专利名称：用于制备多克隆抗体的多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于制备多克隆抗体的多肽及其应用。
背景技术：
KIAA0649为在研究1A6/DRIM时，利用酵母双杂交的筛选技术首次发现的一个 功能未知基因。早期研究发现KIAA0649在小鼠成纤维细胞NIH3T3中的表达使细胞 发生恶性转化(Yang L， Zhao J， Lu W, Li Y， Du X， Ning T, Lu G， Ke Y， KIAA0649， a lA6/DRIM-interacting protein with the oncogenic potential, ^57oc力e历历'。M M C。 2005， 334: 884 - 890)。关于KIAA0649序列分析见文献Manabu Nakayama， Reiko Kikuno and 0samu Ohara. Protein-Protein Interactions Between Large Proteins: Two-Hybrid Screening Using a Functionally Classified Library Composed of Long c腿s. Genome Res., 2002， 12: 1773-1784. Fr6d6ric Colland， Xavier Jacq， etc. Functional Proteomics Mapping of a Human Signaling Pathway. Genome Res. ，2004 ，14 :1324-1332.禾卩 Ken-ichi Ishikawa，Takahiro Nagase，etc. Prediction of the Coding sequence of Unidentified Human Genes. X. The Complete Sequence of 100 New cDNA Clones from Brain Which Can Code for Large Protein in vivo. DNA Res. ，1998，5:169-176。
很多实验室在分离新的与疾病相关的基因，为研究这些基因的功能，首先要制 备抗体，制备单克隆抗体需要表达和纯化蛋白片段或全长蛋白，很多蛋白的表达存 在很大的问题，而不能制备单克隆抗体。通过合成多肽制备多克隆抗体成为唯一的 选择，在合成多肽制备多克隆抗体后，很多时候制备的抗体只能识别外源表达的蛋 白，而对内源蛋白的识别是一个很难解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备多克隆抗体的多肽及其应用。 本发明所提供的用于制备多克隆抗体的多肽，包括3个多肽，多肽l、多肽2 和多肽3，所述多肽1的氨基酸序列为序列表中的序列5，所述多肽2的氨基酸序 列为序列表中的序列6，所述多肽3的氨基酸序列为序列表中的序列7。当然所述用于制备多克隆抗体的多肽可仅有所述多肽1、多肽2和多肽3组成。 所述多肽l、多肽2和多肽3可独立包装，在制备多克隆抗体时，将它们按照 需要混合。所述多肽l、多肽2和多肽3也可混合包装，混合物中所述多肽l、多 肽2和多肽3的质量可比为(1-3) : (1-3) : (1-3)。如所述多肽l、多肽2
和多肽3的质量比为1: 1: 1。
本发明所述的多肽可作为抗原制备多克隆抗体。 以所述的多肽为抗原免疫动物获得的多克隆抗体也属于本发明的保护范围。
所述多克隆抗体为抗KIAA0649蛋白的抗体。
本发明的用于制备多克隆抗体的多肽免疫动物成功地获得了能够识别外源和 内源KIAA0649蛋白的抗体，KIAA0649多克隆抗体具有较高的特异性。该抗体可用 于Western blot和免疫荧光的分析，对KIAA0649进行功能研究提供了很好的抗体。
图1为人KIAA0649亲水性、抗原性和表面暴露性分析。 图2为KIAA0649多克隆抗体Abl特异性的鉴定。 图3为KIAA0649多克隆抗体Ab2特异性的鉴定。 图4为KIAA0649多克隆抗体Ab3特异性的鉴定。
图5为KIAA0649在细胞内的定位和KIAA0649多克隆抗体Ab3用于免疫荧光的 鉴定。
具体实施例方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法。
下述实施例所用实验材料 新西兰家兔购自北京大学医学部动物中心。
细胞培养基DMEM购自Gibco公司。 胎牛血清购自Hyclone公司。
转染用脂质体Lipofect層INE2000购自Invitrogen公司。
PVDF膜购自Amersham Pharmacia Biotech公司。
ECL Western blot detection发光试齐鹏自GE Healthcare公司。
异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗兔IgG、四甲基异硫氰酸罗丹明红(TRITC)
标记的山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记的二抗IgG均购自北京中杉金桥生物
技术公司。自Sigma公司。 其他试剂均为国产分析纯或进口分装试剂。 实施例1、用于制备多克隆抗体的多肽 1)用于制备多克隆抗体的多肽的获得
利用TMHMM (http://www. cbs. dtu. dk/services/TMH應-2. 0/)软件分析 KIAA0649蛋白的序列;利用咖Astar软件包(DNASTAR Inc., Madison, WI， USA) 进行多序列比对以及KIAA0649的抗原性、亲疏水性及表面暴露性预测(臧林泉， 邱鹏新，肖茹，等.YZ22蛋白的生物信息学分析及其多克隆抗体的制备.细胞与分子 生物学杂志，2006， 22 (2) : 205 — 207.李婷，郭晓欢，等.抗CMTM4多克隆抗体 的制备、纯化和鉴定.细胞与分子免疫学杂志，2008， 24 (1) : 41_44)。
利用DNAstar软件，对KIAA0649全长蛋白质一级结构进行了分析(图1)。选 择多肽的原则是具有较高的亲水性和抗原性、同时表面暴露性较强。选取不同的 多肽(表l)免疫动物来制备KIAA0649抗体。
表l.制备KIAA0649抗体的多肽
多肽的名称氨基酸序列
多肽4序列表中的序列1
多肽5序列表中的序列2
多肽6序列表中的序列3
多肽7序列表中的序列4
多肽l序列表中的序列5
多肽2序列表中的序列6
多肽3序列表中的序列7
上述7种多肽由杭州中肽公司合成，并将上述7种多肽分别与小鼠钥孔虫戚血 蓝蛋白(KLH)偶联。 2)制备抗体1 合成的DNA片段序列
pCI-Flag-p13-F: 5' -CTAGACCACCATGGACTACAAGGACGACGAT GACAAGGAATTCAAGCTTGGGCCCGGTACCGCTAGCGC-3';
pCI-Flag-p13-R: 5， -GGCCGCGCTAGCGGTACCGGGCCCAAGCTTGAATTCCTTGTC ATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGT-3，。
5将pCI-Flag-p13-F和pCI-Flag-pl3-R DNA片段通过复性形成双链DNA。
用限制性内切酶NheI和NotI (购自NEB公司)酶切退火形成的双链DNA，与 同样酶切的pCI-neo (Promega公司)连接，得到pCI-neo-Flag载体。
以pcDNA3. 1—KIAA0649 (Yang L， Zhao J， Lu W， Li Y， Du X， Ning T， Lu G， Ke Y， KIAA0649, a 1A6/DRIM-interacting protein with the oncogenic potential.
5iop/ /Pes Co 2005， 334: 884 - 890X北京大学)为模板，PCR扩增KIAA0649 全长DNA，所用引物序列如下
Forward primer: 5, ATCGAAGCTTGAATTCAGCGGCAGCGGCtttctcatgaacgcttctcca3，;
Reverse primer: 5' ATCGGCTAGCTTActtagaccttcactactga3，。
PCR产物经限制性内切酶EcoRI和NheI (购自NEB公司)酶切后与同样酶切的 pCI-neo-Flag载体连接，得到pCI-neo-Flag-KIAA0649质粒。
HeLa细胞在含有10。/。胎牛血清的DMEM培养基中，37°C， 5%C02，细胞培养箱培 养。转染前一天，将1X106个转染细胞种至培养瓶，通过LipofectAMINE2000转染 pCI-neo-Flag-KIAA0649质粒，转染按LipofectAMINE2000说明书进行，获得表达 Flag-KIAA0649蛋白的HeLa细胞。以转入pCI-neo-Flag载体的HeLa细胞作为对照。
将KLH偶联的多肽4送南京金斯特公司制备抗KIAA0649的多克隆抗体。将该 抗体命名为抗体l (Abl)。
Western blot对纯化的抗体1进行鉴定。
Western blot方法如下
将上述转染了 Flag-KIAA0649的HeLa细胞用EBC250裂解(0. 5% NP-40、 250 raM NaCl、 50 mM Tris-HC1 (PH7. 4 ) 、 1 raM EDTA、 1 mM PMSF、 ImM NaF、 1 mM Na3V04、 2u g/ml亮肽素、2 u g/ml aprotinin蛋白酶抑制剂)冰上裂解10分钟后12000rpm， 4。C离心30分钟，上清液即为表达Flag-KIAA0649蛋白的HeLa细胞总蛋白。将总 蛋白通过SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜上，将膜用5%脱脂牛奶-PBST (含有 0. 5%Tween20的PBS)封闭1小时后，与抗体1反应1小时；用PBST洗涤3次后加 入辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(北京中杉金桥生物技术公司)反应1小时。PBST 洗涤后按照说明书通过ECL-Western blot Detection Reagent发光，然后在暗室 通过X光片曝光。
Western blot结果如图2所示，Abl只能识别外源转染的Flag-KIAA0649蛋白，不能特异识别细胞内源的KIAA0649蛋白，而且有很高的非特异性。
图2中，1和3为Flag-KIAA0649蛋白，2和4为内源的KIAA0649蛋白。
3) 制备抗体2
将KLH偶联的多肽5、 6和7按照100ug、 100ug和100ug混合后免疫新西兰兔， 初次免疫将300 u g的多肽混合物用PBS稀释至lml后与等量的弗氏佐剂充分混合， 于两足跪部各0.25ml进行皮下注射，其余后背部多点皮下注射，之后每2周加强 免疫1次，使用同等剂量的多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合后全部后背皮下多 点注射(.Manabu Nakayama， Reiko Kikuno and Osarau Ohara. Protein-Protein Interactions Between Large Proteins: Two—Hybrid Screening Using a Functionally Classified Library Composed of Long cDNAs. Genome Res. ， 2002， 12: 1773-1784)。第2次加强免疫后14天取兔耳源静脉血样通过ELISA检测效价， 至效价达1:105以上后将免疫兔处死，心脏取血获得血清。将血清用PBS稀释后与 多肽偶联的S印harose 4B亲和层析柱孵育，4。C过夜。PBS冲洗柱后用pH2. 4的 0. lmol/L的Tris-HCl (pH9. 0)中和并透析至PBS中，获得抗体2 (Ab2)。用BCA 蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)检测抗体浓度，SDS-PAGE电泳鉴定抗体2纯 度。
通过Western blot对抗体2的特异性进行鉴定。 Western blot方法参照步骤2)。
Western blot结果如图3所示，Ab2能识别外源转染的Flag-KIAA0649蛋白， 而识别细胞内源的蛋白条带大于Flag-KIAA0649蛋白，由于Flag-KIAA0649蛋白带 有Flag，比内源的KIAA0649蛋白大，显然抗体2不能特异识别内源的KIAA0649 蛋白。
4) 制备抗体3
将KLH偶联的多肽1、 2和3按照100ug、 100ug和100ug混合后免疫新西兰兔， 方法同步骤3)。在ELISA检测抗血清滴度达到1: 105后心脏取血获得血清。将血 清用PBS稀释后与多肽偶联的S印harose 4B亲和层析柱孵育，4。C过夜。PBS冲洗 柱后用pH2. 4的0. lmol/L的Tris-HCl (pH9. 0)中和并透析至PBS中，获得抗体3 (Ab3)。用BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)检测抗体浓度，SDS-PAGE 电泳鉴定抗体3纯度。
U20S细胞(购自ATCC，货号HTB-96)在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，37°C， 5%C02，细胞培养箱培养。转染前一天，将1><106个转染细胞种至培养瓶，通 过Lipof ectAMINE2000转染pCI-neo-Flag-KIAA0649质粒，转染按 LipofectAMINE2000说明书进行，获得表达Flag-KIAA0649蛋白的U20S细胞。以转 入pCI-neo-Flag载体的U20S细胞作为对照。
表达Flag-KIAA0649蛋白的U20S细胞和对照细胞分别用EBC250裂解(0. 5% NP-40、 250 raM NaCl、 50 mM Tris-HC1 (PH7. 4 ) 、 1 mM EDTA、 1 mM PMSF、 lmM NaF、 1 mM Na3V04、 2ug/ml亮肽素、2 ix g/ml aprotinin蛋白酶抑制剂)冰上裂 解10分钟后12000rpm， 4。C离心30分钟，上清液分别为表达Flag-KIAA0649蛋白 的U20S细胞总蛋白和对照细胞总蛋白。将表达Flag-KIAA0649蛋白的U20S细胞总 蛋白和对照细胞总蛋白分别通过SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜上，将膜用5%脱 脂牛奶-PBST (含有0. 5%Tween20的PBS)封闭1小时后，与抗体3反应1小时； 用PBST洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(购自北京中杉金桥生物公 司)反应1小时。PBST洗涤后按照说明书通过ECL-Western blot Detection Reagent 发光，然后在暗室通过X光片曝光。
结果如图4A所示，AB3可以同时识别外源的Flag-KIAA0649蛋白和内源 KIAA0649蛋白(Flag-KIAA0649蛋白由于Flag-tag的存在比内源的KIAA0649蛋白 略大)AB3的特异性较高，没有非特异条带。
图4A中，"1"为表达Flag-KIAA0649蛋白的U20S细胞，"2"为对照细胞。
KIAA0649蛋白含有1209个氨基酸，理论推算大小约为140KD，但是上述KIAA0649 多克隆抗体所识别的特异条带均位于175KD左右。为进一步确认该特异条带为 KIAA0649蛋白，设计了针对KIAA0649的siRNA，命名为siKIAA其核苷酸序列如下
5' -CGCUUCUCCAGUGGUUGCUUU-3'。合成一段非特异核苷酸序列siNC (5' -ACUACCGUUGUUAUAGGUG-3')作为对照2。
人工合成的siKIAA和对照2 (上海吉玛制药技术有限公司合成)分别转染至 HeLa细胞，获得siKIAA0649细胞和对照2细胞，72小时后分别提取siKIAA0649 细胞和对照2细胞总蛋白，方法参照表达Flag-KIAA0649蛋白的U20S细胞总蛋白 的提取。
将siKIAA0649细胞和对照2细胞总蛋白分别通过SDS-PAGE分离，转移至PVDF 膜上，将膜用5%脱脂牛奶-PBST (含有0. 5%Tween20的PBS)封闭1小时后，与抗 体3反应1小时；用PBST洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗IgG反应1
8小时。PBST洗涤后按照说明书通过ECL-Western blot Detection Reagent发光， 然后在暗室通过X光片曝光。
结果如图4B所示，转染了 siKIAA的HeLa细胞，KIAA0649特异条带明显减弱， 进一步证实了该特异条带为KIAA0649蛋白，抗体3可以特异识别KIAA0649蛋白。
图4B中，"2"为转染了 siKIAA的HeLa细胞，"1"为对照2细胞。
5) KIAA0649在细胞内的定位
表达Flag-KIAA0649蛋白的HeLa细胞种到盖玻片上，通过甲醛丙酮(l: 1) 对细胞进行固定，羊血清封闭30分钟后加入Flag单克隆抗体M2和抗体3 (Ab3) 37。C孵育过夜，充分洗涤后加入FITC标记的山羊抗兔IgG和TRITC标记的山羊抗 小鼠IgG混合液，室温孵育l小时后洗涤，DAPI染细胞核，90%甘油封片在荧光共 聚焦显微镜下进行观察。
抗Flag抗体M2通过TRITC交联的荧光二抗识别，显示为红色。抗体3 (Ab3) 通过FITC交联的二抗识别，显示为绿色；同时用DAPI染核，为蓝色。
荧光共聚焦显微镜下进行观察结果如图5所示，KIAA0649抗体特异识别 Flag-KIAA0649，与M2抗体识别的Flag-KIAA0649存在共定位，在合成图中为黄色。 同时可见Flag-KIAA0649在细胞核内表现为一种特异的定位形式。在所有细胞中， 内源的KIAA0649呈绿色，颗粒状分布于细胞核内，与外源转染的Flag-KIAA0649 分布形式类似。说明抗KIAA0649多克隆抗体可用于免疫荧光分析的特异性，同时 对KIAA0649在细胞内的定位进行了分析。
图5中，"1"为用DAPI染的细胞核，"2"为用Ab3进行的免疫荧光染色， "3"为用抗Flag的抗体M2进行的免疫荧光染色，"4"为1， 2和3的整合图。序列表
〈110〉 北京大学 —
〈120〉用于制备多克隆抗体的多肽及其应用
〈160〉 7
<210〉 1
<211> 15
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
<220〉 〈230>
〈400〉 1
Ser Arg Ser Asp Gly Asp Ser Ser Ser Val Asp Ser Asp Asp Cys 15 10 15
<210> 2 〈211〉 31 <212> PRT 〈213>人工序列
〈220〉 <230〉
〈400〉 2
Glu Glu Arg Ala Pro Asp Pro Pro Ala His Ser Thr Ser Ser Ala Thr 15 10 15
10L>ys Ser Ala Leu Pro Glu Thr His Arg Lys Thr Pro Ser Lys Lys 20 25 30
〈210〉 3 <211> 31 <212> PRT <213>人工序列
〈220〉 <230>
<400> 3
Gly Gin Gly Lys Thr Asp Glu Ala Arg Arg Leu Asp Glu Lys Glu Ser 15 10 15
Ser Glu Asp Lys Ser Ser Ser Leu Asp Ser Asp Glu Asp Leu Asp 20 25 30
〈210〉 4 〈211〉 29 〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220> <230>
<400〉 4
His Asp Arg Arg Ser Ser Gly Ser Glu Glu Ser lie Leu Asp Leu Arg 15 10 15
Tyr Arg Arg Arg Val Asn Arg Asp Asp Gin Glu Gin Asp 20 25
〈210〉 5 〈211〉 22〈212〉 PRT <213〉人工序列
〈220〉 〈230〉
〈400〉 5
Lys Arg Gin His Glu Thr Gin Lys Cys Asp Gly Ser Val Glu Lys Lys 15 10 15
Pro Asp Thr Asn Glu Asn 20
<210〉 6 <211〉 19 〈212> PRT 〈213〉人工序列
〈220〉 〈230〉
<400> 6
Ser Lys Ser Lys Arg Asp Ser Gly Glu Gly Pro Gly Lys Lys Pro Pro
15 10 15
Ser Val Phe
<210> 7
〈211〉 17
〈212〉 PRT
<213>人工序列
〈220〉 〈230〉<400〉 7
Arg Tyr Arg Arg Arg Val Asn Arg Asp Asp Gin Glu Gin Asp Ala Leu 15 10 15
Gly
权利要求
1、用于制备多克隆抗体的多肽，包括3个多肽，多肽1、多肽2和多肽3，所述多肽1的氨基酸序列为序列表中的序列5，所述多肽2的氨基酸序列为序列表中的序列6，所述多肽3的氨基酸序列为序列表中的序列7。
2、 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽l、多肽2和多肽3独立 包装。
3、 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽l、多肽2和多肽3混合 包装。
4、 根据权利要求3所述的多肽，其特征在于所述多肽l、多肽2和多肽3的质 量比为(1-3) :(1-3) :(1-3)。
5、 根据权利要求4所述的多肽，其特征在于所述多肽l、多肽2和多肽3的质量比为1: 1: 1。
6、 权利要求1至5中任一所述的多肽在制备多克隆抗体中的应用。
7、 一种多克隆抗体，是以权利要求1至5中任一所述的多肽为抗原免疫动物获 得的多克隆抗体。
8、 根据权利要求7所述的多克隆抗体，其特征在于所述多克隆抗体为抗 KIAA0649蛋白的抗体。
全文摘要
本发明公开了一种用于制备多克隆抗体的多肽及其应用。用于制备多克隆抗体的多肽包括3个多肽，多肽1、多肽2和多肽3，所述多肽1的氨基酸序列为序列表中的序列5，所述多肽2的氨基酸序列为序列表中的序列6，所述多肽3的氨基酸序列为序列表中的序列7。本发明的用于制备多克隆抗体的多肽免疫动物成功地获得了能够识别外源和内源KIAA0649蛋白的抗体，KIAA0649多克隆抗体具有较高的特异性。该抗体可用于Western blot和免疫荧光的分析，对KIAA0649进行功能研究提供了很好的抗体。
文档编号C07K7/00GK101508723SQ200910080160
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者杜晓娟, 杨 柯, 郑宗方, 巍 韩 申请人:北京大学