乳腺癌联合诊断标志物及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物化学与分子生物学领域，具体设及乳腺癌联合诊断标志物及检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 中国癌症负担在不断增加，每年有160万人被诊断为癌症，120万人死于癌症。和 其他很多国家一样，乳腺癌是中国女性最常见的癌症，在全球范围内，中国占据新诊断乳腺 癌病例的12. 2%，占据乳腺癌死亡的9. 6%。
[0003] 乳腺癌属于全身性疾病，发病率呈逐年上升、发病年龄呈逐渐年轻化的趋势，作 为一种高度异质性肿瘤，早期可出现淋己或血行转移，是女性常见的恶性肿瘤之一。
[0004] 虽然目前中国乳腺癌发病率低，但是从90年代W来，中国的乳腺癌发病率增长速 度是全球的两倍多，城市地区尤为显著。目前，乳腺癌是中国女性发病率最高的癌症，癌症 死亡原因位居第六。截至2008年，中国总计169452例新发浸润性乳腺癌，44908例死于乳 腺癌，分别占到全世界的12. 2%和9. 6%。
[0005] 中国乳腺癌全年检出人数是欧洲（2008年共计332000例，总人口四亿 九千八百万）的一半，与美国（2008年共计182000例，总人口Ξ亿零四百万）基本相当。 如果运一趋势保持不变，到2021年，中国乳腺癌患者将高达250万，发病率将从不到60例 /10万女性（年龄在55岁到69岁之间）增加到超过100例/10万女性。化ancet化col 2014 ；15(7):e279-e289)
[0006] 目前，国际上对乳腺癌的预警和早期诊断的技术主要有W下Ξ种：
[0007] 1.临床体格检查：定期接受临床体格检查是早期发现乳腺癌的有效方法之一。始 于1963年纽约的健康保险计划化IP)，历经18年研究发现，接受定期临床体格检查的妇女 乳腺癌死亡率比对照组低23%。我国也开展了一系列乳腺癌的预防工作，但是，乳腺癌普查 耗资巨大，成本/效果比高。
[0008] 2.影像学诊断法：影像学检查是W钢祀X线摄片为主要手段，辅W超声扫描和MRI 扫描。钢祀X线摄片方法能发现细小巧化点，如果表现为泥沙样巧化或细颗粒样巧化，或者 每lcm2内< 0. 5mm的超过5枚则可提示乳腺癌。但对于不典型的病变，尤其是致密型乳腺 内的病变及近胸壁的病变易漏诊。2014年2月11日发表在著名的《英国医学杂志》上一 项研究报告40~59岁女性的每年乳腺钢祀X线检查并不能降低乳腺癌的死亡率，也不优 于普通体检的诊断率，而且有22%的女性因为乳腺钢祀X线检查被过度诊断了度ritish MedicalJournal, 2014, 348.)。另外，我国女性乳腺小而致密，运也会降低患者接受钢祀检 查的阳性率。
[0009] 3.生物祀标早期检测：包括乳腺癌相关基因普查，例如BRCA1和BRCA2的突变分 析；乳头溢液特异物检测及血清肿瘤标志物的测定。Her-2/neu癌基因在乳腺癌中过度表 达，在血清中可W检测到化r-2蛋白片断。通过酶联免疫反应测定血清化r-2水平，可W作 为诊断乳腺癌的指标之一。但目前分子诊断研究大多关注基因多态性与乳腺癌的关系，只 能给出患者的易感风险，不适用于临床疾病的诊断。
[0010] 因此，本领域迫切需要建立新的乳腺癌检查技术，能够早期客观、灵敏和稳定的诊 断乳腺癌，W便进行及时、有针对性的治疗，提高患者的生存质量和生存率，降低医疗成 本，节约社会资源。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是针对现有技术中检测手段的上述缺陷，提供新的乳腺癌联合诊断 标志物。
[0012] 本发明的另一目的是提供基于上述标志物制备的检测试剂盒，与常规诊断方法相 比，本发明试剂盒检测方法具有创伤小、检测快速、高通量、灵敏性和特异性好等特点，能更 好地进行乳腺癌的早期诊断及疗效评价。
[0013] 本发明提供了RECQLRECQL4及RECQL5基因作为联合标志物在制备乳腺癌检测和 /或疗效评价试剂中的应用。
[0014] 人类RecQ旋解酶是一种多功能DNA旋解酶，能利用水解Ξ憐酸核巧（NTPs)产生 的能量分离双核巧酸链，在DNA代谢的多个方面发挥重要作用，参与各种类型的DNA修复， 包括错配修复、核巧酸切除修复和直接修复酶。
[0015]RECQLRECQL4及RECQL5基因均是RecQDNA解旋酶家族的成员。研究表明RECQL 基因突变与肿瘤易感性密切相关，如：乳腺癌、骨肉瘤及可切除膜腺癌等。RECQL4广泛参与 DNA的复制和损伤修复。早期研究证实，RECQL4突变会导致RTS，BGS和RAPA3种综合症， 其中RTS和BGS患者都有很高的骨肉瘤和淋己瘤发生倾向。此外，RECQL4还可通过维持 线粒体和端粒的基因稳定避免多种肿瘤发生，RECQL4也被认为与血液恶性肿瘤爆发相关。 最近的一项研究表明，RECQL5基因位点突变与乳腺癌相关灯umorBiol. 2014 ;35:12201 -12204)。上述基因作为肿瘤的易感基因，目前的研究重点为DM位点突变与疾病的相关性， 但是易感基因位点突变多用来提供某种疾病的患病风险，只检测易感基因的位点突变并不 适用于临床进行疾病的诊断和疗效评估。基于此，我们对上述易感基因的表达量与乳腺癌 的关系进行了考察。
[0016] 我们发现并通过研究证实外周血单核细胞中和尿液游离的RECQLRECQL4及 RECQL5基因的mRNA表达水平在患者体液尤其是外周血单核细胞和尿液中发生显著变化， 并且运种变化与乳腺癌的发生和治疗密切相关，RECQLRECQL4及RECQL5基因的mRNA表达 可W作为乳腺癌早期诊断及疗效评价的生物标志物。
[0017] 本发明还提供乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，包括 RECQLRECQL4及RECQL5基因的特异性扩增引物及探针，探针的核巧酸序列5'端连接有巧 光报告基团，非5'端连接有巧光泽灭基团，其中
[001引 REC化扩增引物组的核巧酸序列如沈QIDN01~2所示，
[0019]REC化特异性探针的核巧酸序列如SEQIDNO: 3所示；
[0020]RECQL4扩增引物组的核巧酸序列如沈QIDNO:4~5所示，
[0021]RECQL4特异性探针的核巧酸序列如SEQIDN0:6所示；
[002引 RECQL5扩增引物组的核巧酸序列如沈QIDNO:7~8所示，
[0023] RECQL5特异性探针的核巧酸序列如SEQIDN0:9所示。
[0024] 本发明筛选的上述引物及探针序列，能够高效特异地扩增相应基因，只需采取待 检测者的外周血和晨尿即可，可广泛运用于乳腺癌患者RECQLRECQL4及RECQL5基因扩增 水平的检测，采用RT-PCR技术进行Ξ个祀基因的定量测定，具有特异性和灵敏度高、操作 简单及易于大通量筛查的优点。
[00巧]优选地，上述乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，还包括内 参基因GAPDH的特异性扩增引物及探针，
[002引 GAPDH扩增引物组的核巧酸序列如沈Q ID NO: 10~11所示，
[0027] GAPDH特异性探针的核巧酸序列如SEQ ID NO: 12所示；
[0028] 探针的核巧酸序列5'端连接有巧光报告基团，非5'端连接有巧光泽灭基团。
[0029] GAPDH主要目的是作为内参，W矫正检测偏差，进一步提高引物组的检测精准度。
[0030] 优选地，上述任一乳腺癌检测和/或疗效评价的特异性RT-PCR引物和探针，探针 的核巧酸序列5'端连接有巧光报告基团FAM，3'端连接有巧光泽灭基团TAMRA。FAM即6-簇 基巧光素，TAMRA即6-簇基四甲基罗丹明。
[0031] 本发明还提供一种乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，包括W上任一所述的检测 乳腺癌的特异性RT-PCR引物和探针。
[0032] 优选地，上述乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒中，还包括阳性模板，阳性模板包 括纯化后的：REC化基因扩增产物、RECQL4基因扩增产物、RECQL5基因扩增产物和GAPDH基 因扩增产物。
[0033] 该四种基因扩增产物的阳性模板，主要用于标准曲线的绘制，方便对检测结果进 行定量分析。
[0034] 优选地，上述乳腺癌检测和/或疗效评价试剂盒，分为RECQL、RECQL4、RECQL5和 GAPDH运4个基因的实时巧光定量PCR反应体系和运4个基因的阳性模板体系，其中，
[003引每个基因的实时巧光定量PCR反应体系19.0化，包括PCR反应缓冲液10化、 浓度10μΜ的该基因扩增引物各0.8 浓度2μΜ的该基因特异性探针1.0μL和 RNase-freewater7. 2μL;
[0036] 每个基因的阳性模板体系包括浓