及C666-1按2X105个细胞/孔接种于 6孔板中，将6孔板置于37°C，5%C〇2培养箱中，待培养细胞生长至50-70%密度即可开始 BTRC表达载体或RNA干扰序列的转染；转染过程如下：
[0246] 在无菌EP管中加入100μ1制备好的携带BTRC真核表达质粒或SiBTRC的多聚赖 氨酸修饰的娃纳米颗粒悬液，与100μ1无血清培养基溫和混匀；用D-Hank'S液洗涂细胞3 次；将上述混合物中加入800μ1无血清培养基（无抗生素），溫和混匀后加入6孔板中的1 个孔；将6孔板置于C〇2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养 过夜。用携带PCDNA3. 1空载体的多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒作为实验对照。
[0247] 1. 6实时定量PCR检测过表达或干扰BTRC表达的效果：
[024引细胞转染成功后，抽提总RNA，逆转录，实时巧光定量PCR法检测BTRC表达，方法和 步骤同实施例2。
[0249] 1. 7Westernblotting检测过表达或干扰BTRC表达的效果及其下游分子的表 达：
[0巧0] Westernblotting检测BTRC编码的βTrCP蛋白、βTrCP的底物β-catenin和 Snail、上皮-间质转换相关分子，包括上皮细胞的标志物Z〇-l、E-ca化erinXlaudin-l，间 质细胞的标志物ZEB1、N-ca化erin、Vimentin、Slug,W及内参基因GAPDH表达的抗体购自 CellSi即alingTechnology公司。鼻咽癌细胞转染BTRC真核表达载体或RNA干扰序列后 收集细胞，抽提细胞中的总蛋白，常规Westernblotting方法检测上述蛋白的表达，GAPDH 作为内参基因。
[0巧1] 1.8细胞穿膜实验
[0巧2] 细胞穿膜（(transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小 室（孔径8μπι)及基质胶（Matrigel)购自美国抓公司，4%多聚甲醒固定液、结晶紫染液 (0.1%g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的 上室面，置37°C30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按抓公司说明书进行基质胶膜水 化。
[0巧引在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和1X105个转染了BTRC过表达载 体或干扰序列（SiBTRC)的鼻咽癌细胞，用转染空白载体的细胞作为对照。在化answell小 室下层加入含20%胎牛血清的培养基。细胞继续培养36小时后，用4%多聚甲醒固定液固 定，结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基 质胶膜的鼻咽癌细胞。
[0巧4] 1. 9细胞划痕实验
[ο巧5] 细胞划痕实验是验证肿瘤细胞迁移能力的实验方法。转染了BTRC过表达载体或 干扰序列（siBTRC)的鼻咽癌细胞接种于6孔板，用转染空白载体的细胞作为对照。待细胞 密度达到90%时，用200ulpipet在每个6孔板中划一条直线（划痕），随后在0、8、12、16、 24、32、48小时等各个时间点（视不同细胞迁移能力而定）在显微镜下观察划痕愈合情况， 拍照，并计算各组细胞迁移速度。
[0巧6] 2.结果
[0巧7] 2. 1在鼻咽癌细胞中成功地过表达或者干扰了BTRC基因的表达
[0巧8] 实时巧光定量PCR检测证实，在鼻咽癌细胞Η肥2、5-8F和C666-1中转染BTRC过 表达载体后，BTRC基因在鼻咽癌细胞中的表达显著升高（图7左），而鼻咽癌细胞HNE2、 5-8F和C666-1中转染BTRC的干扰序列后，BTRC基因在鼻咽癌细胞中的表达显著降低（图 7右），表明BTRC过表达载体或者RNA干扰序列转染成功。
[0巧9] 进一步地，我们用Westernblotting技术检测了过表达BTRC过表达或者干扰 BTRC基因表达后，其编码的蛋白PTrCP的表达，结果与实时巧光定量PCR检测的一致（图8) 〇
[0260] 2. 2在鼻咽癌细胞中过表达BTRC后细胞侵袭能力降低，干扰BTRC表达后细胞侵袭 能力增强
[0261] 为在鼻咽癌细胞Η肥2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体度TRC0巧和RNA 干扰序列（SiBTRC)后，细胞穿膜（transwell)实验证实，人为促进BTRC的表达后，能穿过 基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著降低，表明细胞侵袭能力减弱，相反，人为降低BTRC的表 达后，能穿过基质胶膜的鼻咽癌细胞数目显著增加，表明细胞侵袭能力增强（图9)。
[026引2. 3在鼻咽癌细胞中过表达BTRC后细胞迁移能力降低，干扰BTRC表达后细胞迁移 能力增强
[0263] 为在鼻咽癌细胞Η肥2、5-8F和C666-1中导入BTRC过表达载体度TRC0巧和RNA干 扰序列（SiBTRC)后，细胞划痕实验证实，人为促进BTRC的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边 往划痕中央迁移速度明显减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迁移能力降低，相反， 人为降低BTRC的表达后，鼻咽癌细胞从划痕两边往划痕中央迁移速度明显提高，划痕愈合 的时间缩短，表明细胞运动迁移能力提高（图10)。
[0264] 2. 4在鼻咽癌细胞模型中我们证实BTRC通过其底物β-catenin和Snail调控上 皮-间质转换，从而影响鼻咽癌的侵袭转移和预后
[0265] 在鼻咽癌细胞Η肥2和5-8F中导入BTRC过表达载体度TRC0巧和RNA干扰序列 (SiBTRC)后我们检测BTRC基因编码的βTrCP蛋白及底物β-catenin和Snail的表达 情况，人为促进BTRC的表达后加速了β-catenin和Snail的降解，细胞中β-catenin和 Snail的表达量减少，反之人为降低BTRC的表达后β-catenin和Snail的降解减少，细 胞中β-catenin和Snail的表达量增强；与上皮-间质转换（epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达也发生了相应的变化，人为促进BTRC的表达后上皮 细胞的标志物Z0-1、E-ca化erin和Claudin-1的表达升高，而间质细胞的标志物ZEB1、 N-ca化e;rin、Vimentin及Slug的表达降低，表明BTRC可W抑制上皮-间质转换；反之人为 降低BTRC的表达后，上皮细胞标志物表达降低，而间质细胞的标志物表达升高，表明BTRC 低表达后，细胞由上皮向间质样细胞转换，侵袭转移能力增强（图11)。
[0266] 由此，我们初步绘制了BTRC基因在鼻咽癌发生发展过程中的作用机制图（图12)， BTRC基因可调控上皮-间质转换过程中关键分子β-catenin和Snail的表达，BTRC高表 达时β-catenin和Snail容易降解，细胞维持在上皮样状态，不容易发生侵袭转移，当BTRC 表达下调时，β-catenin和Snail不容易降解，细胞由上皮样向间质样转换，容易发生侵袭 转移，导致患者较快死亡。
【主权项】
1.BTRC基因的应用方法，其特征在于，用于制备预测鼻咽癌复发和转移的制剂。2. 根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的BTRC基因的表达与鼻咽癌复 发和转移成负相关。3. 根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，所述的预测鼻咽癌复发和转移的 制剂包括：PCR检测试剂、原位杂交检测试剂或免疫组织化学试剂。4. 根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，PCR检测试剂为荧光实时定量PCR试 剂。5. 根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于，荧光实时定量PCR试剂所用的引物包 括： BTRCforward, 5' -CCCCTTCTCGAACATACACCT-3'， BTRCreverse,5' -AGTCTCAAAGCCCTGCTCCT-3' GAPDHforward, 5' -AACGGATTTGGTCGTATTGG-3'， GAPDHreverse,5' -TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。6. 根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，原位杂交检测试剂的寡核苷酸探针 及阳性对照的寡核苷酸探针，序列如下： BTRC探针 1 :5' -GTCTAAGTGAATTCTTCTCTGGTATTATCT-3' BTRC探针 2 :5' -GTACTTGTGTTCCATACCTTTATAGTTCTA-3' BTRC探针 3 :5' -ATCTCCAATTAGATTCTATTGTCTCAATGT-3' GAPDH探针 1 :5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH探针 2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3， GAPDH探针 3 :5' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。 7. BTRC基因的应用方法，其特征在于，用于制备防止鼻咽癌复发和转移的制剂。8. 根据权利要求7所述的BTRC基因的应用方法，其特征在于，用于制备BTRC基因表达 产物β-TrCP的底物β-catenin和Snail的降解的制剂。9. 根据权利要求8所述的应用方法，其特征在于，用于制备抑制上皮-间质转换制剂。10. 根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于，促进BTRC基因的表达能使上皮 细胞的标志物ZO-1、E-cadherin和Claudin-1的表达升高，而间质细胞的标志物ZEB1、 N-cadherin、Vimentin及Slug的表达降低。
【专利摘要】本发明公开了BTRC基因的应用方法，用于制备预测鼻咽癌复发和转移的制剂，研究表明，BTRC在鼻咽癌组织中的表达水平与鼻咽癌的侵袭转移及预后成负相关，鼻咽癌组织中BTRC基因表达水平较低的患者更容易复发和转移，因而生存时间较BTRC基因表达水平高的患者更短。表明BTRC基因可以作为鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断等的分子标记，针对BTRC设计专用荧光实时定量PCR引物、原位杂交探针及免疫组织化学检测试剂盒等，用于检测鼻咽癌组织中BTRC的表达水平有望为临床上对鼻咽癌进行复发和转移的预测提供参考。此外，还能用于制备防止鼻咽癌复发和转移的制剂，为鼻咽癌的防治提供新的途径。
【IPC分类】A61K48/00, C12Q1/68, G01N33/573, A61P35/00, A61K31/7088
【公开号】CN105256017
【申请号】CN201510649041
【发明人】李桂源, 曾朝阳, 熊炜, 晏其佳, 李小玲, 李夏雨, 张文玲, 范松青, 龚朝建, 石磊, 周鸣, 向波
【申请人】中南大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月9日