专利名称：一种信号肽及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种信号肽及其编码基因与应用。
背景技术：
由于核糖核酸酶抑制剂的存在，细胞中的核糖核酸酶降解RNA的水平不会影响 细胞的生存；然而，近年来越来越多具有细胞毒性的核糖核酸酶被发现，包括 ^^roge"i'/2、牛精液核糖核酸酶等。
0nconase (以下简称0NC)，中文译名为豹蛙酶，最早分离自yfe朋w'/^'e/7S (北 极豹蛙)的卵母细胞和早期胚胎，属于核糖核酸酶A超家族(RNase A) 。 1988年 Mikiilski等发现纯化的蛋白质(p-30)及其粗提物(Pannon)体外能有效地抑制人 白血病细胞株HL-60、人下颚癌细胞株A-253和人腺癌细胞株ColQ 320 CM等的生 长及杀死这些细胞，并显示出时间-剂量依赖效应，同时体内试验进一步证明了其 抗肿瘤活性。1991年Aldelt等测出了它的全序列，并根据McoJ^y和r仂o加"esse 将其命名为0nconase。 1994年Merlino等用1. 7AX射线对其三维结构做了准确的 描述。1999年Eugenio等成功地在大肠杆菌系统中表达并纯化了 0NC重组蛋白，其 结构和性质类似于天然蛋白质。从1996到2004年Alfacell公司相继开展了 0NC 对乳腺癌、胰腺癌、肾癌、非小细胞肺癌、恶性间皮瘤等临床研究，其中对恶性间 皮瘤疗效显著，且副作用小。2003年开始0NC与阿霉素共同治疗恶性间皮瘤的III期 临床研究。
0NC在细胞内具有良好的稳定性，药物体内半衰期为3h，溶解温度(Tra)值为 90°C，与核糖核酸酶抑制剂结合抑制常数(Ki)值约为1X10—6，是细胞毒性的重要 原因。作为RNase A家族的最小成员，0NC由104个氨基酸构成，含有一个N糖基 化位点(-N69-V70-T71-)，天然的0NC是非糖基化形式的。分子内4对半胱氨酸 形成的4个二硫键构成其基本骨架。C-末端cys87和cysl04形成的二硫键和N-端 谷氨酰氨环化构成了与RNase A结构的主要不同点(Arnold U等， ^'oc力e则's^r, 45:3580-7)。在氢键等弱相互作用下，分子内部形成7个P-折叠， 4个a螺旋和4个e -转角，其中有1个正平行三p -折叠和1个反平行三P -折叠。ONC及其前身北极豹蛙卵粗提物PannonTM，都是由Alfacell公司开发，并拥有 有关0NC商标和专利权，其中包括10项美国专利、4项欧洲专利和1项日本专利。 临床上使用的ONC是从豹蛙卵中提取的，步骤包括体内受精，排卵，提取卵母细
胞，阴离子交换色谱，阳离子交换色谱和体积排阻色谱。该方法既费时又费力，代 价高得率低。利用基因工程手段在大肠杆菌中表达的0NC其N端第一个氨基酸均为 Met，且ONC全部以包涵体形式分泌到胞外，为了获得有活性的ONC，必须去除Met 和对包涵体进行变性和复性。
巴斯德毕赤酵母(A'c力ia pa^ori's)是一种单细胞低等真核生物，被广泛地 应用于表达各种种属来源的外源蛋白，它是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表 达系统之一，利用巴斯德毕赤酵母表达系统已经成功表达了近700种外源蛋白。毕 赤酵母具有许多其它基因表达系统所不具备的优点具有强有力的醇氧化酶(A0X
I )或磷酸苷油酸脱氢酶(GAP)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达。作为 真核表达系统，可对表达的蛋白质进行翻译后加工、折叠和修饰等，从而使表达出 的蛋白质具有生物活性。生长繁殖速度快、营养要求低、培养基廉价，与高等真核 细胞相比，巴斯德毕赤酵母易于操作和培养。高稳定性。外源基因能通过质粒整合 到毕赤酵母的基因组上，这样得到的基因工程菌株比较稳定，不会出现外源基因随
生长繁殖而丢失的现象。高生物量。工程菌株可进行高密度发酵培养，并能耐受较 高流体净压，在发酵罐中细胞干重可达120g/L以上。表达量高，许多外源蛋白在
毕赤酵母中的表达可达到每升克级水平以上，例如巴西三叶胶羟腈裂解酶的表达量 可以达到22g/L。在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内，又可分泌至胞外，而 且毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，有利于纯化。糖基化程度低，免疫原性较低， 因此特别适合于生产医药用重组蛋白质。
在真核细胞中，分泌性蛋白质在合成完成后，或者出胞或者在细胞内积累。一 般而言，决定蛋白质分泌和转运的是蛋白质N-端一段额外氨基酸序列，即信号肽或 信号序列。目前研究认为，外源蛋白质自细胞中高效地分泌过程中最重要的因素之 一是选择适宜的信号肽序列。 一般而言，外源信号序列虽可以引导蛋白质的分泌， 但效率一般较低。因此，在一定程度上，需要依赖酵母本身的分泌信号肽来指导外 源基因表达产物的分泌。常用的酵母信号肽有酸性磷酸酯酶(PH05)，蔗糖酶(SUC2)， Killer毒素和a-交配因子(MFa)等内源性信号肽，其中ct-交配因子分泌信号 在酵母表达系统中应用最广泛，其组成为pre+pro+(EAEA)H。外源基因融合于a-交配因子分泌信号，外源蛋白在胞质翻译完成后，a-交配因子分泌信号引导其进 入内质网腔，蛋白重新折叠成为正确的构象。Pre肽在内质网内被切除，Pro肽引 导外源蛋白进入高尔基体，反面膜的Kex2蛋白识别Pro肽C端的KR双碱性残基位 点并切割、释放外源蛋白，经胞吐作用分泌到胞外。但a-交配因子分泌信号也存 在不足之处。对于一些N端有特殊结构的蛋白质来说，使用a-交配因子往往导致 目的蛋白表达量低或表达产物没有活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种信号肽及其编码基因与应用。
本发明所提供的信号肽，是a-交配因子的pre肽，其氨基酸序列为序列表中 序列1 。
编码所述a -交配因子的pre肽的DNA分子也属于本发明的保护范围。 所述DNA分子的核苷酸序列具体可为序列表中序列2。
外源基因与分泌信号融合，外源蛋白在胞质翻译完成后，分泌信号引导其进入 内质网腔，蛋白重新折叠成为正确的构象。但是， 一些N端有特殊结构的蛋白(如 0nconase)不适合用酵母本身的a -交配因子(不论是否含有EAEA结构)作为分泌 信号。
本发明的a-交配因子的pre肽作为分泌信号则可以引导N端有特殊结构的蛋 白(如0nconase)。可将编码所述a -交配因子的pre肽的DNA分子与目的基因融 合获得融合基因，将融合基因导入宿主细胞中，表达目的蛋白并分泌到细胞外。
所述的融合基因也属于本发明的保护范围。
该融合基因是所述DM分子与目的基因融合获得的函A分子。如为了生产 0nconase，编码所述a -交配因子的pre肽的DNA分子与0nconase基因融合，获得 的融合基因的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3或序列5。
含有所述DNA分子、所述融合基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌， 扩增所述DNA分子或所述融合基因的全长及其任意片段的引物对也属于本发明的保 护范围。
本发明的另一个目的是提供一种生产蛋白的方法。
本发明所提供的生产蛋白的方法，是将所述融合基因导入酵母中，获得重组酵 母，发酵所述重组酵母生产目的蛋白。
本发明的a-交配因子的pre肽可以引导N端有特殊结构的蛋白(如Onconase)自细胞中高效地分泌，糖基化Onconase和非糖基化的0nconase的表达量达到 300mg/L发酵液和150mg/L发酵液，含EAEA结构的a-交配因子引导的糖基化 Onconase和非糖基化的Onconase的表达量为300mg/L发酵液、150mg/L发酵液， 而不含EAEA结构的a -交配因子引导的糖基化Onconase和非糖基化的Onconase 的表达量很低。a -交配因子的pre肽引导的糖基化Onconase和非糖基化的 Onconase具有对乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性，而含EAEA结构的a -交配因子引 导的糖基化Onconase和非糖基化的Onconase没有生物活性。本发明的a -交配因 子的pre肽及其编码基因可用于生产N端有特殊结构的蛋白，蛋白产量高，纯化过 程简单，且具有良好的生物活性。
图1为不同分泌信号引导的gONC和agONC的结构图。 图2为不同分泌信号引导的gONC和agONC的SDS-PAGE电泳图谱。 图3为纯化后gONC和agONC的SDS-PAGE电泳图谱。
具体实施例方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径 获得。
下述百分含量如无特殊说明均为质量百分含量。 实施例1、 a -交配因子的pre肽作为分泌信号 1) gONC和agONC基因的获得
根据Genebank中Onconase基因的编码序列和酵母偏爱密码子设计合成一系列
引物，引物的核苷酸序列如下
Primer 5: 5'GCCTCGAGAAAAGACMGACTGGTTGACCTTCCAAAAGAAG3';
Primer 3: 5'CTGAATTCCTATTAACAACTACCGACGCCMCGAAGTG3，；
PI: 5' CAAGACTGGTTGACCTTCCAAAAGAAGCACATCACCMCACCAGAGACGTCGACTGTG3';
P2 : 5' ACCAACACCAGAGACGTCGACTGTGACAACATCATGTCCACCAACTTGTTCCACTGTA3';
P3 : 5' ATGTCCACCAACTTGTTCCACTGTMGGACAAGAACACCTTCATCTACTCCCGTCCAG3';
P4: 5' AACACCTTCATCTACTCCCGTCCAGAGCCAGTCAAGGCTATCTGCAAGGGTATCATCG3';
P5 : 5' AAGGCTATCTGCAAGGGTATCATCGCTTCCAAGMCGTCCTTACCACCTCCGAGTTCT3';
P7: 5' GACTGTAACGTTACCAGTAGACCATGCAAGTACAAGTTGAAGAAGTCCACCAACAAGT3，；
6P8: 5' MGTTGMGMGTCCACCMCMGTTCTGCGTCACCTGTGAGAACCAAGCTCCAGTTC3，； P9: 5， ACMCTACCGACGCCMCGMGTGAACTGGAGCTTGGTTCTCACAGGTGACGCAGAAC3，。 上述引物用于扩增糖基化的Onconase (gONC)全长编码序列，并在5'端加入
了Xhol I酶识别位点，在3，端加入了EcoR I酶识别位点，并在3'端EcoRI位
点前加入了终止密码子。
50ul反应体系中，加入primer5、 primer3和Pl至P9各lul， 10x反应缓冲液
5ul， 2. 5m mol/L的dNTP 4ul， pyrbest DNA聚合酶0. 2ul。
PCR条件为94。C变性30秒，53。C退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环后，
再72'C延伸10分钟。
PCR产物用1%琼脂糖电泳纯化，用DNA片段回收试剂盒回收纯化约312bp的
gONC。
Mu-F: 5' TACTTGTCCGACTGTCAAGTTACCAGTAGACCA3，； Mu-R: 5' TGGTCTACTGGTAACTTGACAGTCGGACAAGTA3'。 Mu-F和Mu-R引物用于扩增非糖基化的Onconase全长编码序列(agONC)。 50ul反应体系中，加入上述扩增出的312bp的gONC基因lul， Mu-F和Mu-R 各2ul， 10x反应缓冲液5ul， 2. 5mmol/L的dNTP4ul， pyrbest DNA聚合酶0. 2ul。 PCR反应条件94。C变性30秒，52。C退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环 后，再72"延伸IO分钟。
PCR产物用1%琼脂糖电泳纯化，用DNA片段回收试剂盒回收纯化约312bp的 agONC。
2)不同分泌信号引导的gONC或agONC融合基因的合成 A) a -交配因子的pre肽与gONC或agONC融合基因的合成 R3: 5'ACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTCAAGACTGGTTGACC3，； R4: 5' GCGGATCCAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTC3'; Primer3: 5， CTGAATTCCTATTAACAACTACCGACGCCMCGAAGTG3'。 上述引物R3、 R4和Primer3用于扩增pre-gONC或pre-agONC融合基因，并在 其5，端加入了 BamHI位点。 反应体系1:
50ul反应体系中加入lul 312bp的gONC、引物R3和primer3各2ui、 10x反 应缓冲液5ul、 2. 5m mol/L的dNTP 4ul、 pyrbest DNA聚合酶0. 2ul。反应体系2:
50ul反应体系中加入lul 312bp的agONC、引物R3和primer3各2ul、 10x反 应缓冲液5ul、 2.5m mol/L的dNTP 4ul、 pyrbest DNA聚合酶O. 2ul。
PCR条件为94。C变性30秒，53t:退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环后， 再72'C延伸IO分钟。
反应体系l获得的PCR产物命名为pre-gONCl，反应体系2获得的PCR产物命 名为pre-agONCl。
PCR产物用1%琼脂糖电泳纯化，用DNA回收试剂盒回收纯化PCR产物。 反应体系3:
50ul反应体系中加入lul 348bp的pre-gONCl、引物R4和primer3各2ul、 10x 反应缓冲液5ul、 2. 5m mol/L的dNTP 4ul、 pyrbest DNA聚合酶O. 2ul。 反应体系4:
50ul反应体系中加入lul 348bp的pre-agONCl、引物R4和primer3各2ul、 10x反应缓冲液5ul、 2. 5m mol/L的dNTP 4ul、 pyrbest腿聚合酶0.2ul。
PCR条件为94。C变性30秒，53。C退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环后， 再72i:延伸10分钟。
反应体系3获得的PCR产物命名为pre-gONC，反应体系4获得的PCR产物命名 为pre-agONC。
PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。
对pre-gONC进行测序，测序结果表明pre-gONC的核苷酸序列如序列表中序列 3所示，编码序列表中序列4所示的蛋白。
对pre-agONC进行测序，测序结果表明pre-agONC的核苷酸序列如序列表中序 列5所示，编码序列表中序列6所示的蛋白。
B)含EAEA结构的a -交配因子与gONC或agONC融合基因的合成
EAEA-Onc-F:
5' GCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAAGACTGGTTGACCTTCCAAAAGAAG3，； Primer 3: 5' CTGMTTCCTATTAACAACTACCGACGCCAACGAAGTG3，。 引物EAEA-One-F和Primer 3用于在gONC或agONC基因的5，端加入EAEA结
构和Xho I酶切位点，构建含EAEA结构的a -交配因子引导的gONC和agONC。 反应体系5:50ul反应体系中加入lul 312bp的gONC、引物EAEA-Onc-F和priraer3各2ul、 10x反应缓冲液5ul、 2.5m mol/L的dNTP 4ul、 pyrbest DNA聚合酶O. 2ul。 反应体系6:
50ul反应体系中加入lul 312bp的agONC、引物EAEA-Onc-F和primer3各2ul、 10x反应缓冲液5ul、 2. 5m mol/L的d鮮4ul、 pyrbest DNA聚合酶0. 2ul。
PCR条件为94。C变性30秒，53。C退火30秒，72。C延伸30秒，30个循环后， 再72'C延伸10分钟。
反应体系5获得的PCR产物命名为EAEA-gONC，反应体系6获得的PCR产物命 名为EAEA-agONC。
PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。
对EAEA-gONC进行测序，测序结果表明EAEA-gONC的核苷酸序列如序列表中序 列7所示，编码序列表中序列8所示的蛋白。
对EAEA-agONC进行测序，测序结果表明EAEA-agONC的核苷酸序列如序列表中 序列9所示，编码序列表中序列10所示的蛋白。
3)不同分泌信号引导的gONC或agONC蛋白的表达
载体pPIC9k本身带有不含EAEA结构的a-交配因子，分别将gONC、 agONC、 EAEA-gONC和EAEA-agONC基因用Xholl和EcoR I酶双酶切连到同样双酶切的pPIC9k 载体中获得重组表达载体pPIC9k-gONC、 pP工C9k-agONC、 pPIC9k-EAEA-gONC和 pPIC9k-EAEA-agONC。
用BamH I和EcoR I酶分别酶切pre-gONC2、 pre-agONC2，分别与用同样酶酶 切的载体pPIC9k连接获得重组表达载体pPIC9k-pre-gONC和pPIC9k- pre-agONC。
构建pPIC9k-gONC和pPIC9k-agONC表达载体时，载体pPIC9k的分泌信号为不 含EAEA结构的a交配因子，直接将gONC和agONC基因酶切后插入载体pPIC9k中； 构建pPIC9k-EAEA-gONC和pPIC9k-EAEA-agONC表达载体，载体pPIC9k的分泌信号 为含EAEA结构的a交配因子，在载体pPIC9k和0NC间加入了EAEA结构；构建 pPIC9k-pre-gONC和pPIC9k-pre-agONC时，去除pPIC9k本身的信号肽，然后在载 体pPIC9k中插入pre-gONC2、 pre-agONC2。
挑取GS115酵母单菌落，接种至含有5mlYPD (10g/L酵母提取物、20g/L胰蛋 白胨、20g/L葡萄糖)培养基的试管中，250r/min 30。C培养24小时，然后取lml 培养物接种至含100ml新鲜YPD培养基的300ml三角瓶中，250r/min 3(TC培养至OD600达到1. 0将培养物于4°C， 4000r/min离心5min，用20ml的冰预冷无菌水将 菌体沉淀重悬；4°C， 4000r/min离心5min，用20ml的冰预冷无菌水将菌体洗涤两 次；4°C， 4000r/min离心5min,再用20ml的冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌 体洗涤两次，用lOOul的冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，分别加 入30ulSac I酶线性化的pPIC9k-g0NC、 pPIC9k-agONC、 pPIC9k-pre-gONC、 pPIC9k-pre-agONC、 pPIC9k-EAEA-g0NC和pPIC9k-EAEA-ag0NC，然后转至0. 2cm冰预冷的 电转化杯中；将电转化杯冰浴5min，电压2. 5kv;电击时间4ms左右。电击完毕后， 加入lml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，将菌悬液涂布于MD平板(13.4g/LYNB (酵母基础氮源培养基)、20g/L葡萄糖、0.4mg/L生物素、10g/L琼脂)上，置于 3(TC培养直至单个菌落出现，分别得到重组菌GS115-gONC、 GS115-agONC、 GS115-pre-gONC、 GS115-pre-ag0NC、 GS115-EAEA-gONC和GS115-EAEA-agONC。
挑取His+克隆，首先在5ml YPD培养基中活化24小时，然后取培养物lml转 接至30ml BMGY (10g/L酵母抽提物、20g/L胰蛋白胨、13, 4g/L YNB、 0. 4rag/L生 物素、10g/L甘油、p朋.O的lOOmM磷酸钾缓冲液)培养基中，250r/min3(TC培养， 加甲醇1% (体积百分含量)，每12小时补加甲醇，诱导培养3天，离心取上清， SDS-PAGE分析，筛选高效表达菌株。
摇瓶结果显示，GS115-pre-gONC和GS115-EAEA-gONC的上清液中gONC的表达 量均达到10mg/L上清液。GS115-pre-gONC和GS115-EAEA-gONC的上清液中既含有 gONC也含有agONC,但不同的分泌信号导致产物中二者的比例不同， GS115-EAEA-gONC的上清中agONC比例达30%, GS115-pre-gONC的上清中agONC比 例为20%。 GS115-Pre-agONC和GS115-EAEA-agONC的上清液中agONC的表达量为 6rag/L上清液，而GS115-gONC和GS115-agONC的上清液中gONC和agONC的表达量 很低，利用SDS-PAGE很难检测到。
SDS-PAGE结果如图2所示。
图2中，M:标准蛋白；1: pPIC9k转化菌表达上清；2: GS115-gONC表达上 清；3: GS115-EAEA-gONC表达上清;4: GS115-pre-gONC表达上清;5: GS115-pre-agONC表达上清。
上述结果说明，EAEA结构的a-交配因子和a-交配因子的pre肽可作为分泌 信号。
4)不同分泌信号引导的gONC或agONC蛋白的生物活性将高效表达菌株GS115-pre-gONC、 GS115-pre-agONC、 GS115-EAEA-gONC和 GS115-EAEA-agONC接种至含低盐基础盐培养基的5L发酵罐(BioStat B5， B Braun Biotech International) 内培养。
每升低盐基础盐培养基(NaP03)6 6. 5 g， CaS04 0 . 23 g， K2S04 4 , 55 g， MgS04 7H20 3. 73g， K0H 1. 03 g，甘油40 g。
发酵液4匸10000 rpm离心10min，弃菌体，获得含大量目的蛋白的上清液， 上清液用蒸馏水稀释2倍后用SP S印harose F. F进行初步纯化，阳离子交换层析 所用平衡缓冲液为20mM pH为7. 0的磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为含1. 0M NaCl的 20mM pH为7. 0磷酸盐缓冲液。经阳离子交换层析后再用Superdex 75柱进行纯化。 所用平衡缓冲液为含1. 0丽acl的20mM pH为7. 0磷酸盐缓冲液。
经两步纯化GS115-pre-g0NC菌的发酵液中得到纯化的g0NC蛋白，产量为 300mg/L发酵液；从GS115-pre-agONC菌的发酵液中得到纯化的agONC蛋白，产量 为150mg/L发酵液；从GS115-EAEA-gONC菌的发酵液中得到纯化的EAEA-gONC，产 量为300mg/L发酵液；从GS115-EAEA-agONC菌的发酵液中得到纯化的EAEA-agONC 蛋白，产量为150mg/L发酵液。
纯化后的gONC、 agONC、 EAEA-gONC和EAEA-agONC蛋白的SDS-PAGE电泳结果 如图3所示。
图3中1:蛋白分子量标准；2: GS115-pre-gONC菌的发酵液上清；3: gONC SP S印harose F. F洗提液;4: gONC S叩erdex 75.洗提液;5: GS115- pre-agONC菌 的发酵液上清；6: agONC SP S印harose F. F洗提液;7: agONC Superdex 75.洗提 液；8:EAEA-gONC Superdex 75.洗提液；9: EAEA-agONC Superdex 75.洗提液。
利用MTT比色法检测纯化后的纯化后的gONC、agONC、EAEA-gONC和EAEA-agONC 蛋白对乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性。
MCF-7细胞(ATCC)为贴壁细胞，采用0.25%胰酶消化，在加入双抗(青霉素 链霉素各100单位)的含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，37°C， 5%二氧化碳 培养，隔天传代。
将干净的微量板放在紫外线灯下照射30min，每孔加入100ul MCF-7细胞悬液 (细胞浓度为40万/ral)，加盖静置放入二氧化碳培养箱培养6-8小时，当细胞已 生长成为单层时，分别加入已在微量板上倍比稀释过的gONC、 agONC、 EAEA-gONC 和EAEA-agONC (以不加入任何蛋白的孔作为对照)，然后放入二氧化碳培养箱，培养3天后加入2mg/ml的MTT液，继续培养8小时后加入0. 01N HC1+20%SDS溶液
(150ul/孔)，将微量板置于微孔板振荡器上振荡10min，酶标仪检测各孔OD值(检 测波长为570纳米)。
gONC和agONC对MCF-7乳腺癌肿瘤细胞的IC5。分别为15uM和6uM;而EAEA-gONC 和agONC则对肿瘤细胞无杀伤作用，即没有生物学活性。
说明利用含EAEA结构的a -交配因子作为分泌信号引导的EAEA-gONC或 EAEA-agONC生物活性都基本丧失，而ct -交配因子的pre肽作为分泌信号引导的 gONC或agONC对MCF-7肿瘤细胞有明显的杀伤作用，具有完整的生物学活性。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神 和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护 范围。
12序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
〈120〉 一种信号肽及其编码基因与应用
<130〉 CGGNA图2131
<160> 10
<210> 1
〈211〉 19
<212〉 PRT 〈213>人工序列
〈220〉 〈230〉
〈400〉 1
Met Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 15 10 15
Ala Leu Ala
〈210〉 2
〈211〉 57
<212> DNA <213>人工序列
<220> 〈230〉
13<鄉> 1
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagct 57
〈210〉 3
<211〉 380
〈212〉 腿 <213〉人工序列
<220> 〈230〉
〈400〉 3
ggatccaaac gatgagattt ccttcaattt ttactgcagt tttattcgca gcatcctccg 60
cattagctca agactggttg accttccaaa agaagcacat caccaacacc agagacgtcg 120
actgtgacaa catcatgtcc accaacttgt tccactgtaa ggacaagaac accttcatct 180
actcccgtcc agagccagtc aaggctatct gcaagggtat catcgcttcc aagaacgtcc 240
ttaccacctc cgagttctac ttgtccgact gtaacgttac cagtagacca tgcaagtaca 300
agttgaagaa gtccaccaac aagttctgcg tcacctgtga gaaccaagct ccagttcact 360
tcgttggcgt cggtagttgt 380
<210> 4
<211> 103
〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220> <230>
<400> 4
Met Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 15 10 15Ala Leu Ala Gin Asp Trp Leu Thr Phe Gin Lys Lys His lie Thr Asn
20 25 30
Thr Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn lie Met Ser Thr Asn Leu Phe His
35 40 45
Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe lie Tyr Ser Arg Pro Glu Phe Tyr Leu
50 55 60
Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys Lys 65 70 75 80
Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gin Ala Pro Val His
85 90 95
Phe Val Gly Val Gly Ser Cys 100
<210〉 5 <211〉 382 <212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220> 〈230〉
〈400〉 5
gcggatccaa acgatgagat ttccttcaat ttttactgca gttttattcg cagcatcctc 60
cgcattagct caagactggt tgaccttcca aaagaagcac atcaccaaca ccagagacgt 120
cgactgtgac aacatcatgt ccaccaactt gttccactgt aaggacaaga acaccttcat 180
ctactcccgt ccagagccag tcaaggctat ctgcaagggt atcatcgctt ccaagaacgt 240
ccttaccacc tccgagttct acttgtccga ctgtcaagtt accagtagac catgcaagta 300
caagttgaag aagtccacca acaagttctg cgtcacctgt gagaaccaag ctccagttca 360
cttcgttggc gtcggtagtt gt 382
〈210> 6<211〉 123 <212> PRT 〈213〉人工序列
<220〉 <230〉
<400〉 6 Met Arg Phe 1
Ala Leu Ala
Thr Arg
Cys Lys
50 Ala lie 65
Glu Phe l>ys Leu
Asp
35
Asp
Cys
Tyr
Lys
Pro
Gin
20
Val
Lys
Lys
Leu
Lys 100
Ser lie Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala 5 10 Asp Trp Leu Thr Phe Gin
Trp Asp Cys Asp
Asn Thr
Gly
Ser
85
Ser
lie
70
Asp
Phe
55
lie
Asn 40 lie
Phe 25 lie
Lys Lys
Met Ser Thr
Tyr Ser Ala Ser Lys Cys Gin Val
Thr Asn Lys
Phe 105
Thr 90 Cys
Arg Pro 60
Asn Val 75
Ser Arg Val Thr
His lie
30 Asn Leu 45
Glu Pro
Leu Thr
Pro Cys
Cys Glu 110
Ser Ser 15
Thr Asn
Phe His
Val Lys
Thr Ser
80 Lys Tyr 95
Asn Gin
la Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys 115 120
<210〉 7
<211> 336
〈212> 歸 <213>人工序列〈400〉 7
ctcgagaa犯g卿ggctgaagctxaagac tggttgacct tccaaaagaa gcacatcacc60
a^cacc3g,agacgtcgactgtgacaacatc atgtccacca acttgttcca ctgtaaggac120
tcatctactcccgtccagag ccagtcaagg ctatctgcaa gggtatcatc180
gcttccaagaacgtccttaccacctccgag ttctacttgt ccgactgtaa cgttaccagt240
gaagaagtcc accaacaagt tctgcgtcac ctgtgagaac300
C6LELgCtCC6lgttcacttcgttggcgtcggt agttgt336
<210> 8
<211〉 112
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈220〉 <230>
〈400〉 8
Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Gin Asp Trp Leu Thr Phe Gin Lys
15 10 15
Lys His lie Thr Asn Thr Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn lie Met Ser
20 25 30
Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe lie Tyr Ser Arg
35 40 45
Pro Glu Pro Val Lys Ala lie Cys Lys Gly lie lie Ala Ser Lys Asn
50 55 60
Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser 65 70 75 80
17<image>image see original document page 18</image>Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Gin Asp Trp Leu Thr Phe Gin Lys
15 10 15
Lys His lie Thr Asn Thr Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn lie Met Ser
20 25 30
Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe lie Tyr Ser Arg
35 40 45
Pro Glu Pro Val Lys Ala lie Cys Lys Gly lie lie Ala Ser Lys Asn
50 55 60
Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Gin Val Thr Ser 65 70 75 80
Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Va]
85 90 95
Thr Cys Glu Asn Gin Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys 100 105 110
权利要求
1、一种多肽，其氨基酸序列为序列表中序列1。
2、 编码权利要求1所述多肽的DNA分子。
3、 根据权利要求2所述的丽A分子，其特征在于所述DNA分子的核苷酸序列 为序列表中序列2。
4、 一种融合基因，是权利要求2或3所述DNA分子与目的基因融合获得的DNA 分子。
5、 根据权利要求4所述的融合基因，其特征在于所述融合基因的核苷酸序列 为序列表中的序列3或序列5。
6、 含有权利要求2或3所述DNA分子、权利要求4或5所述融合基因的重组表 达载体、转基因细胞系或重组菌。
7、 扩增权利要求2或3所述DNA分子、权利要求4或5所述融合基因的全长及 其任意片段的引物对。
8、 权利耍求l所述多肽、权利耍求2或3所述DNA分子在生产蛋白中的应用。
9、 一种生产蛋白的方法，是将权利要求4或5所述融合基因导入酵母中，获得 重组酵母，发酵所述重组酵母生产目的蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种信号肽及其编码基因与应用。该信号肽其氨基酸序列为序列表中序列1。本发明还公开了编码所述多肽的DNA分子。所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列2。所述多肽和所述DNA分子可在生产蛋白中的应用。本发明还公开了一种生产蛋白的方法，是将所述DNA分子与目的基因融合获得融合基因，将所述融合基因导入酵母中，获得重组酵母，发酵所述重组酵母生产目的蛋白。本发明的α-交配因子的pre肽及其编码基因可用于生产N端有特殊结构的蛋白，蛋白产量高，纯化过程简单，且具有良好的生物活性。
文档编号C07K7/00GK101538318SQ200910079570
公开日2009年9月23日 申请日期2009年3月6日 优先权日2009年3月6日
发明者庆 何, 刘志敏, 冲 薛, 赵洪亮 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所