，相反，人为降低BTRC的 表达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著增加，表明细胞侵袭能力增强，NC为阴性对 貝胥（negativecontrol)。
[0040] 图10为在鼻咽癌细胞Η肥2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体度TRCOE) 和RNA干扰序列（siBTRC)后，细胞划痕实验证实，人为促进BTRC的表达后，鼻咽癌细胞从 划痕两边往划痕中央迁移速度明显减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迁移能力降 低，相反，人为降低BTRC的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迁移速度明显提高， 划痕愈合的时间缩短，表明细胞运动迁移能力提高，NC为阴性对照（negativecontrol)。
[0041] 图11为在鼻咽癌细胞Η肥2和5-8F中导入BTRC过表达载体度TRC0E)和RNA干 扰序列（SiBTRC)后我们检测BTRC基因编码的β化CP蛋白及底物β-catenin和Snail的 表达情况，人为促进BTRC的表达后加速了β-catenin和Snail的降解，细胞中β-catenin 和Snail的表达量减少，反之人为降低BTRC的表达后β-catenin和Snail的降解减少， 细胞中β-catenin和Snail的表达量增强；与上皮-间质转换（epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达也发生了相应的变化，人为促进BTRC的表达后上皮 细胞的标志物Z0-1、E-ca化erin和Claudin-1的表达升高，而间质细胞的标志物ZEB1、 N-ca化eriruVimentin及Slug的表达降低，表明BTRC可W抑制上皮-间质转换；反之人为 降低BTRC的表达后，上皮细胞标志物表达降低，而间质细胞的标志物表达升高，表明BTRC 低表达后，细胞由上皮向间质样细胞转换，侵袭转移能力增强。
[0042] 图12为BTRC基因在鼻咽癌发生发展过程中的作用机制图，BTRC基因可调控上 皮-间质转换过程中关键分子β-catenin和Snail的表达，BTRC高表达时β-catenin 和Snail容易降解，细胞维持在上皮样状态，不容易发生侵袭转移，当BTRC表达下调时， 0-catenin和Snail不容易降解，细胞由上皮样向间质样转换，容易发生侵袭转移，导致患 者较快死亡。
【具体实施方式】
[0043] W下结合【具体实施方式】进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0044] 实施例1，利用基因忍片技术筛选发现BTRC基因在鼻咽癌中表达下调
[004引 1.材料与方法：
[004引 1)基因忍片：
[0047]所用基因忍片为Agilent公司SurePrintG3HumanGeneExpressionv3 8χ60Κ Microarray(货号：G4851C)，包含人类27, 958个已知基因的探针。
[004引。主要试剂：
[0049]
[0050] 如总RNA的纯化
[0051] 收集6例正常鼻咽上皮组织和10例鼻咽癌组织，用Trizol(invitrogen公司产 品）抽提总RNA，如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和忍片杂交结果。所W使 用QIAGENRNcasy?Kit纯化总RNA，详细操作原理和方法见RNeasyMiniProtocol。
[0052]①取总RNA《100μg溶解于 100μ1RNase free水中，加入 350μ1Buffer RLT 并充分混匀。
[005引②加入250μ1无水乙醇，Tip头充分混匀。
[0054] ③将共计700 μ1含总RNA的溶液转入套在2ml离屯、管内的RNeasy柱子内， >8000g离屯、30秒，弃去滤过液。
[00巧]④吸取500μ1BufferR阳到RNeasymini柱子内，> 8000g离屯、洗涂30秒，弃 去滤过液，再用500μ1BufferRPE在> 8000g离屯、洗涂2min，弃去滤过液和2ml的套管， 将RNeasymini柱子转入一新的1. 5mlEppendo;rf管中。
[0056]⑥吸取 40μ1RNase free的水，> 8000g离心洗脱Imin。
[0057] ⑧重复步骤⑥一次。
[0058] 4)cDNA第一链和第二链一步法合成
[005引①取0. 2 μgRNA于0. 2ml离屯、管中，如下配置反应溶液：
[0060]
[0061] ②65°C保溫10分钟，冰浴5分钟，注意：提前把5XFirstStrandBμffer在80°C 预热3-4分钟
[0062] ③配置如下cDNA合成体系：
[0063]
[0064] ④将上述4. 7μ1mix加入变性后冰浴的RNA中。
[0065] ⑥用枪头混匀，之后离屯、。
[0066]⑧PCR仪上：
[0067] 40°C 化our
[0068] 70°C 15min
[0069] move to ice 5min
[0070]W巧光标记cRNA合成
[0071]①如下配置Transcriptionmix:
[0072]
[0073]②加入6μ1Transcriptionmix并混匀
[0074]③PCR仪上：40°C化ours。
[00巧]6)cRNA纯化（QIAGENRNca巧寬Mini Kit)
[0076] 用QIAGENRNeasyMinikit纯化cRNA，具体方法步骤如下：
[0077] ①加入84μ1RNase free水，加入350μ1Buffer化Τ并充分混匀。
[0078] ②加入250μ1无水乙醇，Tip头充分混匀。
[0079] ③将共计700μ1含总RNA的溶液转入套在2ml离屯、管内的RNeasy柱子内， > 8000g离屯、15-30sec，弃去滤过液。
[0080]④吸取500μ1BufferR阳到RNeasymini柱子内，>8000g离屯、洗涂 15-30sec， 弃去滤过液，再用500μ1BufferRPE在> 8000g离屯、洗涂2min，弃去滤过液和2ml的套 管，将RNeasymini柱子转入一新的1. 5mlEppendo;rf管中。
[0081]⑥吸取 30μ1RNasefree的水，静置Imin, > 8000g离屯、洗脱Imin。
[0082] ⑧重复步骤5-次。
[008引 7)cRNA浓度测定
[0084] ①cRNA质控：用分光光度计分析RNA浓度。需要在260和280nm测定吸光度来确 定样品的浓度和纯度，A260/A280应接近2. 0 (1. 9-2. 1之间）
[0085] ②计算并调整cRNA的含量：
[0086]8)巧光分子浓度及渗入率计算：
[0087]切3-浓度（pmol/μ1) =A552/0. 15
[008引 切3-渗入率（pmol/μg)=切3-浓度/cRNA浓度（μg/μ1)
[0089] 9)cRNA样品片段化和忍片杂交
[0090] ①按下表配制片段化混合液，然后在60°C溫浴30min进行片段化，冰浴Imin
[0091]
[0092]②加入 2XGExHybridizationBuffer混匀
[0093]
[0094] ③上忍片，65°C 17小时，1化pm滚动杂交
[0095] 10)忍片洗涂
[0096] ①取出忍片于洗液1中洗涂1分钟
[0097] ②再将忍片放入洗液2中洗涂1分钟（37°C)
[009引 11)忍片扫描：Agilent扫描仪中扫描，分辨率为3μπι/5μπι，扫描仪自动W 100% 扫描一次。
[0099] 12)数据分析：用基因忍片中的内参基因对基因忍片原始数据进行归一化 (Normalize)处理后，用SAM软件（Si即ificanceAnalysisofMicroarrays)筛选正常鼻 咽上皮与鼻咽癌组织中的差异表达基因，用Genesis软件绘制差异表达基因的表达图谱。
[0100] 2.结果
[0101] 利用基因忍片技术，共筛选得到鼻咽癌和正常鼻咽上皮间差异表达基因2461个， 其中在鼻咽癌中表达上调的基因与1677个，在鼻咽癌中下调的基因有784个（图1)。
[0102] 其中BTRC基因在鼻咽癌组织中表达显著下调（P= 0. 001，图2)。
[0103] 实施例2,实时巧光定量PCR法检测证实BTRC基因在鼻咽癌中表达下调
[0104] 1.材料与方法：
[0105] 收集9例正常鼻咽上皮组织和28例鼻咽癌组织，用Trizol(invitrogen公司产 品）抽提总RNA，2JigRNA用SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystem逆转录试剂盒 (Invitrogen公司产品）逆转录成cDNA后，用如antiTectSYBRGreenPCR试剂盒（Qiagen 公司产品）进行实时巧光定量PCR检测BTRC及内参基因GAPDH的表达。BTRC及GAPDH基 因引物均由Invitrogen公司合成，序列如下：
[0106]BTRCforward, 5' -CCCCTTCTCGAACATACACCT-3'，
[0107]BTRCreverse, 5'-AGTCTCAAAGCCCTGCTCCT-3'
[0108]GAP畑forward, 5> -AACGGATTTGGTCGTATTGG-3>，
[0109]GAPDHreverse, 5' -TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'
[0110] 实时巧光定量PCR反应体系
[0111]
[0112] 实时巧光定量PCR反应步骤 「01131
[0115] 反应结束后确认实时巧光定量PCR的扩增曲线和烙解曲线，各样本BTRC基因的 表达强度根据CT值（t虹esholdcyclevalues)、内参基因（GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算P值。
[011引 2.结果
[0117]BTRC基因在正常对照组织中表达较高，而在大部分鼻咽癌组织中表达下调 P<0. 05(图 3)。
[0118] 实施例3,免疫组织化学方法检测BTRC编码的βTrCP蛋白在鼻咽癌中的表达
[0119] 1.材料与方法
[0120] 1.1免疫组化检测试剂盒及其他主要试剂
[012。 BTRC