所 解释的那样，glionitrin具有抗癌作用和抗菌活性。因此，本领域技术人员能够理解的是， 通过使用该物质而制得的化合物也具有抗癌作用和抗菌活性。本发明还提供了用于预防癌症或细菌感染并改善健康状况的健康食品，所述健康 食品包含所述培养液和从培养液中分离的所述化合物。通过本发明所述共培养方法所培养的细菌混合物的培养液或glionitrin可用作 食品添加剂。在该情况下，通过本发明所述的共培养方法所培养的细菌混合物的培养液或 glionitrin可按原样加入，或按照常规方法以与其他食品组分混合的形式加入。活性成分 的混合比例可根据应用的目的(预防、保健或治疗)进行调节。通常，为生产健康食品或饮 料的目的，通过本发明所述共培养方法所培养的细菌混合物的培养液或glionitrin优选 加入0. 1-15重量份，更优选加入0. 1-10重量份。然而，如果因健康和保健或是调节健康状 况需要长期给药，所述含量可低于上述值，但已证明通过本发明所述共培养方法所培养的 细菌混合物的培养液或glionitrin非常安全，因此，更高的含量也是可接受的。本文对所述食品没有限制。举例来说，可将通过本发明所述共培养方法所培养 的细菌混合物的培养液或glionitrin加入到肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、饼 干、比萨饼、速食面条(ramyim)、面粉制品、口香糖、乳制品(包括冰淇淋)、汤类、饮料 (beverage)、茶、饮料(drink)、酒精饮料、维生素复合物等中，并且从广义上讲，可包括几乎 每种适用于生产健康食品的食品。类似于其他饮料，本发明所述用于健康饮料的组合物可另外包含各种香料或天然 碳水化合物等。上述天然碳水化合物可为下述物质之一单糖，例如葡萄糖和果糖；二糖， 例如麦芽糖和蔗糖；多糖，例如糊精和环糊精；以及葡萄糖醇，例如木糖醇、山梨醇和赤藓 糖醇。此外，可包含天然甜味剂(例如奇异果甜蛋白和甜叶菊提取物)以及合成甜味剂 (例如糖精和阿司帕坦)作为甜味剂。在IOOmL通过本发明所述共培养方法所培养的细菌混合物的培养液或glionitrin中，所述天然碳水化合物的含量优选0. 01-0. 04g，更优选 0. 02-0. 03g。除上述成分外，通过本发明所述共培养方法所培养的细菌混合物的培养液或 glionitrin还包含下述各种物质各种营养物、维生素、矿物质、香料、着色剂、果胶酸及其 盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、PH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、用于加 入到苏打水中的碳酸化剂等。通过本发明所述共培养方法所培养的细菌混合物的培养液 或glionitrin也可包含天然果汁、水果饮料和/或可加入植物性饮料中的果肉。上述全部 成分可单独加入或一同加入。事实上，上述成分的混合比例并不重要，但通常每100重量 份的通过本发明所述共培养方法所培养的细菌混合物的培养液或glionitrin中，可加入 0.01-1重量份的每种成分。此外，本发明还提供了用于治疗癌症或细菌性感染的方法，所述方法包括将治疗 有效剂量的所述培养液和从该培养液中提取的所述化合物给予受试者的步骤。本文所述的受试者优选人或任何其他哺乳动物。本文所述的哺乳动物可选自于由 小鼠、大 鼠、豚鼠、猪、兔、猴和黑猩猩所组成的组，但不总限于此。所述培养液以及从所述培养液中提取的化合物可经口服给药或胃肠外给药(例 如静脉注射、皮下注射、局部注射或腹膜腔注射)。可根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、 给药频率、给药方法、排泄情况以及疾病的严重程度来确定所述培养液以及从所述培养液 中提取的化合物的有效剂量。所述剂量单位可含有例如1、2、3或4倍的单次剂量，或1/2、 1/3、1/4的单次剂量。单次剂量优选含有在一次给药中给予的活性化合物的量，并且，通常 该量对应于1、1/2、1/3、1/4的日剂量。预计所述新型的鞘氨醇单胞菌属细菌_曲霉属真菌共培养方法在得到新物质方 面是一项很有前途的技术。通过所述共培养方法生成的新型化合物glionitrin对于癌细 胞具有较强的细胞毒性作用，对于包括KMK-001在内的10种致病菌具有抗菌作用。因此， 其可有效地用于开发抗癌剂或抗生素。
参考附图可以更好地理解本发明中优选实施方式的应用，其中图1为显示在CDA培养基上的所述新型鞘氨醇单胞菌属细菌菌株形态的照片；图2为显示革兰氏染色的菌株的显微照片；图3为显示在CDA培养基上的所述烟曲霉菌真菌菌株KMC-901形态的照片；图4为显示所述菌株菌丝体的显微照片，所述菌丝体具有隔膜和分生孢子的子 ；图5为显示细菌菌株KMK-001和真菌菌株KMC-901共培养液中的所述菌株的显微 照片；图6为显示glionitrin对于所述菌株的抗菌活性的照片左图吸附有氨苄西林的纸片；以及右图吸附有glionitrin的纸片；图7为显示单一培养液的色谱图，在所述单一培养液中，将细菌菌株KMK-001培养 15天;图8为显示单一培养液的色谱图，在所述单一培养液中，将真菌菌株KMC-901培养15天;图9为显示培养液的色谱图，在所述培养液中，将KMK-001和KMC-901共培养15
天。
具体实施例方式在下面的实施例中，对本发明实用的和现有的优选实施方式进行说明。但是，可以理解的是，在考虑本发明所公开的内容后，本领域的技术人员可以在本 发明的精神和范围内进行修改和改进。棚列1 :f帝鮮鮮■双士咨馳滅纖禾睛麵株本发明者从Imgok Mine (Gangneung-si，Gangwondo，韩国)的内部收集 pH 3. 0 的 水，并进行离心作用来得到沉淀物。将所述沉淀物在盐水中悬浮并稀释，再将所述稀释后的 沉淀物接种于YM琼脂培养基(YMA)和Capex-Dox琼脂培养基(CDA)上，然后在25°C培养 10天。分离出单一菌株，从而得到300个菌株。在所得的菌株中，选定用于共培养的细菌 菌株和真菌菌株，再将其接种于Capex-Dox液体培养基上，然后在25°C的振荡培养箱中培 养5-7天。分离出所得菌株的染色体DNA，并进行16S rDNA测序以鉴别所述菌株。结果，菌 株KMK-001与鞘氨醇单胞菌属AlXXyll-5具有98. 0%的同源性，这表明它是新型的鞘氨醇 单胞菌菌株。KMK-001在Capex-Dox培养基(将30g蔗糖、3g硝酸钠、Ig磷酸氢二钾、0. 5g 硫酸镁、0. 5g氯化钾、0. Olg硫酸亚铁溶于IL去离子(DI)水中)中形成黄色粘液状菌落， 并证实其在生长中需要硝酸盐和硫酸盐，这表明所述菌株为革兰氏阴性杆菌(参见图1和 图2)。所述菌株KMK-001在2007年11月7日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)(保藏编 号KCCM10888P)。本发明者还从Jangseong Mine (Taebak-si，Gangwon-do，韩国)的地下坑道(深 度150m)收集了水和煤的悬浮液，然后进行离心作用来得到沉淀物。将所述沉淀物在无菌 纯净水中悬浮并稀释，再将所述稀释后的沉淀物接种于Capex-Dox琼脂培养基(CDA)上，然 后在25°C培养14天。分离出单一真菌菌株，从而得到真菌菌株KMC-901。将作为单一菌株 分离出的KMC-901再次培养于Capex-Dox琼脂培养基(CDA)上，然后观察其生长和颜色。 为鉴定其种类，还对菌丝体、菌丝、隔膜、分生孢子和子囊进行观察。将由KMC-901生成的化 合物继续进行化学分析，并将所得结果用于鉴定所述菌株。KMC-901的菌落初期为白色羊 毛状，然后接着蓝绿色中心区域变大且颜色变深，代之以形成灰色中心区域，其与烟曲霉菌 菌落的形态相同(参见图3)。KMC-901的菌丝体具有曲霉属真菌典型的隔膜和分生孢子头 (参见图4)。通过HPLC-MS和NMR对KMC-901的次级代谢产物进行分析，所述次级代谢产 物由Capex-Dox培养基中的液体培养物生成。结果，证实了烟曲霉菌的特定组分胶霉毒素 A和pseurotin A。通过上面证实的形态特征和化学特征，所述菌株KMC-901被认定为烟曲 霉菌属真菌菌株，并被命名为烟曲霉菌KMC-901。所述菌株KMC-901在2007年11月7日保 藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)(保藏编号KCCM10889P)。实施例2 新型鞘氨醇单胞菌属KMK-001和曲霉属菌株KMC-901的其培养本发明者将所述新型细菌菌株KMK-001和真菌菌株KMC-901分别接种于 Capex-Dox液体培养基中，然后在25°C的振荡培养箱中培养3天。将所述的两个菌株培养 于含有0. 5L的Capex-Dox液体培养基的IL锥形烧瓶中用于大量生产。2天后，将250 μ L真菌菌株KMC-901培养液加入到鞘氨醇单胞菌属菌株KMK-OOl培养液中，然后进行共培养。 在显微镜下观察含有上述菌株的共培养液。如图5所示，在菌丝体周围显示出与所述真菌 菌株在一起的细菌菌株(参见图5)。通过HPLC研究所述共培养液中新化合物的生成。在下述条件下进行HPLC (装置 Agilent 1100LC/MS系统；洗脱速度0. 7mL/min ；洗脱剂在30分钟内将乙腈含量由10% 乙腈 / 水增加至 100% 乙腈；柱:Phenomenex Luna 5u C18 (2) 4. 6 X 150mm ；检测器:DAD UV 检测器(254nm))。如图7-图9所示，在将细菌菌株KMK-001或真菌菌株KMC-901单独培养 15天的培养液中未检出glionitrin。与此同时，在将细菌菌株KMK-001和真菌菌株KMC-901 共培养15天的共培养液中，在保留时间18. 072的峰处检测到glionitrin A，而在保留时间 18. 767的峰处检测到glionitrin B。从将KMK-001和KMC-901进行共培养的第二天起，每 隔一天对所述共培养液进行检验。结果，从共培养的第8天起证实了 glionitrin的生成。实施例3 :glionitrin的分离和纯化
本发明者使用乙酸乙酯从实施例2得到的培养液中提取有机化合物。使用旋转真 空蒸发器在30°C将所述提取物在减压下干燥，然后将所得的提取物继续进行反相柱层析， 结果得到6个组分。用水和乙腈进行洗脱。更准确地说，以20%的乙腈/水开始洗脱，并且 乙腈的含量每次增加20%。用100%的甲醇作为最后的溶剂。通过HPLC对所得到的组分 进行分析，结果证实在60%乙腈/水的组分中含有所述新型的glionitrin。在90%二氯甲 烷/乙酸乙酯以及60%二氯甲烷/乙酸乙酯的等度条件下，用乙酸乙酯和二氯甲烷作为溶 齐U，将所述组分通过正相液相色谱进行纯化。从保留时间10分钟的组分中得glionitrin A，从保留时间15分钟的组分中得到glionitrin B。实施例4 =Rlionitrin的仪器分析本发明者对glionitrins进行仪器分析，以确定glionitrin A和glionitrinB 的化学式。在室温下将分离出的glionitrinA置于水或DMSO中。然后，从中生成三硫化 物(glionitrin C)和四硫化物(glionitrin D)，并通过MS和NMR鉴定其化学结构。分 别在500MHz和125MHz观察1H和13C的匪R谱。在氘代氯仿(chloroform-d)溶剂中测定 glionitrin A，在全氘代甲醇(methanol_d4)溶剂中测定 glionitrin B。表!glionitrinA 和 glionitrin B 结构的 1H 和 13C NMR 的化学位移值 <glionitrin C>ESI-MS :m/z 386 [M+H]+;1H NMR(500MHz, CDCl3) :3. 40(3H，s), 3. 46 (1H, dd, J= 19. 0，1. 0Hz)，4. 29 (1H， dd, J= 19，1. OHz)，4. 42 (1H, brd, J = 12. 5Hz)，4. 80 (1H, br d, J = 12. 5Hz)，7. 44 (1H, br d, J = 8. 5Hz)，8. 10 (1H，dd，J = 8. 5，2. OHz)，8. 89 (1H, d, J = 2. OHz) ·<glionitrin D>ESI-MS :m/z 440 [M+Na]+;1H NMR(500MHz, CDCl3) :3. 21 (3H，s)，3. 48 (1H，br dd，J = 18. 5，1. OHz)，4. 02 (1H， br dd, J = 18. 5，1. OHz)，4. 12 (1H, br d, J = 12. 5Hz)，4. 40 (1H, br d, J = 12. 5Hz)， 7. 52 (1H, brd, J = 8. 5Hz)，8. 18 (1H, dd，J = 8. 5，2. OHz)，9. 18 (1H, d, J = 2. OHz) ·实施例5 ^lionitrin对于癌细胞的细胞毒性作用以及glionitrin对于细菌菌株 KMK-OOl的抗菌活性本发明者通过体外MTT(3_[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四氮唑溴 盐)分析，对活的癌细胞进行定量，来研究了 glionitrin对于癌细胞的细胞毒性作用。使用 AGS(胃癌，ATCC CRL-1739 )、H印G2(肝癌，HB-8065 )、HCT116(结肠癌，CCL-247 )、 A549(肺癌，CCL-185 )以及DU145 (前列腺癌，HTB-81 )来评价glionitrin对癌细胞的 细胞毒性，上述细胞系来自于美国模式菌种收集中心(ATCC，Manassas, VA, USA)。将胃癌 (AGS)、肝癌0fepG2)、结肠癌(HCT-116)、肺癌(A549)或前列腺癌(DU-145)的细胞以IX IO4 个细胞/100 μ L/孔的密度分布于96孔板中，然后在37°C的CO2培养箱中培养24h。然后， 将培养基替换为含有glionitrin的新鲜培养基，接下来在37°C进行培养。24h后，将MTT 溶液以IOyL/孔加入其中，然后在37°C再培养lh。Ih后，通过测定OD45tl将在活细胞中由 还原酶生成的甲脂进行定量。表2glionitrin A和glionitrin B对于6种癌细胞系的体外细胞毒性作用 如表2所示，glionitrin A和glionitrin B对于所述癌细胞系具有较强的细胞
毒性作用。本发明者还通过纸片扩散分析研究了 glionitrin A和glionitrin B对于 KMK-001的抗菌活性。将KMK-001涂抹在Capex-Dox琼脂培养基上，所述培养基上放有吸附 了 glionitrin的无菌纸片，然后在25°C培养5天。对于阳性对照组，放入代替glionitrin 吸附有氨苄西林的无菌纸片，并在相同条件下进行培养。结果证实，glionitrin具有与氨 苄西林类似的抗菌活性(参见图6)。本发明者还用藤黄微球菌(Micrococcus leuteus) IFC 12708、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtil is) ATCC 6633、普通变形杆菌(Proteus vulgaris) ATCC 3851、鼠伤寒 沙门氏菌(Salmonella typhimurium) ATCC 14028以及3种MRSA菌株(金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) ATCC 43300、金黄色葡萄球菌ATCC 700787以及金黄色葡萄球菌 ATCC 700788)研究了 glionitrin A和glionitrin B的抗菌作用，上述菌株来自于美国模 式菌种收集中心(ATCC，Manassas, VA, USA)。在每个实验组中，glionitrin B完全不具有 抗菌活性。相反，glionitrin A对于4种非耐药性菌株显示出与氨苄西林(阳性对照组) 同样强的抗菌活性(MIC 0. 78-3. 13 μ g/mL)。特别地，glionitrin A对于3种MRSA菌株 显示出的抗菌作用是阳性对照氨苄西林的15倍(MIC :0. 78 μ g/mL)(参见表3)。为测定 glionitrin对于所述7种细菌菌株的MIC，将上述7种细菌菌株在标准方法的肉汤(Difco) 中培养24h。然后，除去所述培养基，并在96孔板的每个孔中填入100 μ L含有每种菌株 105Cfu/mL的培养基。将以不同浓度稀释的glionitrin加入其中，然后在37°C培养24h。 24h 后测定 OD6tltl。本发明者还评价了 glionitrin A和glionitrin B对于菌株的抗真菌活性，所述菌株来自于美国模式菌种收集中心(ATCC，Manassas, VA, USA)，例如烟曲霉菌HIC 6094以 及红色毛癣菌(Trichophyton rubrum) IFO 9185。结果，glionitrin B没有显示出抗真菌 活性，与前述结果一致。同时，glionitrin A显示出抗真菌活性(MIC 12. 5 μ g/mL)(参见 表3)。为测定glionitrin对于上述两种真菌菌株的MIC，将所述真菌菌株的孢子以IO5个 孢子/mL的密度悬浮于无菌蒸馏水中，并用沙氏(Sabouraud)葡萄糖液体培养基(Difco) 将所述密度调整为IO3个细胞/mL。然后，将所述细胞以IO2个细胞/100 μ L/孔的密度分 布于96孔板中，向其中加入不同浓度的glionitrin，然后在28°C培养48h。证实没有真菌 生长的glionitrin浓度为所测定的MIC。表3glionitrin A和glionitrin B对于9种致病微生物的体外抗菌活性 如表3所示，glionitrin A对于上述致病微生物显示出较强的抗菌活性。
在下文中对本发明所述组合物的制备例进行描述。制备例1 粉剂的制备式3或式4的化合物20mg
乳糖IOOmg滑石IOmg根据制备粉剂的常规方法，通过将上述全部组分混合并装入密封包装内来制备粉 剂。制备例2 片剂的制备式3或式4的化合物 IOmg玉米淀粉IOOmg乳糖IOOmg硬脂酸镁2mg通过制备片剂的常规方法，将上述全部组分混合来制备片剂。制备例3 药物胶囊的制备式3或式4的化合物 IOmg结晶纤维素3mg乳糖14. 8mg硬脂酸镁0.2mg根据制备胶囊的常规方法，通过将上述全部组分混合并装入明胶胶囊内来制备胶
^ ο制备例4 注射剂的制备式3或式4的化合物IOmg甘露醇180mg用于注射的无菌蒸馏水 2974mgNa2HPO4 · 12H2026mg根据制备注射剂的常规方法，将上述全部组分混合来制备注射剂(2mL/安瓿)。制备例5 溶液剂的制备式3或式4的化合物 20mg异构化糖IOg甘露醇5g纯净水适量根据制备溶液剂的常规方法，将上述全部组分混合来制备溶液剂。特别地，将上述 全部组分混合后，向其中加入适量的柠檬香料和纯净水使得溶液剂的体积为100mL。将所述 溶液剂装入棕色瓶中并进行灭菌。工业实用性所述新型的鞘氨醇单胞菌属细菌_曲霉属真菌共培养方法预计在得到新物质方 面是一项很有前途的技术。通过所述共培养方法生成的新型化合物glionitrin对于癌细 胞具有较强的细胞毒性作用，对于包括KMK-001在内的10种致病菌具有抗菌作用。因此， 其可有效地用于开发抗癌剂或抗生素。
本领域技术人员将会明了的是，可容易地利用在上述说明书中所公开的概念和具 体实施方式，作为改进或设计其他实现与本发明用途相同的实施方式的基础。本领域技术 人员还将明了的是， 这类等同的实施方式没有脱离如所附权利要求书中阐明的本发明的精 神和范围。
权利要求
一种鞘氨醇单胞菌属细菌菌株，所述菌株以保藏编号KCCM10888P进行保藏。
2.一种曲霉属真菌菌株，所述菌株以保藏编号KCCM10889P进行保藏。
3.一种共培养方法，所述方法包括对细菌混合物进行培养的步骤，所述细菌混合物通 过向权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属细菌菌株的培养液中加入权利要求2所述的曲霉属 真菌菌株或其培养液进行制备，所述曲霉属真菌菌株单独培养于液体培养基中。
4.如权利要求3所述的共培养方法，其中，所述鞘氨醇单胞菌属细菌菌株与所述曲霉 属真菌菌株以1000 1. 0至1000 0. 1的比例进行混合。
5.一种细菌混合物的培养液，所述细菌混合物通过权利要求3所述的共培养方法进行 培养。
6.一种由式1或式2表示的化合物，所述化合物分离自细菌混合物的培养液，所述细菌 混合物通过权利要求3所述的共培养方法进行培养式1 η表示S的数目，为1-4;以及式2 X为H或烷基，可为不同或相同的基团，并且包括不对称碳原子的异构体。
7.如权利要求6所述的化合物，其中，所述化合物由式3或式4表示
8.如权利要求6所述的化合物，其中，η为3或4。
9.一种含有权利要求5所述培养液或权利要求6-8所述化合物之一的抗癌剂。
10.如权利要求9所述的抗癌剂，其中，所述癌症为胃癌、肝癌、结肠癌、肺癌或前列腺癌。
11.一种含有权利要求5所述培养液或权利要求6-8所述化合物之一的抗菌剂。
12.如权利要求11所述的抗菌剂，其中，所述抗菌剂对于下述菌类显示出抗菌作用 权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属细菌菌株、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、鼠伤寒沙门氏 菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、烟曲霉菌或红色毛癣菌。
13.一种对权利要求6所述的glionitrin进行纯化的方法，所述方法包括下述步骤(1)通过共培养方法制备培养液，然后通过向所述培养液中加入有机溶剂或吸附树脂 进行提取，所述共培养方法包括下述步骤培养细菌混合物，所述细菌混合物通过向权利要 求1所述的鞘氨醇单胞菌属细菌菌株的培养液中加入权利要求2所述的曲霉属真菌菌株或 其培养液进行制备，所述曲霉属真菌菌株单独培养于液体培养基中；(2)在减压下，将步骤(1)的提取物进行干燥，然后用柱层析法得到各个组分；以及(3)用柱层析法从步骤(2)的组分中纯化权利要求6所述的glionitrin。
14.权利要求5所述培养液或权利要求6-8所述化合物之一在生产抗癌剂方面的用途。
15.一种用于预防癌症以及改善健康状况的健康食品，所述健康食品包含权利要求5 所述的培养液或包含权利要求6-8所述的化合物之一作为活性成分。
16.一种用于预防癌症以及改善健康状况的健康食品，所述健康食品包含权利要求5 所述的培养液或包含权利要求6-8所述的化合物之一作为活性成分。
17.一种用于预防细菌性疾病以及改善健康状况的健康食品，所述健康食品包含权利 要求5所述的培养液或包含权利要求6-8所述的化合物之一作为活性成分。
18.一种用于对癌症进行预防和治疗的方法，所述方法包括下述步骤向受试者给予 治疗有效剂量的权利要求5所述的培养液或权利要求6-8所述的化合物之一。
19.一种用于对细菌性疾病进行预防和治疗的方法，所述方法包括下述步骤向受试 者给予治疗有效剂量的权利要求5所述的培养液或权利要求6-8所述的化合物之一。
全文摘要
本发明涉及鞘氨醇单胞菌属细菌菌株和曲霉属真菌菌株共培养方法，其中，新型鞘氨醇单胞菌属细菌菌株KMK-001培养于液体培养基中，并且向上述培养液中加入单独培养于另外的液体培养基中的新型曲霉属菌株KMC-901。本发明还涉及由上述方法生物合成的新型glionitrin，以及包含所述glionitrin或其药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物。本文所述的glionitrin对于癌细胞具有较强的细胞毒性作用，对于包括新型鞘氨醇单胞菌属细菌菌株KMK-001在内的10种致病菌具有抗生作用，从而使得glionitrin可有效地应用于抗生素或抗癌剂。
文档编号C12N1/20GK101868531SQ200880113896
公开日2010年10月20日 申请日期2008年10月23日 优先权日2007年11月20日
发明者朴贤峰, 权学哲, 柳智慧, 梁贤玉 申请人:韩国科学技术研究院