抗体购自CellSi即aling公司；S-P二步法即用型抗鼠或抗兔（Two-StepTM Anti-MouseorRabbitDetectionReagent,HRP)免疫组化检测试剂盒（Novocastra L油oratories,Ltd.);正常非免疫兔和羊血清购于北京中山生物技术公司。PBS缓冲液 (pH7. 2 - 7. 4,化C1 137mmol/L，KC1 2. 7mmol/L，胞2册044. 3mmol/L，KH2PO4I. 4mmol/L); 0.Olmol/L巧樣酸盐缓冲液；0. 1%膜蛋白酶液；3%甲醇-H2O2溶液；组织微阵列切片专用 封片胶。RPMI1640，DMEM，Lipofectamine，T;rizol，ssDNA(Invit;rogen) ;DEPC;Taq酶，蛋 白酶Κ，RNase值化se化ee)，膜酶（北京华美）。
[0122] 1. 2免疫组化检测βTrCP蛋白在组织微阵列中的蛋白表达
[0123] 1)组织石蜡切片经实验前处理后，脱蜡、水化。
[0124] 2)PBS洗，5minX3。
[012引如切片入3% &化中，阻断内源性过氧化物酶，室溫30min。
[0126] 4)PBS洗，5minX3。
[0127] 5)抗原修复：根据所检测蛋白的部位和抗体说明书推荐修复方法，使用微波或酶 消化抗原修复。微波抗原修复时，TMAs切片置于O.Olmol/L巧樣酸盐缓冲液中，缓冲液沸 腾后，调节至低火档，修复切片20min。酶消化抗原修复时，滴加0.1%膜蛋白酶液于切片， 37°C下消化 25min。
[012引 6)PBS洗，5minX3。
[0129] 7)滴加300μ1/TMAs片的正常山羊或兔血清封闭，室溫30min，甩去多余液体。滴 加即用型或浓缩一抗（按抗体说明书按1:50或1:100、1:200不等的比例稀释）300μ1/ TMs，保持切片在密封的湿盒中，4°C冰箱内解育过夜。
[0130]8)PBS洗，5minX3。
[0131] 9)滴加即用型二抗，300μ1/TMAs片，室溫（25°CW上）比。
[0132] 10)PBS洗，5minX3。
[0133] 11)DAB显色5~20min，显微镜下控制染色程度。
[0134]入双蒸水中止反应，双蒸水冲洗lOmin。
[0135] 13)苏木素染复染2min，溫水分化。
[0136] 14)双蒸水冲洗10~15min。
[0137] 15)脱水、透明、封片胶封片。
[013引1. 3结果观察和检测结果数据库的建立
[0139] 光学显微镜下对每一例组织标本中的PTrCP蛋白表达进行观察。两位病理学专 家分别按W下一种判断标准进行结果计分：（1)根据阳性染色强度判断：细胞无染色为0 分；细胞呈浅栋色，记1分；细胞染成栋色，并无背景染色，或深栋色，但背景呈浅栋色，为中 等阳性，记2分；细胞呈深栋色，无背景着色，为强阳性，记3分。（2)根据细胞阳性表达数 计分：无阳性细胞表达，计0分；阳性表达细胞《25%，计1分；25%<阳性细胞数《50%， 计2分；阳性表达细胞数50 %W上，为强阳性，计3分。最终计分两者计分结果乘积得分。 结果为0~3分定义为低表达，最终计分为4~9分，为高表达。
[0140] 2 结果
[0141] 正常鼻咽上皮（Non-tumorNP巧中BTRC编码的βTrCP蛋白表达水平较高 (positive)，而在106例鼻咽癌（NPC)中有48例检测到βTrCP的低表达化OW)，其余58例 为高表达化i曲）。βTrCP蛋白在正常鼻咽上皮和鼻咽癌中的表达有显著差异（P<0. 05,图 4)。
[0142] 实施例4,原位杂交方法检测证实BTRC基因在鼻咽癌中表达下调且与鼻咽癌患者 不良预后相关
[0143] 1.材料方法
[0144] 1.1设计并合成杂交探针
[0145] 为了采用原位杂交方法检测BTRC基因的表达情况，我们设计了针对原位杂交检 测BTRC表达的寡核巧酸探针及阳性对照（GAPDH)的原位杂交寡核巧酸探针，序列如下：
[0146] BTRC探针 1 :5' -GTCTAAGTGAATTCTTCTCTGGTATTATCT-3'
[0147] BTRC探针 2 :5' -GTACTTGTGTTCCATACCTTTATAGTTCTA-3'
[0148] BTRC探针 3 :5' -ATCTCCAATTAGATTCTATTGTCTCAATGT-3'
[0149] GAP畑探针 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'
[0150] GAP畑探针 2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'
[0151] GAP畑探针 3 :5' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'
[0152] 采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核巧酸探针序列，合成过程中 探针序列中尿喀晚已标记生物素化io-U)。
[0153] 1. 2寡核巧酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂
[0154] 地高辛寡核巧酸加尾试剂值igOligonucleitideTailingKit2"dGeneration, Roche公司），抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒（Anti-Digoxigenin-POD， F油化agments，Roche公司），增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统（TSA?Biotin System,肥L700试剂盒，Perki址Imer公司），DAB染色试剂盒（北京中山公司），20x巧樣 酸钢缓冲溶液（salinesodiumcitrate,SSC)，硫酸葡聚糖值extransulphate),去离子 甲酯胺值eionizedF'ormamide)，多聚腺巧酸（polyadenylicacid，PolyA),多聚脱氧腺 巧酸（polydeox;yaden5dicacid,化lydA)，变性剪切的蛙精DNA(denaturedandsheared salmonspermDM,ssDNA)，酵母转运RNA(yeastt-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇值ΤΤ)，50χ邓 罕氏缓冲液值enhar化s'ssolution),憐酸缓冲液（PBSbuffer),胃蛋白酶Κ，牛血清白蛋 白度SA)，S乙醇胺灯ΕΑ)，ΤΝΒBuffeHO. 1ΜTris-HCl，抑7. 5,0. 15ΜNaCL，0. 5%Blocking Reagent),TNTBuffer(0.IMTris-肥 1，抑7.5,0. 15M化化，0.05%Tween20)，醋酸酢，阻 断子式齐ll(Blockin邑rea邑enta邑ent，Roche公司）。
[0155] 1. 3其他主要试剂和材料
[0156] 无水乙醇、90%酒精、70%酒精、50%酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液（pH7. 2~ 7. 4,化C1 137mmol/L，KC1 2. 7mmol/L，胞2册〇44. 3mmol/L，KH2PO4I. 4mmol/L) ;3 % 甲 醇-双氧水溶液（80%甲醇和30%双氧水配置）；0.Olmol/L巧樣酸盐缓冲液（citrate buffer，CB，p册.0±0.1，9ml0.1M巧樣酸溶液和41ml0.1M巧樣酸钢溶液加入450ml蒸馈 水中临时配置后再校正工作液抑值）；〇.1%膜蛋白酶；苏木素；1%盐酸酒精（1ml浓盐酸 +99ml70%酒精配置）；封片胶（PTSQlreMountII);专用盖玻片（480X240mm2)定制于 郑州玻璃仪器厂。Leica低烙点（58°C)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10%中性多聚 甲醒0).Olmol/l，抑7. 4,DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制），苏木素，伊红，中性封片树胶，盖 玻片，载玻片。1.4标记探针
[0157] 利用3-tailingDIGOli即ucleutideKit进行寡核巧酸探针标记，反应体系如 下。
[0158] lOOpmololigonucleotide+ddHzO= 9μ1(control:controloligonucleutide 5μ1+(1地2〇 4μ1)
[0159]
[0160]
[0161] 混匀，稍离屯、。37°C水浴反应30min，加2μ1邸TA(0. 2M，PH8. 0)中止反应。
[0162]1. 5寡核巧酸探针标记后纯化
[0163] 为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：
[0164] l)探针反应混合物（22μl)+2.5μl4MLiCl+75μll00%冷乙醇（-20°C).
[01巧]2)-70。(：沉淀6〇111111，〇尸20。(：化。
[0166] 3) 13.OOOXg4°C离屯、15min。
[0167] 4)弃上清，用50μ1冰冷的70% (V/V)乙醇洗涂。
[016引 5) 13.OOOxg4°C，离屯、5min。
[0169]6)弃上清，真空4°C干燥。
[0170] 7)用无菌双蒸水重溶探针。
[017。 1.6原位杂交检测存档石蜡切片中EBV-miR-BARTlO的表达
[0172] 石蜡切片杂交前处理
[0173] 1)4°C保存的石蜡切片置于58°C烤片30min，烙化表面石蜡。
[0174] 2)二甲苯依次脱蜡3X5min。
[0175] 3)梯级酒精洗涂，100 %酒精2X2min- 95 %酒精1X5min- 70 %酒精 1X5min一 50 % 酒精 1X5min一DEPC水洗涂 2X3min一DEPC-PBS洗涂 2X5min。
[017引 4)滴加300μ1胃蛋白酶K(l0yg/na)于切片上，37°C消化20min。
[0177] 5)切片入PBS(0. 1MPBS巧mg/ml谷氨酸）洗涂Imin，中止反应。
[0178] 6)切片入0. 2N肥以于37°C反应20-30min，增加组织的通透性。
[0179] 7)切片用4%多聚甲醒（0. 1MPBS溶解）后固定lOmin，室溫。
[0180] 8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酷处理。切片入0.25%乙酸酢 BufferI(0. 1MΞ乙醇胺），室溫lOmin。
[0181] 9) 1MPBS洗涂 2X5min。
[0182] 预杂交和杂交
[0183] 预杂交：-20°C保存的预杂交液，先置于37°C解育60mi