使用编码和分泌glp-1肽或其类似物的封装细胞治疗急性心肌梗死(ami)的制作方法

专利名称：使用编码和分泌glp-1肽或其类似物的封装细胞治疗急性心肌梗死(ami)的制作方法
技术领域：
本申请涉及编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的 融合肽的细胞(诸如间充质干细胞或间充质基质细胞或任何另外的合适细胞)在治疗急性 心肌梗死(AMI或MI)中的应用，其中将编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I 或其片段或变体的融合肽的细胞封装在(球形)微囊中以防止待治疗患者的免疫系统的反 应。本申请还涉及这些(球形)微囊或者含有这些细胞或(球形)微囊的药物组合物在治 疗急性心肌梗死(AMI或MI)中的应用。
背景技术：
急性心肌梗死(AMI或MI)，更经常称为心脏病发作，是在对心脏的一部分的血液 供应中断(最通常是由于易损斑块的破裂引起)时发生的常见医学疾病。所导致的缺血或 缺氧引起心脏组织的损伤和可能的死亡。AMI是医疗紧急事件，并且是全世界男性和女性死 亡的主要原因(参见例如，The World Health Report 2004-Changing History (PDF)，世界 卫生组织，120-4，ISBN 92-4-156265-X)。重要的风险因素是诸如动脉粥样硬化性冠心病和 /或心绞痛等血管疾病的既往史、既往的心脏病发作或中风、心率失常或昏厥的任何既往事 件、较高的年龄(特别是男性超过40岁和女性超过50岁)、吸烟、过度饮酒、某些药物的滥 用、高甘油三酯水平、高LDL( “低密度脂蛋白”)和低HDL( “高密度脂蛋白”)、糖尿病、高血 压、肥胖和某些人的长期高水平的压力。心肌梗死是缺血性心脏病的常见表现。2002年据WHO估计，全世界12. 6%的死亡 由缺血性心脏病引起(参见，例如，The World Health Report 2004，出处同上)。在发达 国家中缺血性心脏病是死亡的主要原因，而在发展中国家中次于AIDS和下呼吸道感染居 第三位(参见例如2006年12月7日检索的加利福尼亚大学圣塔克鲁兹分校Center for Global, International and Regional Studies (CGIRS)的 Cause of Death-UC Atlas ot Global Inequality)。在美国，心脏疾病是死亡的主要原因，造成的死亡率甚至比癌(恶性赘生物)还 高(参见例如2007年4月17日检索的国家卫生统计中心的“Deaths and percentage of total death for the 10 leading causes of death United States"2002-2003)。在美 国冠心病是五分之一死亡的原因。大约7，200, 000名男性和6，000, 000名女性带有某种形 式的冠心病生存。每年有1，200, 000人经受(新得的或复发的)冠心病发作，并且他们中 的约40%由于发作而死亡(参见例如2006年12月7日检索的Heart Attack and Angina Statistics, American Heart Association (2003))。这意味着约每 65 秒，即有一名美国人 死于冠心病事件。预期在欧洲有类似的统计资料。疑似急性心肌梗死的即时治疗通常包括氧、阿司匹林、三硝酸甘油酯和疼痛缓解， 通常使用硫酸吗啡进行疼痛缓解。患者通常接受诸如心电图(ECG、EKG)、胸部X射线和血 液测试等许多诊断测试，来检测较高的肌酸激酶水平或肌钙蛋白水平(肌酸激酶和肌钙蛋白是由受损组织，特别是心肌释放的化学标记物)。另外的治疗可以包括分解阻断血液流 向心脏的血块的药物治疗，或者通过对受阻冠状动脉的扩张或旁路手术来机械性地恢复流 动。冠心病监护单元收治(Coronary care unit admission)允许对诸如心率异常等并发 症进行快速安全的治疗。AMI是一种急性冠心综合征，最通常是(但不是总是)冠状动脉病的表现。最常见 的触发事件是心外膜冠状动脉中粥样硬化斑块的破裂，这导致凝血级联，有时引起动脉的 完全阻塞。动脉粥样硬化是斑块状胆固醇和纤维状组织在动脉(本案情况下是冠状动脉) 壁上的逐渐累积，通常累积数十年。血管造影中可见的血流柱不规则反映了作为数十年动 脉粥样硬化发展结果的动脉腔变窄。斑块可以变得不稳定，破裂，并且另外通常在数分钟之 内升级成阻塞动脉的血栓(血块)。当冠状脉管系统中出现严重的斑块破裂时，可能导致心 肌梗死，并通常导致下游心肌的坏死。如果血液到心脏的流动减弱持续足够长，则触发了称为缺血级联的过程，该过程 中心脏细胞通常会死亡(特别由坏死引起)并且不会重新生长。在该位置形成胶原疤 痕。最近的研究表明，凋亡在心肌梗死后的组织损伤过程中可能也起作用(参见Krijnen PA, Nijmeijer R, Meijer CJ, Visser CA, Hack CE, Niessen HW. (2002). “Apoptosis in myocardial ischaemia and infarction". J Clin Pathol 55(11) :801-11.PMID 12401816)。结果，患者的心脏可能永久性地受到损伤。缺血级联中形成的疤痕组织还给患 者带来可能威胁生命的心律失常的风险。减少该随后的组织损伤的治疗，对于改善AMI后 心脏的功能具有显著益处并改善长期的患者结果。目前，在将干细胞治疗用于使MI后的心肌再生方面有大量的大型研究。心肌梗死 后通过左心室心肌内植入源自其自身骨髓的干细胞而接受干细胞治疗的患者显示左心室 射血分数和舒张期末容积的改善，这在使用安慰剂时未看到。开始的梗死面积越大，注入 (infusion)的效果越明显。但是，尚未建立合适的治疗。正在进行作为ST升高MI的治疗 方法的祖细胞注入的临床试验(参见例如khachinger V,Erbs S,Elsasser A,Haberbosch W,Hambrecht R,Holschermann H,Yu J,Corti R,Mathey DG,Hamm Cff,Suselbeck T,Assmus B, Tonn T, Dimmeler S, Zeiher AM ；REPAIR-AMI Investigators(2006), “Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction，，，N Engl J Med 355(12) :1210-21, PMID 16990384.)。除此处的干细胞方法之外，对于治疗AMI或MI目前存在至少三种生物材料和组织 工程化方法。但是，这些方法处于医学研究的早期阶段，所以在基于这些方法建立合适的治 疗之前需要解决许多问题和要点。该领域中第一种令人感兴趣的方法涉及预防心力衰竭的聚合性左心室约束器 (left ventricular restraint) 0第二种方法利用体外工程化的心脏组织，随后将该心脏 组织植入体内。另一种方法需要将细胞和/或支架注入心肌以原位形成工程化的心脏组织(参 见例如 Christman KL, Lee RJ. "Biomaterials for the Treatment of miocardial infarction". J Am Coll Cardiol 2006 ；48 (5) :907-13. PMJD 16949479)。该方法的变形 是注入细胞以产生会有助于保护AMI或MI后的心肌(例如，通过阻止心肌细胞进行凋亡) 的因子。在最后这种方法中，已经显示胰高血糖素样肽-I(GLP-I)提供某些非常有前景的效果，可以利用其治疗AMI或Ml。以该方法进行的许多最近的研究已经表明，胰高血糖素 样肽-I(GLP-I)是最强效的肠降血糖素激素之一，对缺血衰竭的心脏具有潜在的有益作 用(参见 Bose AK, Mocanu MM, Carr RD, Yellon DM, Myocardial ischaemia-reperfusion injury is attenuated by intact glucagon like peptide-1(GLP-I) in the in vitro rat heart and may involve the p70s6K pathway. Cardiovasc Drugs Ther. 2007 Aug ； 21(4) :253-6 ；禾口 Nikolaidis LA, Mankad S, Sokos GG, Miske G, Shah A, Elahi D, Shannon RP. Effects of glucagon-like peptide-1 in patients with acute myocardial infarction and left ventricular dysfunction after successful reperfusion, Circulation,2004Mar 2,109(8) :962-5)。GLP-I位于胰高血糖素基因上，胰高血糖素基因是深入研究过的基因(参见例如 White, J. W.等，1986 Nucleic Acid Res. 14 (12) 4719-4730)。作为高分子量前体分子的前 原胰高血糖素(pr印roglucagon)分子在胰腺α细胞中和在空肠及结肠L细胞中合成。前 原胰高血糖素是长度为180个氨基酸的激素原，其序列除了含有胰高血糖素之外，还含有 相关结构的两个序列胰高血糖素样肽-I(GLP-I)和胰高血糖素样肽-2(GLP-2)。在前原胰 高血糖素分子中，GLP-I和GLP-2之间是17个氨基酸的肽序列(更确切地说是15个氨基酸 的序列加上C末端RR切割位点)，即插入肽2 (intervening ρ印tide，IP2)。IP2序列(在前 体分子中位于GLP-I和GLP-2之间)正常情况下在GLP-I的第37位氨基酸后进行蛋白水解 切割。因此取决于细胞和环境，前原胰高血糖素分子切割成各种肽，包括GLP-I (1-37)，其未 加工形式的37个氨基酸的肽。通常而言，该加工发生在胰腺和肠中。GLP-I (1-37)序列可以 被进一步蛋白水解加工成为31个氨基酸的加工形式的活性GLP-I (7-37)，或GLP-I (7-36) 酰胺。因此，名称GLP-I (7-37)表示所讨论的片段包括当从亲本肽GLP-I的N末端计数时， 第7 37位的氨基酸残基。GLP-I是一种消化道激素，并且是最有效的内源性促胰岛素剂，具有的作用包括刺 激β细胞中的腺苷酸环化酶和蛋白激酶活性。生理学上，其与来自上消化道的胃抑制性肽 一起充当降低血糖水平的肠降血糖素激素。因此，响应于食物摄入而分泌的GLP-I对例如 胃部、肝、胰腺和脑具有多种作用，这些作用共同起作用来调控血糖。因此，胰高血糖素样肽 GLP-I (7-36)酰胺，及其未酰胺化类似物GLP-I (7-37)由于其对碳水化合物代谢的有效作 用和其对治疗包括2型糖尿病在内的糖尿病的潜在应用，而相当引人注意。另外，GLP-I已经对治疗急性心肌梗死(AMI)或心肌梗死(MI)显示出有前景的效 果。如此处所述，GLP-I是天然存在的肠降血糖素，兼有无需伴随葡萄糖输注即可刺激葡萄 糖吸收的促胰岛素性和胰岛素模拟性。Nikolaidis等(参见Nikolaidis等，2004，出处同 上)发现，当将其加入标准治疗时，GLP-I输注改善患有AMI和严重心脏收缩障碍的患者在 成功地进行直接血管成形术(primary angioplasty)后的局部和综合LV功能。早期研究中，对10名患有AMI并且LV分数(EF) < 40%的患者，在确定了与11名 对照患者相比成功地进行直接血管成形术后，在背景治疗中增加的72小时GLP-I输注(每 分钟1. 5 μ g/kg)期间测试GLP-I施用的安全性和功效(参见Nikolaidis等，Circulation 2004，109 ；962-965)。在这些实验的情况下，认为GLP-I的优点在于与AMI位置或糖尿病 史无关。因此，当在标准治疗中增加GLP-I输注时，似乎改善患有AMI和严重的心脏收缩 障碍的患者在成功地进行直接血管成形术后的局部和综合LV功能(参见Nikolaidis等，Circulation 2004，出处同上)。Nikolaidis等还假设GLP-1可促进缺血事件后从心肌 顿抑的恢复。在实验狗模型中，在左心室冠状动脉阻塞10分钟，然后进行M小时再灌注 时施用GLP-1。在这些实验中，GLP-I的施用引起促胰岛素作用，但不会引起高血糖(参 JAL Nikolaidis Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, January 2005,312(1)，第 303-8 页)。根据另一方法，对体内GLP-I，特别是GLP-I (7-36)的作用，使用诸如缬氨酸吡咯 烷(VP)等DPP-IV抑制剂作为防止其降解的手段进行研究(参见Bose等，Diabetes，^卷， 2005年 1 月，和Bose等，Cardiovascular Drugs and Therapy，2007年8 月，21 (4)，第 253-6 页)。天然GLP-1，特别是GLP-I (7_36)，在体内经历的半衰期短。其在第8位和第9位 残基之间被DPP-IV在数分钟内于血浆中快速降解，产生失活的NH2-末端截短的代谢物 GLP-I (9-36)。在这种情况下，认为在体内心脏模型中GLP-I和VP保护心肌免受缺血性再 灌注损伤，证明与VP或盐水组相比梗死的显著降低。在对应的体外研究中，使用GLP-I和 VP治疗的那些心脏再次证明与对照和VP组相比梗塞面积显著减少(也参见Bose等，2005 和2007，出处同上)。另外的数据显示，GLP-I可以通过直接抑制表达GLP-I受体的靶细胞的凋亡或可 能通过激活诸如促存活信号传导途径等存活因子而发挥对心脏的直接保护作用(也参见 Bose等，Diabetes，第M卷，2005年1月)。在该情况下，GLP-I的主要靶标是胰岛，其中该 激素刺激胰岛素分泌，促进β细胞增殖和再生，并且抑制胰高血糖素分泌。但是，GLP-I受 体也在胰岛外部表达，证实了 GLP-I还在其它器官中起作用的可能性(参见Ahren B.等， Hormones et metabolisme，2004 年 12 月，36 (11-12)，第 842-5 页)。再灌注中GLP-I显示以与胰岛素类似地程度增强左心室(LV)功能、心肌葡萄糖 吸收以及GLUT-I和GLUT-4易位。但是，有利地是，与胰岛素相反，GLP-I的促胰岛素作用 取决于环境葡萄糖浓度，减少了低血糖的风险。GLP-I还显示对正常心脏具有直接作用， 减少收缩性，但是与胰岛素的作用不同的是，GLP-I通过非Akt-I依赖性机制增加了心肌 ^f 11111 .( Tingcun Zhao 等,The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，第 317(3)卷，第 1106-1113 页；No. 3,2006)。GLP-I还显示改善患有急性心肌梗死和左心室功能障碍的患者中的左心室(LV) 功能。另外GLP-I促进β细胞中磷脂酰肌醇3激酶(ΡΙ3Κ)的活性。该激酶与缺血/再 灌注损伤以及心肌预处理背景下的心肌保护明显相关(参见Bose等，0化1^切8，第讨卷， 2005 ￥ 1 月；禾口 Tingcuri Zhao 等,The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，第 317 卷，第 1106-1113 页；No. 3,2006)。同的 ^去，Huisamen ^ ( #JAL Huisamen Cardiovascular Journal of Africa (South Africa)，2008 年 3 4 月，19 O)，第 77-83 页)显示，当得到 DPP-IV 抑制 剂VP存在的支持时，GLP-I具有梗塞-免除作用(infarct-sparing effect) 0在含氧量正 常的条件下GLP-I不能直接激活心脏或心肌细胞中的Akt (也称为蛋白激酶B)或胞外调控 的激酶Erkl/2，但是AMP-激活的激酶(AMPK)在Thr (172)上的磷酸化得到增强。另外，糖 酵解酶磷酸果糖激酶-2被剂量依赖性地激活。缺血后再灌注过程中，PKB/Akt和AMPK的 磷酸化的调控比较明显。因此GLP-I似乎通过增强糖解而直接保护心脏防止低流量缺血。
但是，如本文已经描述的那样由于天然GLP-I在体内被DPP-IV快速降解，天然 GLP-I的使用在体内引起某些问题。另外，GLP-I经过肾排泄。这些因素引起以下问题: GLP-I (7-36)和NH2-末端截短代谢物GLP-I (9-36)中的哪一种肽是体内的活性部分，以及 在治疗应用中生理作用是否通过天然GLP-I或其片段而得以发挥。由于GLP-I在体内的快速降解，认为GLP-I仅对于诸如可能用于患有急性心肌 梗死、冠状手术(coronary surgery)、脑血管事件或败血症的患者的重症监护病房等短期 代谢控制是合适的工具。对于更长期的代谢控制，提出了诸如GLP-I受体的激动剂等肠 降血糖素模拟物(参见例如 Nauck Μ. A.，Nov-Hormones et metabolisme，2004 年 12 月， 36(11-12)，第 852-8 页)。但是，不考虑其在体内的快速降解的话，GLP-I作为治疗冠心病，特别是治疗AMI 或MI的潜在药物，似乎提供了良好的基础。因此进行了各种尝试来合成天然存在的GLP-1(GLP-1 (7-37))的(针对DPP-IV 而)稳定化的类似物。特别地，将第8位残基(在体内为Ala)用诸如Gly、Ser或Thr等 另一残基置换(Burcelin, R.等(1999)Metabolism 48,252-258) 已经对作为合成分子 的或由经基因工程化以分泌突变多肽的细胞系产生的GlyS或G8类似物进行了深入试验 (Burcelin，R.，等(1999),Annals of the New York Academy of Sciences 875:277-285)。 向GLP-I (7-37)中引入各种其它修饰来增强其体内稳定性，并且不会损害其生物活性。但 是，所有这些方法由于涉及的相当大的问题而未实现任何治疗显著效果。然而，这些方法都不能够长期在体内提供GLP-1。这是由于本文所讨论的蛋白水解 性降解，由于GLP-I代谢和体内通常出现的正常蛋白降解。因此，目前，需要GLP-I的患者 在较长的时期中，即只要其罹患这种待治疗的疾病，或更糟的是，终其一生，都不得不接受 一剂量或甚至多剂量的GLP-I或其类似物或变体。在该时期内，由于GLP-I在体内的半衰期 较短，通常在较短的间隔内就要进行施用。另外，必须通过医师或通过患者自己施用GLP-I 的剂量。这代表了对患者和环境的主要挑战和负担。为了克服该问题，可以通过对患者提 供含有编码和表达GLP-I的核酸的细胞来施用GLP-I。所述细胞的植入会确保较长期地在 体内提供GLP-I，并且由于由移植细胞分泌GLP-I，所述植入在目的位置处直接提供GLP-I。WO 99/53064公开了这样一种策略形成多聚体GLP-I表达盒，该多聚体GLP-I表 达盒可以引入至作为公众可获得的永生化细胞系的各种细胞类型中，并使原代细胞培养物 分裂。实例包括来自哺乳动物的CNS的EGF-响应性神经球、bFGF-响应性神经祖干细胞， 而工作实例使用幼仓鼠肾(BHK)细胞。据称所植入的转染细胞已经成功地用于治疗糖尿病 小鼠，使得将葡萄糖控制到基本上等同于非糖尿病对照。但是，这种植入技术不符合用于例 如糖尿病患者或已经成功地用于AMI或MI患者的常规治疗的要求。另外，本领域已知，免疫系统通常识别外源细胞并且触发免疫应答，从而保护生物 体免受所述外部物质的影响。因此能够表达GLP-I或其任何变体或衍生物的细胞的植入可 以引起生物体中的免疫应答。治疗中所述防御性应答可以引起相当大的不期望的副作用， 并且可能引起受治疗生物体的严重并发症，或甚至死亡。克服该问题的一种策略可以是使用自体细胞，即源自患者自身的细胞，将其遗传 上改变为瞬时表达GLP-I，特别是GLP-I (7-36)。但是，所述方法通常限于特定患者的细胞， 并且需要在使用之前于实验室中长期制备。但是，AMI或MI需要在心肌梗死后的数分钟或数小时内进行治疗，即短时间提供有效的药物。总之，目前本领域不能获得有效的AMI或MI治疗，该有效的AMI或MI治疗允许在 待治疗的患者中发生心肌梗死之后立即提供有效的治疗。换言之，现有技术不能提供反映 GLP-I已知的全部有益效果的治疗，所述有益效果例如GLP-I活性强烈减少由缺血或缺氧 引起的损伤和心脏组织的可能死亡，而不需要重复地施用GLP-I肽，和/或没有针对例如植 入的表达GLP-I的同种异体细胞的不期望的免疫应答的风险。

发明内容
因此，本发明的目的在于提供使用GLP-I类肽分子或其类似物对AMI或MI的有 效治疗，所述GLP-I类肽分子或其类似物在体内长期具有生物活性，而不需要重复地施用 GLP-I肽和/或没有引起不期望的免疫应答的风险。通过所附权利要求，特别是通过利用诸如间充质干细胞或间充质基质细胞或可用 于本发明情况的任何另外的细胞等编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I或其 片段或变体的融合肽的细胞来治疗AMI或MI或者与它们相关的疾病，从而解决本发明的目 的，其中将所述编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽 的细胞封装在(球形)微囊中以防止所治疗患者的免疫系统的应答。在本发明的情况下，术 语“编码...的细胞”通常是指“经工程化而含有编码...的核酸的细胞或包含编码...的 核酸的细胞”。优选将用于治疗AMI或MI或者与它们相关的疾病的编码和分泌GLP-1、其片段或 变体或者包含GLP-I肽或其片段或变体的融合肽的用于提供本文所述的发明方案的细胞， 封装在(球形)微囊中以防止所治疗患者的免疫系统的应答。在本发明的情况下，所述(球 形)微囊优选包含(球形)核(即所述核可以是球形或不是球形)和至少一个表面涂布层， 其中 所述(球形)核包含交联聚合物(的混合物)和本文定义的编码和分泌GLP-1、 其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽的细胞，或由交联聚合物(或混合 物)和本文定义的编码和分泌GLP-I、其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合 肽的细胞组成，所述细胞例如间充质干细胞或间充质基质细胞或可用于本发明的任何另外 的细胞(类型)；和·所述至少一个表面涂布层包含通常交联的聚合物(的混合物)或由通常交联的 聚合物(的混合物)组成。本文定义的包含编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变 体的融合肽的本文所用细胞的(球形)微囊，通常包括一粒径，本文称之为(球形)微囊的 总直径。通常而言，本文所用的(球形)微囊的总直径可以根据具体的治疗和施用模式而 有较大变化。在本发明的情况下，通常通过将本文所用的(球形)微囊经由例如注射或植 入施用至特定的施用位置中，从而局部地进行治疗。因此，施用模式可以使本文所用的(球 形)微囊的总直径受例如注射套管的直径的限制。本文所用的(球形)微囊的总直径进一 步由(球形)微囊的核的直径和所述至少一个表面涂布层的厚度确定，因为两个直径通常 至少部分相互依赖，并且当然会影响(球形)微囊的总直径。为了治疗本文所定义的AMI或MI疾病和与它们相关的疾病，本申请的发明人惊奇地发现，可以使用的(球形)微囊的总直径(粒径)为约120 μ m 约800 μ m，优选 为约120 μ m 约700 μ m,更优选总直径为约150 μ m 约650 μ m,还更优选总直径为约 165 μ m 约600 μ m。特别地，对于治疗AMI或MI有利的(球形)微囊的总直径(粒径) 为约120 μ m 约300 μ m，更优选总直径为约150 μ m 约250 μ m，还更优选总直径为约 165 μ m 约225 μ m，最优选总直径为约180 μ m 约200 μ m，例如为约180μπι、185μπι、 190 μ m或200 μ m。包括所述总直径的(球形)微囊通常会保持在所选注射位置的心肌中， 不会迁移到周围组织中。这使得在治疗期间在注射位置处提供的GLP-I和/或其变体或衍 生物的连续表达时间足够长，从而提供GLP-I已知的全部有益效果，例如其强烈减少由缺 血或缺氧引起的损伤和心脏组织的可能死亡的活性。在本文情况下，术语“球形”以其最宽泛的意义理解。球形颗粒优选理解成具有类 似球的形状，由此该形状可以是对称或不对称的，例如(球形)微囊和/或其核可以具有椭 球形状。在次佳实施方式中本发明所用的微囊或核可以不是本文意义内的球形，但是可以 具有任意形状，例如在微囊表面上具有突出或凹进部分。在本公开中无论何处提及“球形” 微囊或核，同样也可以提供、制备或使用“非球形”微囊或核。本文定义的(球形)微囊优选包含(球形)核(即，所述核可以是球形或不是球 形)，其中所述(球形)核包含交联聚合物(的混合物)以及编码和分泌GLP-1、其片段或 变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽的细胞，或由交联聚合物(或混合物)和编 码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽的细胞组成，以用 于治疗本文定义的AMI或MI疾病，或者与它们相关的疾病，所述细胞例如为间充质干细胞 或间充质基质细胞或可用于本发明情况的任何其它细胞(类型)。在本发明的情况下，(球形)微囊的(球形)核的通常交联的聚合物形成其空穴中 包埋细胞的支架结构，所述细胞例如为间充质干细胞或间充质基质细胞或可用于本发明情 况的任何其它细胞(类型)。可以将这些细胞单独或通常作为聚集体包埋在支架结构中，例 如作为约10个细胞 约10,000个细胞，例如约10个细胞 约500个细胞、约10个细胞 约1，000个细胞或约10个细胞 约10，000个细胞、更优选10个细胞 约100个细胞或10 个细胞 约1000个细胞的聚集细胞(的库)。优选的是，(球形)核包含均勻分布的交联 聚合物和均勻分布的本文定义的包埋细胞。优选的是，根据下述方法制备包括支架结构和 本文定义的包埋细胞的核。在该情况下，极为重要的是当制备根据本发明使用的(球形) 微囊时，将(球形)微囊的封装细胞，例如间充质干细胞或间充质基质细胞、自体细胞或可 用于本发明情况的任何其它细胞(类型)完全包埋在聚合物基质中。包埋细胞，例如间充质干细胞或间充质基质细胞或可用于本发明情况的(球形) 微囊的本文定义的任何其它细胞(类型)，在核中存在的浓度为约1X105、约IX IO6或约 1 X IO7个细胞/ml交联支架聚合物 5 X IO8个细胞/ml交联支架聚合物，更优选的浓度为 约1 X 105、约1 X IO6或约1 X IO7个细胞/ml交联支架聚合物 1 X IO8个细胞/ml交联支架 聚合物，最优选的浓度为1 X 105、约1 X IO6或约2 X IO7个细胞/ml交联支架聚合物 6 X IO7 个细胞/ml交联支架聚合物。包埋在(球形)微囊的(球形)核中的细胞通常取决于如上定义的(球形)核的 直径。举例而言，总直径为约160 μ m的示例的创造性(球形)微囊在其(球形)核中可 以包含许多包埋细胞，如间充质干细胞或间充质基质细胞或本文定义的任何其它细胞(类型)，例如每个(球形)核进而每个(球形)微囊中包含约例如10个细胞 100个细胞、优 选约30个细胞 80个细胞，例如约60个细胞 70个细胞。因此，施用约60，000个创造 性(球形)微囊通常一次将约3百万 4百万个细胞提供至待治疗的位置。本发明使用的(球形)微囊的核具有的直径(粒径)通常不超过本文定义的 (球形)微囊的总直径的直径。通常而言，本发明使用的(球形)微囊的核具有的直径为 约50 μ m 约220 μ m，优选直径为约100 μ m 约200 μ m,同样优选直径为约115 μ m 约 185 μ m,更优选直径为约130 μ m 约170 μ m,还更优选直径为约145 μ m 约155 μ m,例如 约 120 μ m、125 μ m、130 μ m、135 μ m、140 μ m、145 μ m、150 μ m 或 155 μ m。特别优选的是,本发 明使用的(球形)微囊的核具有的直径比本文定义的(球形)微囊的总直径小约1 μ m 约80 μ m,更优选比本文定义的(球形)微囊的总直径小约15 μ m 约70 μ m,并且最优选 比本文定义的(球形)微囊的总直径小约30 μ m 约60 μ m。换言之，本发明使用的(球 形)微囊的核的直径具有的尺寸可以为约50 μ m、约60 μ m、约70 μ m、约80 μ m、约90 μ m、 ^ 100 μ m> ^ ΙΙΟμ 、^]130μ >^ 135μ >^ 140 μ m> ^ 145 μ m、 约 150 μ m、约 155 μ m、约 160 μ m、约 165 μ m、约 170 μ m、约 175 μ m、约 180 μ m、约 185 μ m、约 190 μ m、约 195 μ m、约 200 μ m、约 205 μ m、约 210 μ m、约 215 μ m,或甚至约 220 μ m,或可以包 括选自此处所提及任何两个具体值中的任何范围。本文定义的(球形)微囊的核包括本文定义的编码和分泌GLP-1、其片段或变体或 者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽的细胞，以用于治疗如本文定义的AMI或MI疾病， 或者与它们相关的疾病。位于所述核周围的所述细胞，例如间充质细胞或间充质基质细胞， 或在本发明情况下可用于(球形)核的任何其它细胞(类型)，或者突出支架结构的细胞可 引起免疫问题，因为免疫系统会将这些微囊识别为外源成分，因此，这些微囊会受到免疫系 统攻击。虽然可以通过降低初始溶液中的细胞浓度来避免该效应，但是本发明通过增加核 的细胞比例(cell portion)来改善微囊的功效。核中的细胞浓度越高，则所得待移植的微 囊的总体积越小，即微囊可在注射位置所起的作用越有效。为了避免当使用在(球形)微囊 的(球形)核中的高浓度细胞时的免疫问题，本发明提供施涂在(球形)核上的至少一个表 面涂布层。即使细胞位于的位置非常接近于核边缘，该表面涂布层也不允许发生免疫应答， 原因在于由于表面涂布层充当屏障，这些细胞对于宿主免疫系统而言是不可及的。该表面 涂布层通常由如本文定义的通常的交联聚合物(的混合物)组成，不含有任何细胞。根据特 别优选的实施方式，以上定义的(球形)核涂布有至少一个或多于一个的表面涂布层，例如 1个、2个、3个、4个、5个、5 10个或更多个的表面涂布层，更优选1个、2个或3个表面涂 布层，最优选仅具有一个表面涂布层。通常而言，各表面涂布层围绕核具有均勻的厚度。本 发明使用的(球形)微囊的表面涂布层的厚度，几乎可以任意变化，并且通常为约Iym 约80 μ m,更优选为约15 μ m 约70 μ m,最优选为约20 μ m 约40 μ m,例如约30 μ m。本文所用的(球形)微囊的(球形)核(以及可选地，(球形)微囊的所述至少 一个表面涂布层)包含交联聚合物(的混合物)或由交联聚合物(的混合物)组成。在 该情况下，对于形成如本发明定义的(球形)微囊的(球形)核和所述至少一个表面涂布 层((球形)核和至少一个表面涂布层相互独立)，可以使用本领域已知并且适于封装的任 何药学上可接受的(交联)聚合物。优选的是，所使用的所述聚合物在一方面在其交联状态下对于从外部供应氧和营养物是可渗透的，另一方面，允许由核的细胞所编码和分泌的 肽从微囊扩散到患者组织或体液中。另外，交联聚合物防止身体免疫系统的成分通过基质 侵入。举例而言，可以使用的聚合物例如有合成水溶性(生物)聚合物、半合成水溶性(生 物)聚合物和例如来自天然聚合物等的天然水溶性(生物)聚合物，例如所选择的蛋白质 或基于蛋白质的聚合物(例如胶原蛋白、白蛋白等)、聚氨基酸(例如聚L-赖氨酸，聚-L-谷 氨酸等)、多糖和其衍生物(例如羧甲基纤维素、纤维素硫酸酯、琼脂糖、(例如物种海带 (Laminarales)、外子藻(Ectocarpales)、墨角藻(Fucales)的)包括褐藻的藻酸盐在内的 藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸、肝素和相关的硫酸葡萄糖胺(glycosamino sulfate)、右旋糖 苷和其衍生物、壳聚糖和其衍生物)。还可以使用合成聚合物，例如脂肪族聚酯(例如聚乳 酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸等)、聚酰胺、聚酸酐、聚原酸酯、聚磷腈、热塑性聚氨酯、聚乙烯 醇、聚羟基甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚四氟乙烯等。另外，本文因而可以使用嵌段聚合物，即源自两种或更多种上述聚合物的组合的 聚合物。所述嵌段聚合物可由本领域技术人员根据诸如孔径、交联度、毒性、处理、生物相容 性等所需性质进行选择。在本发明的情况下将任何的此处聚合物定义为“化学上不同的聚 合物”，即这些聚合物中的每一种通常不显示与此处任何其它聚合物相同的摩尔质量和结 构。相反，“化学上相同的聚合物”是指，聚合物显示相同的摩尔质量和结构。最后，此处聚合物的混合物也包括在本文中，其中所述混合物中含有的聚合物的 量可由本领域技术人员根据诸如本文所述的性质等所需性质进行选择。在这方面，如果所 得聚合物混合物的总摩尔质量以及混合物中的单一聚合物的相应摩尔百分比与其它聚合 物混合物相同，则将聚合物的混合物视为与另一聚合物混合物化学上相同(“化学上相同的 聚合物”)。优选的是，本文所用的(球形)微囊的(球形)核(以及可选地，(球形)微囊的 所述至少一个表面涂布层)的交联聚合物(的混合物)包含藻酸盐或由藻酸盐组成。由于 藻酸盐的生物相容性和交联性，如果根据本发明将其用作用于形成(球形)核和/或至少 一个表面涂布层的聚合物，则是特别有利的。从化学角度来看，藻酸盐是源自被β-D-甘露 糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸的杂聚区域分隔开的β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸的 均聚基团的阴离子多糖。藻酸盐是水溶性的，并且在诸如钠或钾等单价阳离子的存在下形 成高粘度溶液。当单链藻酸盐与二价、三价或多价阳离子(例如钙、钡或聚赖氨酸)相互作 用时形成交联的水不溶性水凝胶。优选的是，对于封装使用经纯化的藻酸盐(例如根据DE 198 36 960，通过参考将其具体内容并入本文)，更优选的是在生理盐水溶液中的藻酸钾或 藻酸钠。所述藻酸盐通常显示的平均摩尔质量为约20kDa 约10，OOOkDa,更优选摩尔质 量为约IOOkDa 约1，200kDa。用于形成本发明所用的(球形)微囊的核和/或至少一个 表面涂布层的藻酸盐，可以作为溶液提供，更优选作为水溶液提供，例如待使用的藻酸盐的 0.2% (w/v)的藻酸盐水溶液的粘度可以为约2mPas 约50mPas，更优选为约3mPas 约 lOmPas。如果根据本发明使用藻酸盐，则优选富含α-L-古洛糖醛酸的藻酸盐。换言之，优 选含有至少50% α-L-古洛糖醛酸(和少于50%的β-D-甘露糖醛酸)的藻酸盐。更优 选的是，所使用的藻酸盐含有50% 70%的α-L-古洛糖醛酸和30% 50%的β-D-甘 露糖醛酸。适于制备本发明使用的(球形)微囊的藻酸盐可通过从某些藻类物种提取而获 得，所述藻类物种包括，但不限于，诸如海带(Laminarales)、外子藻(Ectocarpales)、墨角藻(Fucales)等褐藻，和产生藻酸盐的藻类的其它物种。藻酸盐可以根据本领域技术人员 已知的用于制备藻酸盐的任何方法从新鲜藻类材料或干燥材料分离。用于本文定义的制备(球形)微囊的(球形)核的交联聚合物，和用于制备(球 形)微囊的至少一个表面涂布层的交联聚合物在所选聚合物方面和在所选浓度方面可以 相同或不同。根据第一实施方式用于制备(球形)核和至少一个表面涂布层的交联聚合物可以 包含浓度相同或不同的化学上相同的聚合物。优选的是，使用选自本文定义的任何聚合物 中的非交联聚合物溶液制备(球形)核和至少一个表面涂布层中存在的聚合物。在该聚合 物溶液中，非交联聚合物的存在浓度通常为约0.1% (w/v) 约8% (w/v)的非交联聚合 物，更优选浓度为约0. 1% (w/v) 约4% (w/v)的非交联聚合物，还更优选浓度为约0.5% (w/v) 约2. 5% (w/v)的非交联聚合物，最优选浓度为约1% (w/v) 约2% (w/v)的非 交联聚合物。如果将本文所述的藻酸盐用作用于制备本文所用(球形)微囊的(球形)核 和/或用于制备(球形)微囊的至少一个表面涂布层的聚合物，则用于制备(球形)核的 聚合物溶液的浓度和用于制备(球形)微囊的至少一个表面涂布层的聚合物溶液的浓度， 可以相互独立地选自0. 1% (w/v) 4% (w/v)的非交联聚合物浓度，优选选自0.4% (w/ ν) 2% (w/v)的非交联聚合物浓度。两种溶液的藻酸盐浓度可以相同。作为选择，对于 制备本发明使用的(球形)微囊的(球形)核和至少一个表面涂布层，可以使用不同的藻 酸盐浓度。优选的是，用于制备(球形)核和/或至少一个表面涂布层的非交联聚合物包 含化学上相同的聚合物，更优选浓度相同，例如使用本文定义的浓度的本文定义的聚合物。 在该情况下，术语“ ％ (w/v)，，是指非交联聚合物的浓度，并通常在例如将非交联聚合物溶 解于合适溶剂后(交联前)，基于相对于聚合物溶液的总体积的干燥形式的聚合物的特定 量而确定。但是，如果适用，例如如果使用在标准条件(室温、常压等)下处于流体聚集体 状态的聚合物，此处浓度还可以用相应的“％ v/v”浓度来代替。根据第二实施方式用于制备(球形)核和至少一个表面涂布层的交联聚合物可以 包含浓度相同或不同的化学上不同的聚合物。由此，对于(球形)核和至少一个表面涂布 层而言浓度和聚合物可以相互独立地按照本文定义单独选择。另外，聚合物可以选自本文 定义的聚合物，本文定义的聚合物包括例如天然聚合物、合成聚合物和聚合物的组合，例如 嵌段聚合物。用于核或至少一个表面涂布层的聚合物的性质的差异还可以是由于所用聚合 物的不同分子量和/或由于相同聚合物的不同交联等。在(球形)微囊包含超过一个表面涂布层的情况下，至少一个表面涂布层的每一 层中的聚合物可以相同或不同，即各表面涂布层的交联聚合物可以含有浓度相同或不同的 化学上相同或不同的聚合物，例如本发明使用的(球形)微囊可以包含由本文定义的任何 聚合物组成的本文定义的至少一个表面涂布层，以及由诸如本文定义的聚氨基酸(如聚 L-赖氨酸、聚L-谷氨酸等)等聚阳离子组成的另外的外部表面涂布层。类似地，用于不同 表面涂布层的聚合物的性质的差异可以是由于所用聚合物的不同分子量和/或由于相同 聚合物的不同交联等。本文使用的(球形)微囊的(球形)核还包含细胞。所述细胞通常选自干细胞或 基质细胞，例如间充质干细胞或间充质基质细胞，或选自可用于本发明情况的任何其它细 胞(类型)，以治疗AMI或MI疾病或者与它们相关的疾病。如下所述，所述细胞通常通过用核酸或含有核酸的载体稳定转染细胞而获得，所述核酸编码GLP-1、其片段或变体或者包含 GLP-I或其片段或变体的融合肽。适于本文使用的(球形)微囊的(球形)核的细胞可以选自(未分化的)干细胞， 包括全能干细胞、多潜能干细胞(pluripotent stem cells)或多能干细胞(multipotent stem cells)。用于该情况的干细胞优选包括胚胎干细胞或者源自外胚层、中胚层或内胚层 的干细胞、或者诸如(人类)间充质干细胞或间充质基质细胞(MSC，hMSC)的成体干细胞 (例如源自人类骨髓或源自脂肪组织)、造血干细胞、表皮干细胞、神经干细胞和未成熟的 成纤维细胞(包括来自皮肤的成纤维细胞，成肌纤维细胞)等。这些(未分化的)干细胞 通常能够进行对称干细胞分裂，即产生相同细胞拷贝的细胞分裂。干细胞保留转化成任何 细胞类型的能力。另外，干细胞能够进行不对称分裂，产生干细胞拷贝和不同于干细胞拷贝 的另一细胞，例如分化细胞。适合于本文使用的(球形)微囊的(球形)核的本文定义的干细胞，特别是间充质 干细胞或间充质基质细胞，可以另外地产生支持GLP-I或其片段或变体的细胞保护作用的 一组内源性营养因子。用于间充质基质细胞的该旁分泌细胞保护机制的生物活性因子可以 例如是细胞因子GRO、IL-6、IL-8、MCP-I以及生长因子VEGF、⑶NF和神经营养因子_3。因 此，根据特别优选的实施方式，(球形)微囊的(球形)核中的细胞分泌内源性蛋白或肽作 为以治疗水平由所述囊释放的旁分泌因子，所述旁分泌因子选自VEGF、IL6、IL8、⑶NF、NT3 禾口 MCPl等。本文使用的(球形)微囊的核，可以替代性地含有选自例如能够通过此处的干细 胞或基质细胞获得的(分化)细胞的细胞，所述细胞例如是诸如(成熟)成纤维细胞、软骨 细胞(cartilage cell, chondrocyte)、骨细胞(bone cell)(成骨细胞(osteoblasts) / # 细胞(osteocytes)，破骨细胞(osteoclasts))、脂肪细胞(fat cell,adipocyte)或平滑肌 细胞等结缔组织细胞家族或者包括淋巴样祖细胞或源自其的细胞在内的血液细胞，例如NK 细胞、T细胞、B细胞或树突细胞、或者常见的骨髓祖细胞或源自其的细胞，例如树突细胞、 单核细胞、巨噬细胞、破骨细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱细胞、血小板、巨核细胞 或红细胞、或巨噬细胞、包括星形细胞、少突细胞等在内的神经细胞、或者上皮细胞、或者表 皮细胞。这些分化细胞通常能够进行对称细胞分裂，即产生分化的亲本细胞的相同拷贝的 细胞分裂。另外，在某些情况下，这些分化细胞能够进行不对称分裂，产生亲本细胞的相同 拷贝和不同于亲本细胞的另一细胞，即比亲本细胞进一步分化的细胞。作为选择，在某些情 况下，例如通过添加选择性分化因子，能够使本文定义的分化细胞进一步分化而不需要进 行细胞分裂。另外，本发明使用的(球形)微囊的(球形)核中包埋的细胞，可以是取自待治疗 患者自身的细胞(自体细胞)或可以取自同种异体细胞(例如取自体外培养的已建立细胞 系，如HEK293细胞、hTERT-MSC细胞等)。由于表面涂布层包埋本发明使用的(球形)微囊 的(球形)核，这使得可以使用同种异体细胞而不会引起待治疗患者的任何不期望的免疫应答。本发明使用的(球形)微囊的(球形)核中包埋的细胞可以另外是本文定义的 (分化和/或未分化)细胞类型的组合。本发明使用的(球形)微囊的(球形)核可以含 有例如人类间充质干细胞或人类间充质基质细胞，其中这些细胞的一部分可以在体外或体内分化成本文定义的细胞类型，如脂肪细胞(适于移植到脂肪组织中)等。因此，可以将例 如共有相同谱系的各种细胞类型(例如源自特定的干细胞类型)分配到核中。总之，适于制备本发明使用的(球形)微囊的(球形)核的细胞可以选自未分化 细胞或分化细胞。根据一个实施方式，可以优选本文定义的未分化细胞。例如由于所述未 分化细胞的寿命较长，所述未分化细胞可以提供有利的性质，例如本发明使用的(球形)微 囊的长期作用，如长期表达和分泌本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，或其片段或变体 的能力。在替代性实施方式中，本文定义的分化细胞对于制备本发明使用的(球形)微囊 的(球形)核而言可以是优选的，这是因为它们通常不再增殖，因此不会引起本发明使用的 (球形)微囊的(球形)核内的细胞的任何不期望的增殖。细胞的特异性分化可由本领域 技术人员在体外根据本领域已知的方法通过向前体细胞添加所选择的分化因子而进行。优 选的是，对细胞进行分化，从而使本发明使用的(球形)微囊的(球形)核中包埋的绝大多 数细胞(或至少90%，更优选至少95%，最优选至少99% )属于相同细胞类型。特别地， 本文定义的间充质干细胞可以在体外分化成例如成骨细胞、软骨细胞、诸如脂肪细胞(fat cell)等脂肪细胞(adipocyte)，诸如脑细胞等神经元样细胞等，并且进而被本文使用。关 于使用未分化细胞还是分化细胞来制备本文定义的(球形)微囊的(球形)核，可以取决 于待治疗疾病的特定要求，例如病痛位置、施用模式、为植入所选择的组织等。可由本领域 技术人员评估这些标准而进行合适细胞的选择。另外，适于制备本文定义的(球形)微囊的(球形)核的细胞可以是永生化细胞 或非永生化细胞，优选是永生化细胞。如果使用永生化细胞，这些细胞优选保留其进行本文 所讨论的对称和/或不对称细胞分裂的能力。根据本发明，当细胞超过正常细胞(即非永 生化细胞)的寿命的两倍时，将该细胞定义为永生化的。在体外正常二倍体细胞的最大寿 命随着细胞类型(例如胎儿细胞或成体细胞)和培养条件而有所变化。因此，在体外培养 的正常细胞的最大寿命为约60 80个群体倍增。例如，角质形成细胞可以分裂约80次， 成纤维细胞可以分裂超过50次，淋巴细胞可以分裂约20次。正常的骨髓基质细胞可以显 示的最大寿命为30 40个群体倍增。优选的是，用于制备本发明使用的(球形)微囊的 (球形)核的细胞系，可以连续地生长超过350个群体倍增，并且仍然可以保持年轻细胞的 正常生长率特性。使制备本文定义的创造性(球形)微囊的(球形)核所用的细胞永生化的方法是 本领域公知的，并且可以进而应用于此处(参见例如WO 03/010305或WO 98/66827，通过参 考将其并入本文)。示例性的方法(根据WO 03/010305)包括例如以下步骤a)根据本领域技术人员已知的标准常规细胞培养方法培养细胞，例如干细胞，特 别是源自人类骨髓的干细胞(例如(人类)间充质干细胞(MSC、hMSC)))；b)用包含人类端粒酶逆转录酶OiTERT)基因或其变体的至少一个片段的逆转录 病毒载体通过以下步骤转导所述细胞培养物bl)培养包封细胞系(例如PA317细胞、PG13细胞、Phenix等)，其中所述包封细 胞系是其中产生逆转录病毒载体的细胞，b2)构建逆转录病毒载体(例如源自莫洛尼鼠类白血病病毒等)，其中所述逆转 录病毒载体包含人类端粒重复(hTRT)基因或其变体的催化亚基的至少一个片段，更优选 hTERT cDNA 片段，例如来自 pGRN145 的 3452 个碱基对的 EcoRI 片段(Geron Corporation)，
b3)用所述逆转录病毒载体转染所述包封细胞系，b4)用所述经转染细胞转导(transduce)所述包封细胞系，优选通过使细胞与逆 转录病毒载体一起离心而进行，b5)用步骤b4)的包封细胞转导此处步骤a)的培养的细胞，所述细胞包含所述逆
转录病毒载体。c)获得永生化细胞系，其中所述永生化细胞系与步骤a)的细胞相比具有基本上 相同的特性和性质。结果，源自人类端粒亚基(hTRT)基因的所插入的多核苷酸序列可以进 行转录和翻译，从而产生功能性端粒酶。本领域技术人员会意识到，由于密码子简并性，许 多多核苷酸序列会编码相同的端粒酶。另外，还包括端粒酶变体，该端粒酶变体具有与野生 型端粒酶序列基本上相同的序列，但是保留野生型端粒酶多肽的功能(例如由野生型端粒 酶多肽中氨基酸的保守性取代产生)。可以对包埋在(球形)微囊的(球形)核中的编码和分泌本文定义的GLP-I肽以 及GLP-I融合肽的细胞，进行进一步修饰或工程化，从而另外分泌选自由以下因子组成的 组中的因子抗凋亡因子、生长因子、VEGF、促红细胞生成素(EPO)、抗血小板因子、抗凝血 因子、抗血栓形成药、抗血管生成因子或显示心脏保护功能的任何另外的因子等。根据一个具体实施方式
，可以对包埋在(球形)微囊的核中的编码和分泌本文定 义的GLP-I肽以及GLP-I融合肽的细胞进行工程化，从而另外分泌促红细胞生成素(EPO)。 促红细胞生成素(也称为EPO、epoetin或procrit)是分子量为约34，000道尔顿的酸性 糖蛋白激素，以多种形式出现，包括α、β、ω和脱唾液酸(asialo)形式。促红细胞生成 素刺激血红细胞产生。其在肾中产生，并刺激在骨髓和别处的指定红细胞前体(erythroid precursor)的分裂和分化。通常而言，当身体处于健康状态时，促红细胞生成素以非常低的 浓度存在于血浆中，其中组织从现有数量的血红血球接受充足的氧合。该正常的低浓度对 于刺激通过老化正常失去的血红细胞的更换而言是足够的。在诸如缺氧、当循环中通过血 液细胞进行的氧运输减少时等条件下，循环中的促红细胞生成素的量增加。大量血液经由 出血而失去、过度暴露于辐射使血红细胞破坏、高海拔或长时间失去知觉引起的氧摄入减 少、或者各种形式的贫血或缺血可引起缺氧。响应于经受低氧胁迫的组织，促红细胞生成素 会通过以下过程增加红细胞产生刺激骨髓中的初生前体细胞转化成原成红细胞，原成红 细胞随后成熟，合成血红蛋白，并作为红细胞释放到循环中。当循环中红细胞的数量大于正 常组织氧需求所需时，循环中的促红细胞生成素减少。优选的是，促红细胞生成素用作细胞 中含有的另外因子，以诱导红细胞的产生，从而抗击贫血。(参见，例如Bottomley等Q002) Lancet Oncol. 3 :145)。还提出促红细胞生成素可用于控制患有异常止血的患者的出血。 (参见例如美国专利第6，274，158号)。重组人类促红细胞生成素(rHuEpo或印oetin[a]) 作为 EPOGEN(R) (epoetin α，重组人类促红细胞生成素)(Amgen Inc.，Thousand Oaks, Calif.)和作为PROCRIT(R)(印oetin α，重组人类促红细胞生成素)(Ortho Biotech Inc.，Raritan, N. J.)商购可得。EPO可以增加罹患AMI或MI的患者的红细胞比容值。促 红细胞生成素的红细胞比容值的正常范围对于女性而言是37% 48%，对于男性而言是 42% 52%。(参见 Case Records of the Massachusetts General Hospital :normal reference laboratory values. (1992)N. Eng. J. Med. 327 :718)。当然，必须对使用促红细 胞生成素来增加心血管疾病的患者，特别是罹患肾衰竭的患者的红细胞比容水平的安全性和功效进一步进行评价。优选的是，通常以不会诱导红细胞形成的浓度或持续时间来提供 促红细胞生成素，或者作为选择，增加受试对象中的红细胞比容为约IpM 小于ΙΟΟΟμΜ， 包括小于900 μ Μ、小于700 μ Μ、小于500 μ Μ、小于300 μ Μ、小于100 μ M或小于50 μ Μ。在 其它实施方式中，促红细胞生成素作为受试对象体重的函数进行施用。通常可以以约IU/ kg 10，000U/kg 受试对象体重，包括小于 7，500U/kg、5，000U/kg、2500U/kg、1000U/kg、 750U/kg、500U/kg、250Ug/kg、100Ug/kg、50U/kg、25U/kg、10U/kg、5U/kg 或 lU/kg 受试对象 体重的浓度提供促红细胞生成素。在该情况下，促红细胞生成素血清浓度正常在5mU/ml 50mU/ml内。对于罹患MI或AMI或者与其相关的其它疾病的患者，根据症状、体重、性别和 动物物种等，促红细胞生成素优选以50U/kg 100U/kg的浓度提供。通常假定优选将血液 浓度保持在约lmU/ml 100mU/ml的治疗选项。还优选的是，促红细胞生成素通常以不增 加幸存者的红细胞比容的浓度提供，其中在心肌梗死的1小时、2小时或3小时内施用单剂 量的促红细胞生成素，持续一段较长时间。根据另外一个具体实施方式
，可以对包埋在(球形)微囊的核中的编码和分泌本 文定义的GLP-I肽以及GLP-I融合肽的细胞进行工程化，从而另外分泌VEGF。根据另一个具体实施方式
，可以对包埋在(球形)微囊的核中的编码和分泌本 文定义的GLP-I肽以及GLP-I融合肽的细胞进行生物工程化，从而另外分泌抗凋亡因子。 所述因子可以包括，但不限于，APC(具有半胱天冬酶补充结构域的凋亡阻遏物)、Bcl-2、 Bcl-xL、Che-1/AATF、簇蛋白、胰岛素、Mcl-U NF_kB_依赖性抗凋亡因子、血清素、存活素 等。另外，充当本领域已知的凋亡因子的抑制因子并由此可视为抗凋亡因子的任何因子都 由此包括在内。所述因子优选由编码和分泌本文定义的GLP-I肽和GLP-I融合肽的核酸编 码并由细胞分泌。在该情况下，所述抗凋亡因子可以针对以下凋亡因子或凋亡相关蛋白中 的至少一种包括 AIF、诸如 Apaf-I，Apaf-2, Apaf-3 等 Apaf、oder AP0-2 (L)、AP0-3 (L)、
天冬酶_2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、 半胱天冬酶_8、半胱天冬酶_9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-11等半胱天冬酶、ced-3、 ced-9、c-Jun、c_Myc、crm A、细胞色素 C、CdRl、DcRl、DD、DED、DISC、DNA-PKcs、DR3、DR4、DR5、 FADD/M0RT-1、FAK, Fas (Fas-配体 CD95/fas (受体))、FLICE/MACH、FLIP、胞衬蛋白、fos、 G-肌动蛋白、feis-2、凝溶胶蛋白、粒酶Α/Β、I CAD, ICE、JNK、核纤层蛋白A/B、MAP、MCL-U Mdm-2、MEKK-1、M0RT-1、NEDD、NF-K B、NuMa、p53、PAK-2、PARP、穿孔蛋白、PITSLRE、PKC δ、 pRb、早衰蛋白、prICE、RAIDD、Ras, RIP、神经鞘磷脂酶、来自单纯疱疹的胸苷激酶、TRADD, TRAF2、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、TRAIL-R3、转谷氨酰胺酶等。本文定义的由(球形)微囊的(球形)核中含有的细胞编码和分泌的GLP-I肽可 选自任何已知的GLP-I肽序列。在该情况下，神经保护因子GLP-I位于已经深入研究过的 编码前原胰高血糖素的胰高血糖素基因上(参见例如White，J. W.等，1986 Nucleic Acid Res. 14(1 4719-4730)。作为高分子量前体分子的前原胰高血糖素分子在胰腺α细胞中 和在空肠及结肠L细胞中合成。前原胰高血糖素分子是长度为180个氨基酸的激素原，其序 列除了含有胰高血糖素之外，还含有相关结构的两个序列胰高血糖素样肽-I(GLP-I)和 胰高血糖素样肽-2(GLP-2)。在前原胰高血糖素分子中，GLP-I和GLP-2之间是17个氨基酸 的肽序列(更确切地说是15个氨基酸的序列加上C末端RR切割位点)，即插入肽2 (IP2)。
19IP2序列(在前体分子中位于GLP-I和GLP-2之间)在体内正常情况下在GLP-I的第37 位氨基酸之后经蛋白水解被切割。因此取决于细胞和环境，前原胰高血糖素模块切割成各 种肽，包括GLP-I (1-37)，其未加工形式的37个氨基酸的肽。通常而言，该加工发生在胰腺 和肠中。可以将GLP-I (1-37)序列进一步蛋白水解加工成为31个氨基酸加工形式的活性 GLP-I (7-37)，或其进一步降解产物GLP-I (7-36)酰胺。因此，GLP-I (7_37)的命名表示所讨 论的片段包括从亲本肽GLP-I的N末端计数时，第7 37位的氨基酸残基。GLP-I (7_36)、 GLP-I (7-36)酰胺的氨基酸序列和GLP-I (7-37)的氨基酸序列在式I (SEQ ID NO 25)中给 出His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-A Ia-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X(I)当X是NH2时其表示GLP-I (7-36)酰胺，或者当X不存在时其表示GLP-I (7-36)， 并且当X是Gly-OH时其表示GLP-I (7-37)。因此根据本发明的一个实施方式，GLP-I肽可以选自任何已知的GLP-I肽序列，例 如本文定义的GLP-I肽序列。在该情况下，GLP-I肽可以由包埋在(球形)微囊的(球形) 核中的细胞分泌，由此可以优选在制备(球形)核之前对所述细胞用编码本文定义的GLP-I 肽的核酸序列进行转染，从而使这些细胞表达和分泌GLP-I肽。优选的是，可由包埋在(球 形)微囊中的细胞编码和分泌的本文使用的GLP-I肽，可以选自由包含(野生型(wt)) GLP-I的第7 35位氨基酸的肽和与该肽显示有至少80%、90%、95%或甚至99%同一性 的肽组成的组中。通常而言，GLP-I肽可以选自由以下肽组成的组中(i)包含(野生型) GLP-I的第1 37位氨基酸的肽，(ii)包含(野生型)GLP-I的第7 35、36或37位氨基 酸的肽，(iii)GLP-I (7-36)酰胺和(iv)与这些肽中任一种显示有至少80%、90%、95%或 甚至99%同一性的肽，包括修饰肽。在该情况下，“经修饰的GLP-I肽”旨在表示任何GLP-I 变体或GLP-I片段，包括组合，例如保留(野生型)GLP-I的生物功能的变体的片段。将变 体和片段归类为对未经修饰的GLP-I序列的修饰，例如GLP-I (7-35,36或37)。在本发明的 含义内，任何变体或片段必须是功能性的，例如必须发挥与未经修饰的(GLP-I)肽相同或 类似的生物活性。术语“活性”是指生物活性(例如一种或多种生物活性，包括受体结合、 受体激活、显示GLP-I的已知有益效果，例如与现有技术所述的GLP-I的效果有关的如本文 所提及的其强烈地减少由与心脏组织的缺血或缺氧以及可能死亡引起的损伤的活性，对生 物活性可以在相同条件下与本文定义的天然存在的GLP-I肽和其片段或变体进行比较。优选的是，本文定义的GLP-I肽的变体或片段发挥GLP-I (7-35,36或37)的至少 25%的活性，更优选发挥本文定义的GLP-I (7-35、36或37)的至少50%的(生物)活性， 还更优选发挥60%、70%、80%或90%的(生物)活性，最优选发挥至少95%或99% (生 物)活性。生物活性可以通过标准检验进行确定，例如所述标准检验优选例如使用2型糖 尿病动物模型等，来确定作为肠降血糖素激素降低血糖水平的活性。根据一个特别优选的实施方式，可由包埋在(球形)微囊的(球形)核中的细 胞编码的本文定义的GLP-I肽或GLP-融合肽，在其N末端不包含本文定义的(天然) GLP-I (1-37)序列的天然存在的第1 6位氨基酸。还更优选的是，本文定义的GLP-I肽 或如下定义的GLP-融合肽在其N末端不包括本文定义的天然GLP-I (1-37)序列的天然 存在的第1、2、3、4、5和/或6位氨基酸。该附带条件优选是指例如选自由包含GLP-1、GLP-I (7-36)酰胺的第7-35、36或37位氨基酸的肽和与这些肽中任一种显示有至少80%、 90%、95%或甚至99%同一性的肽，包括修饰肽组成的组中的本文定义的GLP-I肽以及是 指含有所述GLP-I肽的GLP-I融合肽。但是，该附带条件不排除本文定义的所述GLP-I肽 或本文定义的GLP-I融合肽包含N末端(或C末端)序列修饰或与其融合的另外的氨基酸 或肽，例如信号肽序列和/或前导肽序列等，但是该另外的氨基酸或肽不同于野生型GLP-I 的第1 6位氨基酸的序列。在另一优选实施方式中，连接在其同源物的GLP-I (7-35、36 或37)的N末端的任何氨基酸不对应于GLP-I (7-35、36或37)的第6位处的天然存在的氨 基酸。根据另外的优选实施方式，(直接)连接在其同源物的GLP-l(7-35、36或37)的N 末端的任何氨基酸不对应于天然GLP-I (优选在GLP-I中以其天然顺序)的天然存在的第 6位氨基酸，不对应于天然存在的第5和6位氨基酸，不对应于天然存在的第4、5和6位氨 基酸，不对应于天然存在的第3、4、5和6位氨基酸，不对应于天然存在的第2、3、4、5和6位 氨基酸，或不对应于天然存在的第1、2、3、4、5和6位氨基酸。根据一个特别优选实施方式， 连接在其同源物的GLP-I (7-35,36或37)的N末端的任何氨基酸不对应于前原胰高血糖素 的序列。天然GLP-1，特别是GLP-I (7-36)，在体内经历的半衰期较短，因此通常在其中严 格避免频繁施用或其中设想进行长期施用的治疗中使用受到限制。GLP-I在第8位和第9 位残基之间被DPP-IV(二肽基肽酶IV)在数分钟内于血浆中快速降解，产生失活的NH2-末 端截短的代谢物GLP-I (9-36)。另外，天然GLP-I通常经过肾排泄。这些因素引起以下问 题GLP-l(7-36)和NH2-末端截短代谢物GLP-I (9-36)中的哪一种肽是体内的活性部分，以 及在治疗应用中生理作用是否通过天然GLP-I或其片段而得以发挥。作为其在体内快速降 解的结果和由于其在体内快速降解，可以将天然GLP-I或其片段用作诸如可能用于患有急 性AMI或MI疾病或者与它们相关的疾病的患者的重症监护病房等短期代谢控制的合适工 具。为了避免所述快速降解，进行了各种尝试来合成天然存在的GLP-I (例如 GLP-I (7-37))的稳定化(防止被DPP-IV降解)类似物。特别地，将第8位残基(在体内 为 Ala)用诸如 Gly、Ser 或 Thr 等另一残基置换(Burcelin, R.等(1999)Metabolism 48， 252-258)。已经对作为合成分子的GlyS (或G8)类似物或由经基因工程化以分泌突变多肽 的细胞系产生的GlyS (或G8)类似物进行了深入试验(Burcelin, R.，等(1999) ,Annals of the New York Academy of Sciences 875:277-285)。向例如 GLP-1 (7-37)中引入各种其 它修饰来增强其体内稳定性，并且不会损害其生物活性。所述方法通过使GLP-I稳定而不被DPP-IV降解，例如通过与GLP-I肽一起另外施 用DPP-IV抑制剂，从而克服了半衰期较短的问题。另外将DPP-IV抑制剂与GLP-I肽一起 施用是复杂的，并且通常不会引起所期望的长期治疗，因为DPP-IV抑制剂可能仅在体外系 统中被有效地利用。因此，根据替代性的实施方式，由包埋在(球形)微囊的核中的细胞编码和分泌的 GLP-I肽可以选自GLP-I融合肽或其变体或片段。本文使用的GLP-I融合肽可由包埋在本 文定义的(球形)微囊的(球形)核中的细胞编码和分泌。在该情况下，在制备核之前通 常用编码GLP-I融合肽的核酸序列对本文定义的包埋在(球形)微囊的(球形)核中的细 胞进行转染，从而使这些细胞编码、表达和分泌GLP-I融合肽。
本文定义的GLP-I融合肽优选具有至少两个成分，例如成分(I)和(II)、成分(I) 和(III)或成分(I)、(II)和(III)，显示本文定义的GLP-I的生物活性，并且同时，通常通 过(所述)C末端延长赋予GLP-I融合肽的成分(I)以稳定性。本文定义的GLP-I融合肽的 成分(I)通常含有本文定义的GLP-I肽的序列，优选含有与SEQ ID NO 1具有至少80%、更 优选至少85%以及还更优选至少90%序列同一性的序列。SEQ ID NO :1表示GLP-I (7_37) (长度为31个氨基酸)的天然氨基酸序列，其在哺乳动物中是严格保守的。根据一个特别 优选实施方式，本文定义的GLP-I融合肽的成分(I)含有与SEQ ID NO :1相同的序列或SEQ ID NO 1的缺少第36和/或37位氨基酸的序列。可由包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形)核中的细胞编码和分泌的GLP-I 融合肽(或更通常的是包括融合肽的片段或变体在内的任何GLP-I肽)的成分(II)，通常 含有具有至少9个氨基酸的肽序列。GLP-I融合肽可以通常在其成分(II)中具有长度为 9 30个氨基酸，优选9 20个氨基酸，最优选9 15个氨基酸的序列。通常而言，可以 优选成分(II)中较短的序列，所述较短的序列与GLP受体的结合活性比较长的序列更高。 成分(II)的序列，即使其不是先决条件，可以优选是中性的或可以在PH7具有负电荷。另 外GLP-I融合肽的成分(II)可以在其序列中含有至少一个脯氨酸残基。脯氨酸残基是在 形成转角的四聚氨基酸序列内常见的氨基酸。因此，GLP-I融合肽的成分(II)可以形 成β-转角样结构。转角结构是蛋白质或肽的典型二级结构元件。其通常由连续的四 个氨基酸形成，使肽或蛋白质主链方向反向。如果GLP-I融合肽中存在脯氨酸残基的话，脯 氨酸残基通常位于在GLP-I融合肽的成分(II)中出现的四聚体转角序列基序的第2 位或第3位，优选位于第2位。可由包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形)核中的细胞编码和分泌的GLP-I 融合肽(或更通常的是包括融合肽的片段或变体在内的任何GLP-I肽)的成分(II)，可 以含有选自由以下序列基序组成的组中的序列基序VAIA、IAEE, PEEV, AEEV, EELG, AAAA, AAVA, AALG, DFPE, AADX, AXDX和XADX，其中X表示任何氨基酸(天然存在的氨基酸或经修 饰的非天然氨基酸)。这些四聚体基序可以位于成分(II)序列中的任何地方。在一个特 别优选的实施方式中，创造性的融合肽成分(II)是通过其N末端序列基序与成分(I)的C 末端连接的肽序列，所述N末端序列基序选自由AA、XA、AX、RR、RX和)(R组成的组中，其中 X表示任何氨基酸(天然存在的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸)。作为可由包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形)核中的细胞编码和分泌的 GLP-I融合肽的成分(II)，特别优选的是含有对应于人类或鼠类IP-2的部分序列的SEQ ID NO 48 =X1X1DFPX2X2X3X4序列的肽序列，其中各\通常相互独立地选自任何天然存在的氨基 酸，优选是精氨酸(R)或丙氨酸(A)，更优选是丙氨酸(A)，或可以不存在；其中各)(2通常相 互独立地选自天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，并且其中各)(3和)(4通常相互独立地选自任何天 然存在的氨基酸，优选是丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)或 缬氨酸(V)。)(4也可以不存在。作为可由包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形)核中的细胞编码和分泌 的GLP-I融合肽的成分(II)，还更优选的是含有SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI)、SEQ ID NO :27(DFPEEVAI)、SEQ ID NO :28 (RDFPEEVA)或 SEQ ID NO :29 (RRDFPEEV)、SEQ ID NO: 30 (AADFPEEVAI)、SEQ ID NO 31 (ADFPEEVA)或 SEQ ID NO 32 (AADFPEEV)序列(所有肽序列以单字母编码给出)，或与SEQ ID NO :22、27、28、四、30、31或32具有至少80%序列同一 性的序列的肽序列。SEQ ID N0:22是全长IP-2(插入肽2)序列的部分序列，其含有长度 为15个氨基酸的全长IP-2序列的10个N末端氨基酸。IP-2是本文使用的成分(II)的 优选实例。因此，在本文定义的GLP-I融合肽的成分(II)中含有的其它更优选的序列是 IP-2的更长的部分氨基酸序列，例如在人类中出现的14个N末端氨基酸序列(SEQ ID NO 23 (RRDFPEEVAIVEEL))或其鼠类对应物(SEQ ID NO :24 (RRDFPEEVAIAEEL))，或序列(SEQ ID NO :33(AADFPEEVAIVEEL))或(SEQ ID NO :34 (AADFPEEVAIAEEL))，或与 SEQ ID NO :23、24、 33或M具有至少80%序列同一性的序列。作为在GLP-I融合肽的成分(II)中含有的元 件，最优选的是具有天然存在的IP-2序列(SEQ ID N0:2(RRDFPEEVAIVEELG)，人类，或SEQ ID N0:3(RRDFPEEVAIAEELG)，鼠类，或 SEQ ID NO :35 (AADFPEEVAIVEELG)，或 SEQ ID NO: 36 (AADFPEEVAIAEELG))的所有15个氨基酸的全长IP-2序列或与SEQ ID N0:2、3、35或36 具有至少80%序列同一性的序列。在本发明范围内的还有IP2的所有哺乳动物同型(哺 乳动物中IP2的天然变体)。可以提供包括在成分(II)中的序列的多于1个拷贝，例如2 个、3个或更多个IP2的拷贝或者IP2的片段或变体。因此，本文定义的由包埋在(球形)微囊的(球形)核中的细胞编码和分泌的 GLP-I融合肽，优选含有、包含下述序列或由下述序列组成序列SEQ ID NO 8 (HAEGTFT SDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG)(即 GLP-1 (7-37)不使用任何连接物序列 经由其 C 末端与鼠类 IP2 连接)或 SEQ ID NO 12 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG RRDFPEEVAIVEELG)(即GLP-I (7-37)不使用任何连接物序列经由其C末端与人类IP2连 接)，或者序列 SEQ ID NO 37 (HAEGTFT SDVS SYLEGQAAKEFIAffLVKGRGAADFPEEVAIAEEL G)(即GLP-I (7-37)不使用任何连接物序列经由其C末端与IP2连接)或SEQ ID NO 38 (HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIVEELG)(即 GLP-1 (7-37)不使用任何 连接物序列经由其C末端与IP2连接)，或者序列SEQ ID NO 39 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK EFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIAEELG), SEQ ID NO 40(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDA AAAVAIAEELG)、SEQ ID NO 41(HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADAAAAVAIAAALG)、 SEQ ID NO. :42(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFP), SEQ ID NO 43 (HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVA),SEQ ID NO44(HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAffLVKGRGR RDFPEEVAIAEELGRRHAC), SEQ ID NO 45(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIVE ELG)、SEQ ID NO :46 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIVEELG)、SEQ ID NO 47 (HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRGMDAAAAVAIVMLG)或 SEQ ID NO 48 (HAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHAC)(即 GLP-1 (7-37)不使用任何连接物序列 经由其C末端与IP2序列的特定类似物或变体连接)。本文也可以使用与SEQ ID NO 8,12 和37 48，或者其片段或变体具有至少80%序列同一性的其变体或片段。该情况下的优 选GLPl-融合肽还可以包含SEQ ID NO 13、14、19和20的序列。不受任何理论限制，本发明的发明人推断，例如如果被包埋在本发明使用的植入 (球形)微囊的(球形)核中的细胞在体内分泌到患者周围组织中的GLP-I (7-35、36或37) 的不稳定性，是由于其不受保护的三维结构。在体内蛋白酶可以切割GLP-I (7-35、36或37) 肽并且快速消除其生理活性。通过将肽序列与GLP-l(7-35、36或37)的C末端连接，其结构 获得对酶促降解的稳定性。如果另外的C末端肽序列(包含在本发明的融合肽的成分(II)中)反折，例如由于通过其一级结构形成的β转角结构元件的存在而反折，则可以增强所 述稳定性的获得，并且为成分(II)提供刚性。发现本文定义的GLP-I融合肽，借助于其优 选含有β转角结构元件的C末端肽延长，对DPP-IV失活具有改善的抗性。在作用于靶细 胞中的其受体之前C末端肽不会被从GLP-I (7-35,36或37)序列切割，或C末端肽可以在 体内被酶促切割从而形成GLP-I (7-35,36或37)。与在GLP-I受体位置处结合的GLP-I肽 的确切形式无关，本文定义的GLP-I肽作为活性神经保护化合物发挥其作用。据认为由于 形成β转角元件的一级结构因而适用于本文定义的GLP-I融合肽的成分(II)的GLP-I肽 序列，可以通过适当的方法，例如光谱法(如圆二色性法)，或者本领域技术人员已知的其 它方法容易地进行鉴定。可由包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形)核中的细胞编码和分泌的GLP-I 融合肽的成分(II)和成分(I)，可以直接连接或经由连接序列连接。优选的是，两种成分直 接相互连接。在它们经由连接物(或间隔子)连接的情况下，连接物优选是肽连接物。肽 连接物通常具有的长度为1 10个氨基酸，优选为1 5个氨基酸，还更优选为1 3个 氨基酸，在某些情况下连接物序列可以甚至更长，包含11 50个氨基酸。肽连接物可由各 种(天然存在的)氨基酸序列组成。优选的是，肽连接物可以在要连接的成分之间引入某 些结构柔性。结构柔性例如通过使肽连接物含有各种甘氨酸或脯氨酸残基而实现，优选在 连接物序列内含有至少30%，更优选至少40%，还更优选至少60%脯氨酸和甘氨酸残基。 与具体序列无关，肽连接物可以优选不具有免疫活性。可由包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形)核的细胞编码和分泌的GLP-I融 合肽，可以另外含有成分(III)。通常而言，成分(III)包含至少4个氨基酸残基，优选至少 10个另外的氨基酸残基，更优选至少20个另外的氨基酸残基，或最优选至少30个另外的氨 基酸残基。在功能方面，成分(III)旨在进一步增强本文定义的GLP-I肽的稳定性。期望 成分(III)不干扰与GLP-I (7-37)的生物活性大约相当的GLP-I融合肽的生物功能。通常 而言，本文定义的成分(I)的任何C末端延长，无论其是成分(II)、成分(III)或本文定义 的成分(II)和成分(III)的组合，均可增强成分(I)(即本文定义的GLP-I肽，例如本文定 义的GLP-I (7-35,36或37)，或其片段或变体)的稳定性。优选的是，本文定义的GLP-I融合肽的成分(III)，包含任何哺乳动物生物体的 GLP-2同型(哺乳动物中GLP-2的其它天然存在的变体)(例如SEQ ID NO 4和5中所示 的鼠类或人类同型)的N末端序列的至少4个另外的氨基酸残基，优选至少10个另外的氨 基酸残基，更优选至少20个另外的氨基酸残基。GLP-2出现在原胰高血糖素中，并且还参 与碳水化合物代谢。在本发明的情况下，术语“GLP-2肽”优选表示GLP-2 (1-33,34或35)， 而“经修饰的GLP-2肽”旨在表示任何GLP-2片段或变体，或GLP-2 (1-33,34或35)的片段 或变体。将变体或片段归类为对例如GLP-2(l-33、34或3 等未经修饰序列进行修饰。与 成分⑴(GLP-1肽)中包括的生物活性序列一样，成分(III)也可以包含GLP-2的天然存 在形式的变体或片段。作为选择，成分(III)还可以包含GLP-I (7-37)的(N末端)序列的 至少4个、至少10个、更优选至少20个另外的氨基酸残基，相应地包括所有的哺乳动物同 型或-本文定义的-其所有功能片段或变体。通常而言，成分(III)可以含有本文所述适 合于GLP-I融合肽的成分(I)的GLP-I肽或经修饰GLP-I肽的任何形式。在另一替代性 方案中，成分(III)还可以含有GLP-I (7-37)和GLP-2的嵌合形式。通过使GLP-I (7_37)
24和GLP-2 (或片段或变体)相互偶联可以制得嵌合形式，并且随后将该嵌合形式作为成分 (III)导入GLP-I融合肽。优选的是，嵌合形式由连接在一起的GLP-I (7-37)的部分序列 和GLP-2的部分序列组成。例如，嵌合形式可以包括GLP-I的N末端的5 30个氨基酸和 GLP-2的C末端的5 30个氨基酸，或者反之亦然，例如GLP-I (7-37)的第7或8位 22、 23、24、25、26、27 或 28 位氨基酸和从 GLP-2 的第 15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 位氨 基酸 例如C末端的氨基酸序列。如果包含对GLP-2或GLP-I (7-37)的天然存在形式分别 进行的修饰物作为成分(III)，则成分(III)优选分别含有序列SEQ ID N0:l、4或5，或与 SEQ ID NO :1、4或5中任一序列具有至少80%序列同一性的序列。在另一实施方式中，可由包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形)核中的细胞 编码和分泌的GLP-I融合肽的成分(III)，可以含有本文对成分(I)、(II)或(III)所述的 多个序列。例如，成分(III)可以含有GLP-I (7-37)和/或GLP-2的至少2个，优选2个、 3个或4个拷贝或者与SEQ ID NO :1、4或5具有至少80%序列同一性的序列的至少2个拷 贝。同样，成分(III)可以含有本文所述的GLP-I (7-37)或GLP-2的嵌合版本的多于一个 拷贝，例如最后与GLP-I (7-37)和/或GLP-2或具有至少80%序列同一性的其修饰产物一 起形成嵌合版本的组合。可由包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形)核中的细胞编码 和分泌的GLP-I融合肽，还可以包含两种以上，优选两种的成分(III)，所述成分(III)可以 例如(1)通过其N末端连接至成分(I)或(II)的C末端，和( 通过其C末端经由连接物 或直接连接至成分(I)的N末端。如果提供两种成分(III)，它们可以相同或不同。根据一个优选实施方式，由本文定义的包埋在(球形)微囊的(球形)核中的细胞 编码和分泌的GLP-I融合肽，可以包含本文定义的成分(I)、(II)和(III)。含有所有这些成 分的具体实施方式
优选选自由以下序列组成的组中SEQ ID N0:6(N-GLP-l(7-37)-IP2(鼠 类)-RR-GLP-I (7-37) -C,本文还命名为鼠类 CMl)、SEQ ID NO 7 (N-GLP-1 (7-37) -IP2 (鼠 类)-RR-GLP2-C,本文还命名为鼠类 CM2)、SEQ ID NO 10 (N—GLP—1 (7—37)-IP2 (人 类)-RR-GLP-I (7-37) -C，还命名为人类 CMl)和 SEQ ID NO 11 (N-GLP-1 (7-37) -IP2 (人 类)-RR-GLP-2-C)，本文还命名为人类CM2)或与SEQ ID NO :6、7、10或11或者它们的片段 或变体具有至少80%序列同一性的序列。在(紧接的)上述序列中术语“N”和“C”表示 这些融合肽的N末端和C末端。SEQ ID NO :6、7、10和11的所有序列在IP2的C末端处含 有RR-连接物(两个精氨酸残基)(成分(II))，作为选择其也可以被丢弃。SEQ ID NO :6、 7、10或11的实施方式的每一个中的成分(I)是GLP-I (7-37)，而成分(111)(在这些实施 方式的每一个中与成分(II)的C末端连接)是GLP-I (7-37)或GLP-2。在该情况下优选的 GLPl-融合肽还可以包含SEQ ID NO 15、16、17、18和洸的序列。在本发明的另一优选实施方式中，可由本文定义的包埋在(球形)微囊的(球形) 核中的细胞编码和分泌的GLP-I融合肽，除了含有成分(I)之外，还含有与成分(I)的C末 端连接和/或与成分(I)的N末端连接的成分(III)(没有任何本文定义的成分(II))。优 选的是，成分(III)位于成分⑴的C末端。与成分(III)是否(通过其C末端)连接至 成分(I)的N末端或(通过其N末端)连接至成分(I)的C末端无关，偶联可以是直接进 行或是经由连接物序列间接进行。关于连接物序列，对于此处公开的GLP-I融合肽而言其 是指连接GLP-I融合肽的成分⑴和成分(II)的连接物。在本发明的替代性优选实施方式中，可由本文定义的包埋在(球形)微囊的(球形)核中的细胞编码和分泌的GLP-I融合肽，除了含有成分(I)和(II)之外，还含有与成 分(II)的C末端连接和/或与成分⑴的N末端连接的成分(III)。优选的是，成分(III) 位于成分(II)的C末端。与成分(III)是否(通过其C末端)连接至成分(I)的N末端 或(通过其N末端)连接至成分(II)的C末端无关，偶联可以是直接进行或是经由连接物 序列间接进行。关于连接物序列，对于此处公开的GLP-I融合肽而言其也是指连接GLP-I 融合肽的成分⑴和成分(II)的连接物。可由本发明使用的包埋在(球形)微囊的(球形)核中的细胞编码和分泌的GLP-I 融合肽，除了含有融合肽的成分的任何上述组合(即成分⑴和(II)、成分⑴和(III)或 者成分(I)、(II)和(III))之外，还可以包含作为成分(IV)的载体蛋白，特别是转铁蛋白 或白蛋白。所述成分(IV)可以与GLP-I融合肽的成分的任何上述组合(即，成分⑴和/ 或(II)、成分⑴和/或(III)或者成分(I)、(II)和/或(III))的N末端和/或C末端 直接连接或使用本文定义的连接物连接。在本发明的具体实施方式
中，可由本文使用的包埋在(球形)微囊的(球形)核 中的细胞编码和分泌的本文定义的GLP-I (融合)肽，即以上定义的GLP-I肽或GLP-I融合 肽，含有作为成分(I)和/或(III)的经修饰GLP-I肽，所述经修饰GLP-I肽包含以下式II 的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Gl u-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36_Xaa37,其中)(aa7是 L-组氨酸；)(aa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、Ile 或 Lys，由此特别优选Gly ； Xaa 16 是 Val 或 Leu ；Xaal8 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ； Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys> Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或酰胺或不存在；Xaa37 是 Gly、 Ala、GlU、ftx)、LyS、酰胺或不存在，其中，当治疗本文定义的AMI或MI或者与它们相关的疾 病时，如果本文定义的GLP-I (融合)肽由包埋在本文使用的(球形)微囊的(球形)核中 的细胞编码和分泌的话，优先选择这些氨基酸对有需要的患者施用，或其中)(aa7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、3-羟 基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、N_乙酰基-组氨酸、α -氟甲基-组氨酸、α -甲 基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸是Ala、Gly、Val、 Leu、lie、Lys、Aib、(1_氨基环丙基)羧酸、(1_氨基环丁基)羧酸、(1_氨基环戊基)羧 酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸，由此特别优选 Gly ；Xaal6 是 Val 或 Leu ；Xaal8 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly,Glu 或 Aib ；Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly 或 Aib ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或酰胺或不存在； Xaa37是Gly、Ala、Glu、ftx)、LyS、酰胺或不存在，其中，当治疗本文定义的AMI或MI或者与 它们相关的疾病时，如果直接对有需要的患者提供本文定义的GLP-I (融合)肽的话，优先 选择这些氨基酸。
在本发明的另一具体实施方式
中，由包埋在本文的(球形)微囊的(球形)核中 的细胞编码和分泌的本文定义的GLP-I (融合)肽(即以上定义的GLP-I肽或GLP-I融合 肽)的成分(I)和/或(III)，含有经修饰GLP-I肽，所述经修饰GLP-I肽包含以下式III 的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22 -Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly, Val, Leu、lie、Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或不 存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或不存在，其中，当治疗本文定义的AMI或MI或 者与它们相关的疾病时，如果本文定义的GLP-I (融合)肽由包埋在本文使用的(球形)微 囊的(球形)核中的细胞编码和分泌的话，优先选择这些氨基酸对有需要的患者施用，或其中)(aa7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、-羟 基-组氨酸、高组氨酸、N-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α -甲基-组氨酸、3-吡 啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、 Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己 基)羧酸、(I-氨基环庚基)羧酸或(I-氨基环辛基)羧酸；1胁18是^^、1^8或Arg ；Xaa22 是 Gly、Glu 或 Aib ；Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、 Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly 或 Aib ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或不 存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或不存在，其中，当治疗本文定义的AMI或MI或 者与它们相关的疾病时，如果对有需要的患者直接提供本文定义的GLP-I (融合)肽的话， 优先选择这些氨基酸。在一个特别优选的实施方式中，使用可由包埋在本文使用的(球形)微囊的(球 形)核中的细胞编码和分泌的GLP-I (融合)肽，即以上定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽， 其中成分⑴和/或(III)含有(经修饰的)GLP-I肽，所述(经修饰的)GLP-I肽选自 GLP-I (7-35)、GLP-I (7-36)、GLP-I (7-36)-酰胺、GLP-I (7-37)或者它们的变体、类似物或 衍生物。还优选的是在其成分(I)和/或(III)中包含经修饰GLP-I肽的GLP-I (融合) 肽，所述经修饰GLP-I肽在所述GLP-I肽的第8位具有Aib残基或在所述GLP-I肽的第7位 具有选自由以下氨基酸组成的组中的氨基酸残基D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组 氨酸、羟基-组氨酸、高组氨酸、N-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨 酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸，这在治疗本文定义的AMI或MI 或者与它们相关的疾病时，如果对有需要的患者直接提供本文定义的GLP-I (融合)肽的 话，是优选的。在另一特别优选的实施方式中，使用可由包埋在本文使用的(球形)微囊的(球 形)核中的细胞编码和分泌的GLP-I (融合)肽，即以上定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽， 其中由式II和III表示的本文定义的的GLP-I (融合)肽的成分⑴和/或(III)的两种 实施方式可以与GLP-I (融合)肽的此处给出的公开内容组合。换言之，通式II和III可 以例如与成分(II)、连接物、制造方法等的此处给出的公开内容组合。优选使本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，优选本文定义的GLP-I融合肽的成分(I)以及其片段或变体，针对本文所述的蛋白水解性切割，更优选针对DPP-IV受到保护。 因此，本文定义的所述GLP-I肽或GLP-I融合肽以及其片段或变体，特别是GLP-I融合肽， 可以含有对DPP-IV具有抗性的GLP-I的序列，例如GLP-I (7-35,36或37)(在GLP-I融合 肽的情况下作为成分(I)和/或(III)的一部分)。在该情况下，肽对二肽基氨基肽酶IV 降解的抗性可以例如通过以下降解检验而确定使等分试样的肽在37°C下与等分试样的 经纯化的二肽基氨基肽酶IV在pH为7 8的合适缓冲液(缓冲剂不是白蛋白)中一起温 育4 22小时。通过添加三氟乙酸终止酶促反应，使用HPLC或LC-MS分析分离肽降解产物 并进行定量。进行该分析的一种方法是将混合物施加到hrbaX300SB-C18 (30nm孔，5 μ m 颗粒)150X2. Imm的柱上，并以0. 5ml/分钟的流速使用线性梯度的乙腈在0. 三氟乙酸 中的溶液洗脱(0% 100%乙腈，超过30分钟)。肽和其降解产物可以通过其在214nm(肽 键)或^Onm (芳香族氨基酸)处的吸光度进行监测，并通过其峰面积的积分进行定量。通 过使用其中可以确定分离峰的MS光谱的LC-MS，可以确定降解模式。使用在给定时间时完 整化合物/降解化合物的百分比来评估肽的DPP-IV的稳定性。在本文情况下，基于在给定时间时的百分比完整化合物，当比GLP-I (7-37)的未 经修饰的肽序列稳定10倍以上时，将本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，优选本文定义 的GLP-I融合肽的成分(I)，以及它们的片段和/或变体，定义为对DPP-IV具有稳定性。因 此，对DPP-IV稳定的GLP-I肽或GLP-I融合肽，优选本文定义的GLP-I融合肽的成分(I)， 优选比例如GLP-I (7-37)稳定至少10倍，更优选至少20倍。稳定性可以通过任何对本领域 技术人员而言已知的方法进行评估，例如通过向待测试的肽溶液中添加DPP-IV，并通过利 用例如光谱法、蛋白质印迹分析、抗体筛选等确定例如一段时间的肽(参见本文)的降解。并行地，将本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，优选GLP-I融合肽的成分(I)， 以及它们的片段和/或变体定义为通过例如与其天然受体(GLP-1受体)结合而发挥 GLP-I (7-37)作用的化合物。优选的是，本文定义的GLP-I (融合)肽或GLP-I融合肽，以 及它们的片段和/或变体对GLP-I受体具有结合亲和性，该结合亲和性相当于天然存在的 GLP-I肽的结合亲和性的至少10%，优选至少50%。可以通过任何合适的方法，例如表面等 离子共振等确定结合亲和性。另外，如果本文定义的GLP-I (融合)肽或GLP-I融合肽，以 及它们的片段和/或变体通过其与胞外受体的结合(该结合将信号传递到细胞)引起胞内 cAMP的形成，则其是优选的。根据另一优选实施方式，GLP-I肽或GLP-I融合肽(优选本文定义的GLP-I肽或 GLP-I融合肽)、以及GLP-I融合肽的单独成分(特别是成分(I)、(II)和(III))和/或 本文所述的完整GLP-I融合肽，可以选自这些肽或蛋白序列的修饰形式。各种修饰形式，特 别是本文所述的完整GLP-I融合肽的修饰形式，可以由包埋在本文使用的(球形)微囊的 (球形)核中的细胞编码和分泌，或者可以直接用于治疗AMI或MI或者与它们相关的疾病。 这些修饰形式在下文中公开且进行了更详细的描述，并且包括例如GLP-I肽(优选本文定 义的GLP-I肽)的片段、变体等，或者GLP-I融合肽的单独成分(特别是成分(I)、(II)和 (III))的片段、变体等和/或本文所述的完整GLP-I融合肽的片段、变体等。在该情况下， 这些肽或蛋白质的片段和/或变体与其天然肽或蛋白质在天然的未经修饰氨基酸序列的 全长上可以具有至少40%、50%、60%、70%、80%、优选至少90%、更优选至少95%和最优 选至少99%的序列同一性。这类似地可适用到各(编码)核酸序列上。
本文定义的术语“序列同一性”通常是指对序列进行如下比较。为了确定两个氨 基酸序列的百分比同一性，出于进行最佳比较的目的可以对序列进行比对(例如，可以在 第一个氨基酸序列的序列中引入空位)。然后可以比较相应氨基酸位置处的氨基酸。当占 据第一序列中一个位置的氨基酸与第二序列中的相应位置的氨基酸相同时，则所述分子在 该位置处是相同的。两个序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数量的 函数，例如当称一个特定肽与规定长度的参照多肽具有特定的百分比同一性时，百分比同 一性是与参照肽有关。因此，与长度为100个氨基酸的参照多肽具有50%同一性的肽可以 是与参照多肽的50个氨基酸长的部分完全相同的50个氨基酸的多肽。其也可以是长度为 100个氨基酸的多肽，在其全长上与参照多肽具有50%同一性。当然，其它多肽会满足相同 的标准。两个序列的百分比同一性的所述确定可以使用数学算法来实现。用于比较两个序 列的数学算法的优选的非限制性实例是Karlin等(1993)，PNAS USA, 90 :5873-5877的算 法。所述算法被引入NBLAST程序中，该程序可以用于鉴定与本发明的氨基酸序列具有所需 同一性的序列。为了获得用于比较目的的空位算法，可以利用Altschul等(1997)，NUCleiC Acids Res，25 :3389-3402 中所述的 Gapped BLAST。当利用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序 时，可以使用各程序(例如，NBLAST)的默认参数。还可以使用第9版Genetic Computing Group' s GAP (全局比对程序)，使用默认(BL0SUM62)矩阵(值_4 +11)，空位开端罚分 为-12(对于空位的第一空值)和空位延伸罚分为-4(每在空位中的各增加的连续空值)， 从而对所述序列进行进一步比对。比对后，通过将匹配数表达为要求保护序列中氨基酸数 量的百分比，从而计算百分比同一性。确定两个氨基酸序列的百分比同一性的所述方法可 以相应地应用到核酸序列上。在本发明的情况下，使用术语“同一性”，但是，如果需要或期 望的话，还可以用术语“同源性”来代替术语“同一性”。在本发明的情况下，GLP-I肽(优选本文定义的GLP-I肽)的“片段”、或GLP-I融 合肽的单独成分(特别是成分(I)、(II)和(III))的“片段”和/或本文所述的完整GLP-I 融合肽的“片段”，通常是指这些肽或蛋白质的任何片段。通常而言，所述片段包含保留所 需生物活性、特别是天然肽或蛋白质的所需生物活性的较短的肽，在其氨基酸序列(或其 编码核酸序列)方面，该较短的肽与天然肽或蛋白质(或其编码核酸序列)相比是N末端、 C末端和/或序列内截短的。因此所述截短可以发生在氨基酸水平或相应地发生在核酸水 平。通过从肽分子的任一端除去氨基酸(在肽水平或氨基酸水平上)和测试所得肽或蛋白 质具有的GLP-I的本文定义的生物性质，可以容易地鉴定生物功能片段。用于从天然肽或 蛋白质的N末端和/或C末端一次除去一个或多个氨基酸的蛋白酶，可用于确定保留所需 生物活性的片段。总的来说，片段可由在肽末端的氨基酸和/或位于肽序列内的氨基酸的 缺失引起。另外，GLP-I肽(优选本文定义的GLP-I肽)的“变体”、或GLP-I融合肽的单独 成分(特别是成分(I)、(II)和(III))的“变体”和/或本文所述的完整GLP-I融合肽的 “变体”，优选包含蛋白质序列或其编码核酸序列(或其片段)，其中所述天然蛋白质或肽序 列的氨基酸发生更换。由此，可以产生GLP-I肽(优选本文定义的GLP-I肽)(的变体)， 或GLP-I融合肽的单独成分(特别是成分(I)、(II)和(111))(的变体)和/或本文所述 的完整GLP-I融合肽(的变体)，其具有的氨基酸序列与天然蛋白质或肽序列的不同之处在 于一个或多个突变，例如一个或多个取代的、插入的和/或缺失的氨基酸。优选的是，如果这些变体是GLP-I的变体、GLP-I融合肽自身或者它们的功能性变体和/或片段，则具有与 GLP-I基本相同或改善的本文定义的生物活性，即对于GLP-I已知的有益效果，例如与全长 GLP-I肽、GLP-I融合肽或GLP-I融合肽的全长单独成分，特别是成分⑴、(II)和(III)相 比，其强烈减少由心脏组织的缺血或或缺氧引起的损伤和可能的死亡的活性。本文定义的所述变体可以通过在编码所合成变体的DNA序列上进行突变而制备。 在由包埋在本文定义的(球形)微囊中的细胞编码和分泌的GLP-I肽中还可以含有缺失、 插入和取代的任何组合，条件是最终获得的变体拥有所需生物活性。显然，在编码变体肽 的DNA中进行的突变必须不改变阅读框，并且优选不会形成能够产生二级mRNA结构的互补 区。因此，GLP-I肽(优选本文定义的GLP-I肽)的变体、GLP-I融合肽的变体，GLP-I 融合肽的单独成分(特别是成分(I)、(II)和(III))的变体和/或本文所述的完整GLP-I 融合肽的变体，与本文所述的天然GLP-I肽或天然GLP-I融合肽相比也可以含有侧接在氨 基酸序列的N末端或C末端或甚至两个末端的另外的氨基酸残基。举例而言，所述变体可 以包含本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，所述GLP-I肽或GLP-I融合肽含有与GLP-I 肽或GLP-I融合肽的氨基酸序列的N末端或C末端或甚至两个末端侧接的另外的氨基酸残 基。只要所得的GLP-I肽或GLP-I融合肽保留其对蛋白酶的抗性或稳定性和如本文定义 那样起作用的能力，则可以通过常规实验确定任何所述侧接残基是否影响“核心”肽的基本 特性，例如GLP-I已知的其有益效果。当提及指定的本文定义的GLP-I肽时，术语“基本上
由......组成”是指可以存在不影响指定GLP-I肽的基本特性的另外的侧接残基。该术语
通常不理解为在指定序列内进行取代、缺失或添加。GLP-I肽(优选本文定义的GLP-I肽)的“变体”、GLP-I融合肽的“变体”、GLP-I融 合肽的单独成分(特别是成分(I)、(II)和(III))的“变体”和/或本文所述的完整GLP-I 融合肽的“变体”，还可以指与其天然序列相比包含保守性氨基酸取代的分子。其中源自相 同类型的氨基酸相互交换的取代称为保守性取代。特别地，这些是具有脂肪族侧链、带正电 或带负电侧链、侧链中具有芳香基团的氨基酸或者是其侧链(例如具有羟基官能的侧链) 可以进入氢桥的氨基酸。这意味着例如具有极性侧链的氨基酸被另一具有类似极性侧链的 氨基酸置换，或例如，特征在于疏水性侧链的氨基酸被另一具有类似疏水性侧链的氨基酸 取代。可以进行插入和取代，特别是在对三维结构不引起改变或不影响结合区域的那些序 列位置处的插入和取代。插入或缺失对三维结构引起的改变可以使用CD谱(圆二色性谱) 容易地石角定(Urry，1985，Absorption，Circular Dichroism and ORD of Polypeptides，在 Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger 等(ed.)，Elsevier, Amsterdam 中)。因此GLP-I肽(优选本文定义的GLP-I肽)的变体、GLP-1融合肽的变体、或GLP-I 融合肽的单独成分(特别是成分(I)、(II)和(III))的变体和/或本文所述的完整GLP-I 融合肽的变体，还可以指与完整GLP-I肽(优选本文定义的完整GLP-I肽)、完整GLP-I融 合肽、或者GLP-I融合肽的单独成分(特别是成分(I)、(II)和(III))，或者其片段基本上 类似的分子。所述变体肽可以使用本领域公知的方法常规制备。当然，所述变体会具有对 于天然GLP-I肽(优选本文定义的GLP-I肽)、GLP-I融合肽、或GLP-I融合肽的单独成分 (特别是成分⑴、(II)和(III))和/或本文所述的完整GLP-I融合肽而言已知的类似有益效果。例如对于GLP-I而言，所述有益效果是与相应的天然存在的GLP-I肽一样，强烈减 少由缺血或缺氧引起的损伤和心脏组织的可能死亡的活性。可以在GLP-I肽(优选本文定义的GLP-I肽)的变体、GLP-I融合肽的变体、或 GLP-I融合肽的单独成分(特别是成分(I)、(II)和(III))的变体和/或本文所述的完整 GLP-I融合肽的变体中含有的保守性氨基酸取代的种类，可以基于对不同物种的同源性蛋 白质/肽之间氨基酸改变的频率进行的分析。基于所述分析，保守性取代可以在此处定义 为在以下5组中任一组内的交换I.小型、脂肪族、非极性或轻微极性的残基:Ala、Ser、Thr、Pr0、Gly ；II.极性、带负电的残基和其酰胺ASp、ASn、Glu、Gln ；III.极性、带正电的残基:His, Arg, Lys ；IV.大型，脂肪族非极性残基Met、Leu、lie、Val、Cys ；￥.大型芳香族残基斤1^、1^7、1^)。上述各组内，认为以下取代是“高度保守性的” :Asp/Glu ；His/Arg/Lys ；Phe/Tyr/ Trp Met/Leu/Ile/Val。将半保守性取代定义为此处组(I)-(IV)中两组之间的交换，可 将其限定于包含此处(I)、(II)和(III)的超组(A)，或限定于包含此处(IV)和(V)的超 组(B)。取代不限于遗传编码的氨基酸或甚至天然存在的氨基酸。在本文意义内的同义 (synonymous)氨基酸残基的优选组的优选的保守性氨基酸取代特别包括，但不限于以下
0128]氨基酸同义残某0129]SerSer,Thr, Gly, Asn0130]ArgArg,Gin, Lys, Glu, His0131]Leulie,Phe, Tyr, Met, Val, Leu0132]ProGly,Ala, (Thr)，Pro0133]ThrPro,Ser, Ala, Gly, His, Gin,Thr0134]AlaGly,Thr, Pro, Ala0135]ValMet,Tyr, Phe, lie, Leu, Val0136]GlyAla,(Thr), Pro, Ser, Gly0137]IleMet,Tyr,Phe, Val, Leu, lie0138]PheTrp,Met,Tyr, lie, Val, Leu,Phe0139]TyrTrp,Met,Phe, lie, Val, Leu,Tyr0140]CysSer,Thr,Cys0141]HisGlu,Lys,Gin, Thr, Arg, His0142]GlnGlu,Lys,Asn, His, (Thr), Arg, Gln0143]AsnGin,Asp,Ser, Asn0144]LysGlu,Gin,His, Arg, Lys0145]AspGlu,Asn,Asp0146]GluAsp,Lys,Asn, Gin, His, Arg, Glu0147]MetPhe，lie,Val, Leu, Met0148]TrpTrp0149]另外，GLP-I肽(优选本文定义的GLP-I肽)的变体、GLP-I融合肽的变体、或GLP
31融合肽的单独成分(特别是成分(I)、(II)和(III))的变体和/或本文所述的完整GLP-I 融合肽的变体，还可以含有例如旨在改善溶解性而进行的氨基酸取代(用亲水性氨基酸置 换疏水性氨基酸)。在一个特别优选的实施方式中，可由包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形) 核中的细胞编码和分泌的本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，包括特征在于在GLP-I 肽的第 7、8、11、12、16、22、23、M、25、27、30、33、34、35、36 或 37 位具有一个或多个取代的 GLP-I肽(存在于GLP-I融合肽的成分⑴和/或(III)中)。作为以下命名的一个实 例，[Arg34-GLP-1 (7-37)]命名了其中在第34位处的其天然存在的赖氨酸被精氨酸取代的 GLP-I类似物。具体地，本文定义的GLP-I肽或者GLP-I融合肽的成分⑴和/ 或(III)可以对应于GLP-I (7-35、36、37或38)的变体，该变体包括，例 如 Gln9-GLP-1(7-37)、Thrl6-Lysl8-GLP-1(7-37)禾口 Lys18-GLP — 1(7 — 37)、 Arg34-GLP-1(7-37)、Lys38-Arg26-GLP_1(7-38)-OH、Lys36-Arg26-GLP_1 (7-36)、 Arg26,34-Lys38-GLP-l (7-38) , Arg26,34-Lys38-GLP-1(7-38) , Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、 Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38)、Arg26-Lys38-GLP_1 (7-38)、Arg34-Lys38-GLP_1 (7-38)、 Ala37-Lys38-GLP-l(7-38)和 Lys37-GLP_1 (7-37)。更通常而言，本文提及的任何 GLP-I 变 体(特别是根据式II或III)可以通过在第38位处添加Lys残基而进行修饰。如果将本文所述的GLP-I肽或GLP-I融合肽直接施用以治疗AMI或MI或者与 它们相关的疾病，本文定义的GLP-I肽或者GLP-I融合肽的成分⑴和/或(III)可 以另外地对应于GLP-I (7-35、36、37或38)的变体，所述变体包括Gln9_GLP_l (7-37)、 D-Gln9-GLP-1 (7-37)、乙酰基-Lys9_GLP_l (7-37)。在本发明一个特别优选的实施方式中，本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽(关 于成分⑴或(III))是/含有(经修饰的)GLP-I肽，所述(经修饰的)GLP-I肽选自 GLP-I (7-35)、GLP-I (7-36)、GLP-I (7-36)-酰胺、GLP-I (7-37)或它们的片段或变体。出于体外控制的目的，本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽可以例如使用常规分 离技术从表达其的细胞分离(并进而从微囊分离)。因而细胞可以在合适条件下体外生长， 例如包括支持体和营养物，并且如果分泌蛋白(即本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，或 者它们的片段或变体)由包埋在(球形)微囊的(球形)核中的细胞编码和分泌的话，则 从胞外培养基中进行回收。因此为了转染到细胞中而工程化的(载体)序列优选包括允许 本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽分泌的信号(肽)序列(参见以下)。在该情况下，本 文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，或者它们的片段或变体如果由包埋在(球形)微囊的 (球形)核中的细胞编码和分泌的话，则可以将其与信号序列天然内源性地融合或在将编 码核酸序列通过基因工程方法转染导入细胞之后与信号序列融合。在替代性方案中，编码 本文定义的GLP-I肽的工程化基因序列不包括所述信号肽序列，由此胞内表达的GLP-I肽 或GLP-I融合肽通常不分泌，并且可以通过涉及细胞裂解的方法从细胞中回收。在所述方 法中，编码序列可以包括允许从培养基中有效提取产物肽的纯化标签，标签可以被切割下 从而释放分离的GLP-I肽。但是，该替代性方案通常与本发明使用的(球形)微囊的细胞 无关，本发明使用的(球形)微囊的细胞被植入患者中并且需要将体内表达和分泌的本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽递送到周围组织中。如果不另外指出，任何本文所述的实施方式或特征可以相互组合。包埋在本发明使用的(球形)微囊的(球形)核中的细胞优选编码和分泌本文定 义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，以及可选的另外的因子，例如本文定义的抗凋亡剂、VEGF等。 为此目的，本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽或者它们的片段或变体以及还有另外的因 子，由至少一种核酸序列编码，所述至少一种核酸序列在制备(球形)微囊的(球形)核之 前通常转染到细胞中。这些核酸序列可以在细胞中天然存在或可以在制备(球形)微囊之 前通过细胞转染技术导入细胞中。根据本发明，可以使用编码本文定义的GLP-I肽的任何 合适的核酸序列。根据一个实施方式，编码本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽、或者它们的片段 或变体，以及可选的另外的因子(例如本文定义的抗凋亡剂、VEGF等)的核酸序列，可以选 自任何核酸，更优选选自适于编码(至少一种)肽或蛋白质的任何核酸，即编码核酸，例如 选自例如基因组DNA、cDNA、DNA寡核苷酸等的编码DNA，或选自例如(短)RNA寡核苷酸、信 使RNA(mRNA)等的编码RNA，等等。在本发明的情况下，mRNA通常是由几种结构元件组成的 RNA，所述结构元件例如有可选的5’ -UTR区、后面是编码区的上游定位核糖体结合位点、可 选的3’-UTR区、其后可以是聚A尾(和/或聚C-尾)。mRNA可以作为单顺反子、双顺反子 或甚至多顺反子RNA，即携带一个、两个或多个本文所述的蛋白质或肽的编码序列的RNA存 在。s双顺反子或甚至多顺反子mRNA中的所述编码序列可以被至少一个IRES序列分隔开。 所述至少一种核酸序列还可以是核糖体RNA (rRNA)、转移RNA (tRNA)或病毒RNA (vRNA)。另 外，所述至少一种核酸序列可以是环形或线性核酸，优选是线性核酸。另外，所述至少一种 核酸序列可以是单链或双链核酸序列(其也可以视为由于两个单链核酸之间的非共价连 接产生的本发明意义内的核酸)或者部分双链或部分单链核酸，其至少部分自体互补(这 些部分双链核酸或部分单链核酸通常均由较长单链核酸和较短单链核酸形成或由两个长 度上近似相等的单链核酸形成，其中一个单链核酸与另一个单链核酸部分互补，由此二者 在该区域形成双链核酸，即部分双链或部分单链核酸)。由于遗传编码的简并性，多种核酸序列可以编码本文定义的这种GLP-I肽或 GLP-I融合肽，以及可选的另外的因子，例如本文定义的抗凋亡剂、VEGF等。根据本发明的 优选实施方式，用于转染本文定义的细胞的核酸序列可以包含编码本文定义的GLP-I肽或 GLP-I融合肽的任何核酸序列和另外的(功能性)核苷酸序列。本发明优选适于转染本文 定义的细胞的核酸序列，其可以编码(a)本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，特别是编码 完整GLP-I氨基酸序列(GLP-1 (1-37)或功能性GLP-I (7-35,36或37)(变体)序列或者任 何其它GLP-I肽，包括本文定义的GLP-I融合肽，(b)可选地编码位于(a)所述的GLP-I序 列的N末端处的蛋白酶切割序列，以及可选的编码(b)上游的信号肽序列，以及(c)可选的 编码本文所述的另外的因子。优选的是，信号(肽)序列选自如下定义的序列。因此，所得 的氨基酸序列可由(优选从N末端至C末端)信号肽序列、可选的蛋白酶切割序列和本文 定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽、或者它们的片段或变体(和可选的另外的因子，例如本文 定义的抗凋亡剂、VEGF等)组成。由此，信号肽序列和蛋白酶切割序列优选与宿主细胞(中 天然存在的序列)是异源性的，并且在本文定义的GLP-l(5-37、6-37或7-37)及其变体的 情况下，优选不同之处在于在此处附带条件的定义内的天然GLP-I的第1 6位氨基酸。
本文定义的核酸序列可以包含在载体中。因此，包埋在本发明使用的(球形)微 囊的(球形)核中的细胞可以含有包含之前本文定义的核酸的载体。该载体可用于转染本 文定义的细胞以制备本发明使用的(球形)微囊。通常而言，所述载体，特别是表达载体， 含有至少一个编码元件(a)和可选的本文所述的(b)和/或(c)的本文限定的核酸序列， 和本文所述的另外的元件(需要时)，例如适于指导编码元件(a)和可选的本文所述的(b) 和/或(c)表达的元件，以及可选的编码诸如抗凋亡因子VEGF等另外的因子的序列。本文 使用的一类载体利用提供源自动物病毒(例如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或SV40 等)的自主复制染色体外质粒的DNA元件。本文使用的第二类载体依赖于所需基因序列在 宿主细胞染色体中的整合。适于在将细胞包埋在本发明使用的(球形)微囊的(球形)核中之前转染细胞的 所述载体，通常通过将编码元件(a)和可选的本文所述的(b)和/或(c)(例如本文定义的 GLP-I肽或GLP-I融合肽或者它们的片段或变体，以及可选的本文定义的另外的因子)的至 少一种核酸序列插入到合适的(空)载体中而制备。所述合适的(空)载体对本领域技术 人员而言是已知的并且可以例如在“Cloning Vectors”(Eds. Pouwels P. H.等Elsevier， Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN O 444 904018)中回顾。合适的(空)载体还旨 在包括本领域技术人员已知的任何载体，例如质粒、噬菌体、诸如SV40、CMV、杆状病毒、腺病 毒、辛德毕斯病毒等病毒、转座子、IS-元件、噬粒(phasmid)、噬菌粒(phagemide)、粘粒、线 性DNA或环状DNA。为了在哺乳动物细胞中整合，通常使用线性DNA。优选的是，用于本发 明的载体类型符合特定的宿主细胞要求。可以在其中插入创造性的核酸序列和/或载体的 合适的市售表达载体，包括pSPORT、pBluescriptIISK、杆状病毒表达载体pBlueBac和原核 表达载体pcDNAII，所有这些都可以获自hvitrogen Corp. , San Diego，CA。适于在将细胞包埋在本发明使用的(球形)微囊的(球形)核中之前转染细胞的 本文定义的载体，通常将本文定义的核酸序列与例如控制编码氨基酸序列的表达的其它调 控元件组合。所述调控元件是例如1)对身体组织或区域具有特异性；幻组成型；；3)具有 葡萄糖响应性；和/或4)可诱导/可调控。本文的调控元件优选选自调控序列和复制原点 (如果载体是自体复制的话)。本发明范围内的调控序列是本领域技术人员已知的任何对 编码核酸序列的表达、转录和/或翻译具有影响的元件。调控序列包括远离启动子序列的 所谓的增强子序列，由于RNA聚合酶和DNA之间的增强相互作用增强子序列可以引起增强 的表达。创造性载体的另外调控序列是转录调控和翻译起始信号，所谓的“终止子”等或其 部分序列。通常而言，在适于转染可用于制备本文使用的(球形)微囊的细胞的表达载体 中，可以包含任何天然存在的启动子。所述启动子可以选自任何真核生物、原核生物、病 毒、细菌、植物、人类或诸如哺乳动物等动物的启动子。合适的启动子包括，例如，巨细 胞病毒启动子、IacZ启动子、gal 10启动子和AcMNPV多面体启动子、诸如cos-、tac_、 trp-> tet_、trp_tet_、lpp-> lac—、lpp_lac_、laclq-> T7-> T5-> T3-> gal—、trc_、ara-> SV40-、SP6、I-PR-或I-PL-启动子等启动子，有利地是在革兰氏阴性细菌中发现的启动 子。另外，启动子可以获自革兰氏阳性启动子如3!1^和5 02，酵母启动子如40(1、1^^、八(、 P-60、CYCU GAPDH，或哺乳动物启动子如巨细胞病毒(CMV)启动子、包括哺乳动物肌肉肌 酸激酶(MCK)启动子在内的肌肉特异性启动子、哺乳动物肌间线蛋白启动子(mammaliandesmin promoter)、哺乳动物肌钙蛋白I (TNNI2)启动子或哺乳动物骨骼α-肌动蛋白 (ASKA)启动子等，，或者肝型丙酮酸激酶启动子，特别是(-183 +12)或(-96 +12)的 那些片段(Thompson，等 J Biol Chem, (1991). 266 :8679-82. ；Cuif, et al.，Mol Cell Biol, (1992). 12 :4852-61) ； spot 14 启动子(S14, -290 +18) (Jump，等，J.Biol Chem, (1990). 265 :3474-8)；乙酰辅酶 A 羧化酶(0' Callaghan，等，J.Biol Chem, (2001). 276 16033-9)；脂肪酸合酶(-600 +65) (Rufo，等，J Biol Chem, (2001). 28 28)；和葡萄 糖-6-磷酸酶(大鼠和人类)(Schmol 1,等，FEBS Left, (1996). 383 :63-6 ；Argaud,等， Diabetes, (1996) · 45 1563-71)，或来自 CaM-Kinasell、巢蛋白(nestin)、L7、BDNF、NF、 MBP、NSE、β -球蛋白、GFAP、GAP43、酪氨酸羟化酶、Kainat-受体-亚基1、谷氨酸盐-受 体-亚基B的启动子、或人类泛素启动子B(ubiB人类)、人类铁蛋白H启动子(FerH)，等。特 别优选的启动子具有人类或哺乳动物原点。最后，可以有利地使用合成启动子。为了体外控 制目的，在创造性载体中含有的启动子序列，还可以是诱导型的，以允许调控表达(例如通 过在生长培养基中存在或不存在营养物或其它诱导剂)。一个实例是获自噬菌体Xplac5 的Iac操纵子，其可以通过IPTG诱导。最后，本文定义的启动子可以与本文定义的GLP-I 编码核酸序列、和可选的诸如本文定义的抗凋亡剂、VEGF等另外的因子连接，从而使得启动 子定位于GLP-I编码核酸序列的5' “上游”。优选的是，使用人类启动子，例如人类泛素启 动子B(ubiB人类)或人类铁蛋白H启动子(FerH)。用于上调本文定义的GLP-I编码核酸序列的表达的增强子序列优选是本文定 义的载体或表达的另一组分。所述增强子序列通常位于载体的非编码3'区。本文定 义的载体中使用的增强子序列可以获自任何真核生物、原核生物、病毒、细菌、植物、人类 或动物如哺乳动物宿主，优选与本文定义的相应启动子相连系。本发明中最有用的增强 子元件是具有葡萄糖响应性、胰岛素响应性和/或肝特异性的增强子元件。增强子元 件可以包括CMV增强子(例如，与泛素启动子(Cubi)连接)；一种或多种葡萄糖响应性 元件，包括肝丙酮酸激酶(L-PK)启动子的葡萄糖响应性元件(GlRE) (-172 -14 ；和 具有增强响应性的修饰版本(Cuif等，出处同上；Lou，等，J.Biol Chem, (1999).274 28385-94)；具有辅助性 L3 盒的 L-PK 的 GlRE (-172 -126) (Diaz Guerra，等，Mol Cell Biol, (1993). 13 :7725-33 ；具有辅助性L3盒的增强响应性GlRE的修饰版本；S 14的碳 水化合物响应性元件(ChoRE) (-1448 -1422)，和在较低浓度时激活的修饰物(Shih和 Towle, J Biol Chem, (1994). 269 :9380-7 ；Shih，等，J Biol Chem, (1995). 270 :21991-7 ； 和Kaytor，等，J Biol Chem, (1997). 272 :7525-31 ；具有S 14的相邻辅助因子位置的 ChoRE (-1467 -1422)[等，出处同上]；酸缩酶(+1916 +2329) (Gregori 等，J Biol Chem, (1998). 273 :25237-43 ；Sabourin，等，J. Biol Chem, (1996). 271 :3469-73 ；和脂肪酸 合成酶(-7382to-6970) (Rufo，等，出处同上)，更优选的是诸如葡萄糖-6-磷酸酶胰岛素响 应性元件(-780 -722)等胰岛素响应性元件[Ayala等，Diabetes, (1999). 48 :1885-9 ； 以及肝特异性增强子元件，如凝血酶原(940 -860) [Chow等，J Biol Chem, (1991)266 18927-33]和 α -1-微球蛋白(-四45 -2539) [Rouet 等，Biochem J, (1998). 334 577-84)，肌肉特异性增强子，如哺乳动物MCK增强子、哺乳动物DES增强子和脊椎动物肌钙 蛋白I IRE(TNI IRE，本文还称为FI拙)增强子。最后，还可以包括SV40增强子序列。增强子元件还可以与用于上调本文定义的GLP-I编码核酸序列的表达的本文定义的启动子一起使用，例如所述启动子/增强子组合包括例如巨细胞病毒(CMV)启动子和 CMV增强子、与泛素启动子(Cubi)连接的CMV增强子、与其相应的启动子组合使用的包括人 类血清白蛋白[HSA]增强子、人类凝血酶原[HPrT]增强子、微球蛋白[Α1ΜΒ]增强子 和内含性醛缩酶增强子在内的肝特异性增强子元件的组，或与选自CMV启动子或HSA启动 子的启动子组合使用的HSA增强子、与CMV启动子组合使用的选自由人类凝血酶原[HPrT] 和α-1微球蛋白[Α1ΜΒ]组成的组中的增强子元件、与α-1-抗胰蛋白酶启动子组合使用 的选自由人类凝血酶原[HPrT]和α-1微球蛋白[Α1ΜΒ]组成的组中的CMV增强子元件，等等。另外，适于对可用作本发明使用的(球形)微囊的组分的细胞进行转染的本文定 义的载体，可以含有转录和/或翻译信号，优选的是被合适宿主识别的转录和/或翻译信 号，例如转录调控和翻译起始信号。转录和/或翻译信号可以获自任何真核生物、原核生 物、病毒、细菌、植物、优选人类或动物如哺乳动物宿主，优选与本文定义的的相应启动子相 连系。因此根据宿主细胞识别与GLP-I编码核酸序列和可选地本文定义的另外因子相连系 的转录调控和翻译起始信号的程度的宿主的性质，可以使用多种转录和翻译调控序列。可 以保留与天然存在的GLP-I编码核酸序列相邻的5'区并用于在创造性载体中进行转录 和翻译调控。该区域通常包括参与转录和翻译启始的那些序列，例如TATA盒、加帽序列和 CAAT序列等。通常而言，该区域通常长度为至少约150个碱基对，更通常是约200bp，并且 几乎不超过约1 21Λ。可以选择允许控制抑制或激活的适于本文定义的载体的转录起始调控信号，从而 能够调节本文定义的GLP-I编码核酸序列和可选地本文定义的另外因子的表达。一种所述 可控调节技术是使用温度敏感性调控信号，从而通过改变温度来抑制或启动表达。另一种 可控调节技术是使用对某些化学物敏感的调控信号。这些方法优选用于体外程序，例如当 制备所需构建体时。另外，本文可以使用转录起始调控信号，所述转录起始调控信号允许不 使用来自细胞外的任何另外手段即可控制体内表达的抑制或激活，从而例如获得封装细胞 中的瞬时表达。所述转录和/或翻译信号包括例如转录终止调控序列，例如停止信号和多 腺苷酸化区域。另外，转录终止调控序列可以位于含有GLP-I编码核酸序列的本文定义的 载体的非编码3'区。合适的终止序列可以包括，例如，牛生长激素、SV40、lacZ、EFl α和 AcMNPV多面体多腺苷酸化信号。适于转染可用于制备本发明使用的(球形)微囊的细胞的表达载体，还可以包括 用于使本文定义的GLP-I编码核酸序列和可选地本文定义的另外因子进行最佳表达的其 它序列。所述序列包括编码信号(肽)序列的序列，即编码为分泌蛋白进入或通过膜提供 通道的位于N末端的肽序列的序列；为表达产物提供稳定性的序列；和为通过限制性内切 核酸酶切割提供位点的限制性酶识别序列。所有这些材料是本领域已知的，并且商购可得 (参见，例如，Okayama (1983)，Mol. Cell. Biol.，3 :280)。本文定义的“信号序列”是这样的信号(肽)序列，其通常包含约8 30个氨基 酸，或15 30个氨基酸，(在关于GLP-I的第1 6位氨基酸在本文条件的定义内)位于 所表达GLP-I(融合)肽的N末端并且使GLP-I肽能够得以分泌，即通过细胞膜。所述信号 (肽)序列可以包括正常与野生型GLP-I前体蛋白相连系的信号序列(即全长胰高血糖素 原前体分子的信号序列)，以及正常不与其相连系的信号(肽)序列，即其对野生型GLP-I
36前体蛋白(即，全长胰高血糖素原前体分子的信号(肽)序列)是异源性的。本文定义的 “信号(肽)序列”可以例如是信号肽序列或前导序列(例如分泌信号(和前导)序列)。另 外，本文定义的信号(肽)序列优选提供了诸如信号(肽)序列蛋白酶等蛋白酶对(GLP-I) 前体肽的切割。当通过蛋白酶从(GLP-I)前体肽切割信号(肽)序列时，产生本文定义的 生物活性GLP-I肽。所述信号(肽)序列通常包含编码被蛋白酶识别以用于切割的切割位 点的区域。作为选择，可以将编码被蛋白酶识别以用于切割的切割位点的区域引入到信号 (肽)序列中。另外，可以将编码被蛋白酶识别以用于切割的切割位点的另外的(一个或多 个)序列添加到信号(肽)序列中。可由本文定义的载体编码的信号(肽)序列的实例包括源自以下蛋白的信号 (肽)序列分泌蛋白，如GLP-I或除GLP-I之外的分泌蛋白，例如细胞因子、凝固因子、 免疫球蛋白、分泌酶或激素(包括激活多肽(PACAP)/胰高血糖素超家族的垂体腺苷酸环 化酶)和血清蛋白等。例如，本文定义的信号(肽)序列可以源自分泌的基质金属蛋白 酶(MMP)例如基质溶素前导序列，例如源自分泌的人类碱性磷酸酶(SEAP)，原毒蜥外泌 肽(proexendin)、例如原毒蜥外泌肽_4前导序列、毒蜥素原(pro-helodermin)、原-葡萄 糖-依赖性促胰岛素多肽(GIP)、原胰岛素样生长因子(IGFl)、前原胰高血糖素、α -1抗胰 蛋白酶、胰岛素样生长因子1、人类因子IX、人类淋巴毒素A(Genbank登录号ΒΑΑ00064)，或 人类簇蛋白(Genbank登录号AAP88927)。本文定义的信号(肽)序列的具体实例是包括用 于通过信号肽酶、弗林蛋白酶或其它激素原转换酶(例如，PC3)进行前体切割的信号的编 码区域的序列。例如，可被弗林蛋白酶(还称为PACE，参见美国专利第5，460，950号)、其 它枯草杆菌蛋白酶(包括 PC2、PC1/PC3、PACE4、PC4、PC5/PC6、LPC/PC7IPC8/SPC7 和 SKI-1 ； Nakayama, Biochem. J.，327 :625-635(1997))；肠激酶(参见美国专利第 5，270，181 号) 或胰凝乳蛋白酶切割的信号(肽)序列可以被引入本文定义的信号(肽)序列中。通过 参考将这些文献中每一篇的内容本文并入。弗林蛋白酶是遍在表达的蛋白酶，在其存在于 顺式高尔基体中并在蛋白分泌之前对蛋白前体进行加工。弗林蛋白酶在其共有识别序列， Arg-X-Lys-Arg 或 Arg-X-Arg-Arg、(Lys/Arg) -Arg-X- (Lys/Arg) -Arg 禾口 Arg-X-X-Arg,例如 Arg-Gln-Lys-Arg的COOH-末端处进行切割。这些氨基酸序列是使前体被弗林蛋白酶切割 的信号。因此，异源性信号(肽)序列还可以根据从信号(肽)序列汇集的共有序列(例 如，从被信号肽酶切割的分泌蛋白汇集的共有序列)合成。除了本文定义的调控序列之外，本文定义的自主复制载体通常包含复制原点。合 适的复制原点包括，但不限于，例如ColEl、pSC101、SV40、pMPI(ori pMPI)和M13复制原点寸。优选的是，适于本文定义的(球形)微囊的细胞的GLP-I编码核酸序列和可选地 本文定义的另外因子的表达的本文定义的载体，可以另外地含有自杀基因。在本发明的情 况下，当施用特定物质时优选“自杀基因”能够通过杀死在(球形)微囊的(球形)核中含 有的携带有自杀基因的细胞而停止使用本文所用的(球形)微囊进行治疗。换言之，可以通 过施用在人类或动物体内通常不存在的外源性激活剂，从而激活适于本发明的自杀基因。 在该情况下，通常自杀基因启动使细胞经受凋亡事件的级联。作为选择，适于本发明的自杀 基因可以代谢所施用的在人类或动物体内通常不存在的外源性非毒性前药。外源性非毒性 前药的代谢优选使所述前药成为细胞毒素。自杀基因可以包含在编码本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽的同一载体上或作为选择包含在第二载体上。另外，可以通过任何种类的 控制和调控元件，例如作为表达载体组分的诸如以上提及的启动子、增强子等控制和调控 元件，或通过其天然存在的控制和调控元件，从而对自杀基因进行调控。优选的是，根据本 发明选择允许任何本文控制机制的自杀基因，例如选自胞嘧啶脱氨酶(CD)、尿嘧啶磷酸核 糖基转移酶(UPRTase)、HSV胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-Tk)的自杀基因，可以通过添加四环 素如细菌Tet阻遏蛋白(TetR)而诱导的自杀基因。作为具体实例，可以使用胞嘧啶脱氨酶 (CD)0胞嘧啶脱氨酶(CD)通常出现在各种生物体中，并且能够将5-氟胞嘧啶(5-FC)转化 成代表常见化疗剂的5-氟尿嘧啶(5-FU)。5-氟尿嘧啶(5-FU)对于生物体具有高毒性，而 其前药5-氟胞嘧啶(5-FC)对细胞是无毒的。随后5-氟尿嘧啶(5-FU)通过细胞激酶而磷 酸化，并且能够阻止细胞RNA合成。因此，前药5-氟胞嘧啶(5-FC)代表用于诱导特定细胞 的自杀的优良工具。另外，5-氟-dUMP充当抗叶酸剂，并且抑制酶胸苷酸合酶(thymidylat synthase)，该胸苷酸合酶在脱氧核糖核苷酸的从头合成途径中催化dUMP甲基化为dTMP。 由此，可以实现细胞中DNA合成的抑制。还优选的是，可以使用HSV-I胸腺嘧啶核苷激酶 (ATP 胸腺嘧啶核苷-5-磷酸转移酶)和其相应的前药丙氧鸟苷(ganciclovir，GCV)。鸟 嘌呤核苷类似物GCV特异性磷酸化，并且抑制DNA合成的延伸，以及由此引起细胞的自杀。将编码GLP-I肽或GLP-I融合肽以及可选的另外因子的本文定义的载体或核酸 转染到用于制备本文定义的(球形)微囊的合适细胞中，可以通过本领域技术人员已知的 任何方法实现(参见例如 Maniatis 等(2001)Molecular Cloning :A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY)。如果将载体转染到本 文定义的合适细胞，优选载体以携带GLP-I肽或GLP-I融合肽编码核酸的质粒DNA的形式 存在。质粒DNA优选是环状质粒DNA。合适的转染方法包括，但不限于，例如包括改进的电 穿孔技术(例如核转染)在内的电穿孔技术、诸如磷酸钙共沉淀法等磷酸钙技术、DEAE-右 旋糖酐法、诸如转移-介导的脂质转染法等脂质转染法等。优选的是，利用改进的电穿孔技 术(例如核转染)使用携带本文定义的载体的质粒DNA进行转染。本文定义的载体，或作为选择，编码本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽或者它们 的片段或变体、以及可选的本文定义的另外因子的核酸，还可以与至少一种合成聚合物或 天然聚合物(例如聚氨基酸)进行复合(complex)，例如以用于转染，或可以与其缀合。至 少一种聚合物组分可以与本文定义的载体共价连接，或作为选择，与编码本文定义的GLP-I 肽或GLP-I融合肽或者它们的片段或变体、以及可选的本文定义的另外因子的核酸共价连 接。本发明意义内的“缀合”是指“化学偶联”。“化学偶联”是指经由共价连接或非共价连 接偶联。虽然也可以使用共价连接，但是为了转染目的优选非共价连接。由此，聚合物组分 可以经由复合而不是共价连接，例如经由氢键或静电、疏水性等相互作用与融合肽连接。用于偶联本文定义的载体的本文使用的聚合物，或作为选择，用于偶联编码本文 定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽或者它们的片段或变体、以及可选的本文定义的另外因子 的核酸的本文使用的聚合物，可以是生理学上可接受的聚合物，其包括在水溶液或悬浮液 中可溶并且当以药学上有效量施用融合肽时对哺乳动物没有诸如副作用等负面影响的聚 合物。对于本发明使用的生理学上可接受的聚合物没有特别限制。该聚合物可以具有合成 性质或可以是天然存在的聚合物(例如蛋白质)。更通常而言，与本文定义的载体一起使用的合成聚合物，或作为选择，与编码本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽或者它们的片段或变体、以及可选的本文定义的另外因子 的核酸一起使用的合成聚合物，优选选自亚烷基二醇，如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、 乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚烯烃醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羟基烷基甲 基丙烯酰胺、诸如聚羟基亚乙基甲基丙烯酸酯等聚羟基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、多 糖、聚([α]_羟基酸)、聚乙烯基醇、聚磷腈、聚喁唑啉、聚(N-丙烯酰基吗啉)、聚乙烯基乙 基醚、聚乙烯醇缩乙醛、聚乳酸乙醇酸、聚乳酸、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸、聚氨酯、聚 唾液酸、三乙酸纤维素、硝酸纤维素和任何以上的组合。本发明还提供用于制备本发明使用的(球形)微囊的方法。这些(球形)微囊优 选根据两步方法步骤或多步方法步骤制备。根据方法步骤1)，制备如上所述的核。根据方 法步骤幻，用一层或多层表面涂布层涂布根据方法步骤1)制备的核。另外的可选步骤可以 包含方法步骤幻的重复以用于制备另外的表面涂布层。优选的是，对于所述另外表面涂布 层的每一层，进行与方法步骤幻相同的步骤。另外的可选步骤可以包括在制备球形微囊之 后的洗涤步骤。通常而言，根据用于制备本发明使用的(球形)微囊的方法步骤1)来制备本文所 述的核。所述核由交联聚合物以及已经根据本文所述方法转染的GLP-I编码和分泌细胞组 成。根据方法步骤1)，通常优选以对于(球形)核所述的浓度(例如IX IO5个细胞 最多 6X IO7个细胞每ml聚合物溶液)制备可溶形式的聚合物(例如可溶形式的藻酸盐(例如 在生理盐水溶液中的藻酸钾或藻酸钠))和GLP-I-肽编码和分泌细胞的混合物(悬浮液)。作为典型技术可以将同基因(homogenic)细胞/聚合物悬浮液(例如细胞/藻 酸盐悬浮液)加压通过空气喷嘴，所述空气喷嘴由三个通道组成，所述三个通道作为围绕 共同中心的三个同心环同心地排列内通道、中间通道和外通道(空气环(air ring))。优 选将中空针用于内径为50 μ m 最多2，000 μ m的内通道。中间通道通常具有的内径为 60 μ m 4000 μ m，外通道(空气环)优选具有的内径为100 μ m 5，000 μ m。内通道和外通 道(空气环)专门用于制备本发明使用的(球形)微囊的核的方法步骤1)。因此，仅由两个 通道(内通道和外通道)组成的喷嘴也可用于方法步骤1)。通常而言，如果使用具有三个 通道的空气喷嘴，则没有物质流过中间通道。将细胞/聚合物溶液的悬浮液通常以10μ 1/ 分钟 5ml/分钟的速度加压通过内通道，在通道的出口处产生微滴，该微滴是由于外通道 (空气环)提供的速度通常为0. 51/分钟 101/分钟的气流而被撕下的(tear off)。含 有细胞和非交联聚合物溶液的微滴落入含有交联剂的溶液(沉淀浴)，该溶液(沉淀浴)通 常位于空气喷嘴的出口下方的约4cm 约60cm距离。下滴过程中微滴优选变圆，由此得到 基本上为球形的几何形状。交联剂实现了聚合物的离子交联，最初形成具有本文对(球形) 核定义的直径的球形(水不溶性)微囊的核。(球形)微囊的核的直径取决于方法步骤1) 中使用的所选通道的尺寸和几何形状。如果使用藻酸盐作为聚合物的话，含有交联剂的溶 液(沉淀浴)优选由二价阳离子，例如钙离子或钡离子(5mM IOOmM)或其它二价阳离子 或多价阳离子组成。另外，沉淀浴优选含有缓冲物质(例如ImM IOmM的组氨酸)和氯化 钠(例如^OmOsm0I士50m0Smol)。如果使用藻酸盐之外的其它聚合物，本文可以使用本领 域已知的其它合适的交联剂和缓冲液。方法步骤1)提供由交联聚合物和本文定义的细胞组成的(球形)微囊的核。方 法步骤1)之后的可选的方法步骤可以包括洗涤步骤。例如用生理盐水溶液或任何其它合适的洗涤溶液洗涤本发明使用的(球形)微囊的核，并且如果适用的话，使核在硫酸钠溶液 中温育，优选在根据US 6，592，886在硫酸钠溶液中温育，通过参考将US 6，592，886的内容 并入本文。将本发明使用的(球形)微囊的核从沉淀浴和/或洗涤浴中分离通常使用离心 机或任何其它合适的方法进行。根据方法步骤幻，使用基本上由交联聚合物制得的表面涂布层涂布通过方法步骤 1)制备的本发明使用的(球形)微囊的核。因此，将步骤1)制备的(球形)微囊的核加入 到含有本文所述的非交联聚合物但不包含细胞的聚合物溶液中。优选的是，聚合物以本文 定义的浓度以其非交联形式提供。通常而言，将含有聚合物溶液和(球形)微囊的核的该混 合物以例如15 μ 1/分钟 aiil/分钟、优选10 μ 1/分钟 5ml/分钟的速度加压通过本文所 述的空气喷嘴的内通道。同时，将不具有细胞的纯非交联聚合物溶液，优选包含约0. 约4% (w/v)聚合物的溶液，例如不具有细胞的藻酸盐溶液，以通常15 μ 1/分钟 aiil/分 钟，优选10 μ 1/分钟 5ml/分钟的速度加压通过中间通道。由此，在中间通道的末端形成 含有核和未经聚合的聚合物的表面的微滴。由于通过外通道(空气环)提供的速度通常为 0. 51/分钟 101/分钟的气流，这些微滴被撕下。(球形)微囊的核的聚合物浓度、向其中 添加(球形)微囊的核的聚合物溶液的聚合物浓度以及表面涂布液的聚合物浓度可以不同 (参见本文)。含有(球形)微囊的核的微滴(根据方法步骤2、制备)落入本文定义的含 有交联剂的溶液(沉淀浴)中。下滴期间，所述微滴优选变圆成为近球形的几何形状。交 联剂实现了方法步骤1)的聚合物类似物的离子交联。由此，形成具有本文定义的直径的水 不溶性(球形)微囊，优选(球形)微囊的总直径(粒径)为约100 μ m 约200 μ m,更优 选总直径为约115 μ m 约185 μ m，还更优选总直径为约130 μ m 约170 μ m，并且最优选 总直径为约145 μ m 约155 μ m,例如为约150 μ m。通过方法步骤2)可获得的(球形)微 囊的总直径取决于本文使用的所选通道的大小和几何形状。为了制备具有超过1层表面涂 布层的本文定义的(球形)微囊，即含有本文定义的核和2层、3层、4层、5层、5 10层或 更多层表面涂布层的(球形)微囊，方法步骤幻可以按照需要的次数进行重复。规定这些 另外的表面涂布层在本文直径范围内。在方法步骤幻之后，可以进行本文定义的一步或多步可选的洗涤步骤。根据另一方面本发明还提供治疗动物，优选哺乳动物的AMI或MI的方法。因此所 述治疗方法可用于人类医学或兽医医学领域。在本发明的情况下，术语哺乳动物通常包括 任何动物和人类，优选选自包括但不限于人类和(非人类)(哺乳)动物的组，包括例如猪 (pig)、山羊、牛、猪(swine)、狗、猫、驴、猴子、猿或包括小鼠、仓鼠和兔在内的啮齿动物、乳 牛、兔、绵羊、狮子、美洲虎、豹、大鼠、猪(Pig)、水牛(buffalo)、狗、懒猴、仓鼠、豚鼠、扁角 鹿、马、猫、小鼠、豹猫、薮猫等。所述治疗通常通过以下方式进行对有需要的患者施用本文 定义的(球形)微囊，特别是通过施用编码和分泌本文定义的GLP-I肽、本文定义的GLP-I 融合肽或者它们的片段或变体的本文定义的细胞，例如间充质干细胞或间充质基质细胞、 或可用于本发明情况的任何其它细胞(类型)，其中将这些细胞封装在本文定义的(球形) 微囊中以防止待治疗患者的免疫系统的应答。优选的是，本发明方法中使用的(球形)微 囊以及所有其成分，例如核或表面涂布层的聚合物基质的聚合物等，是如上定义的。本发明情况下的治疗优选包括治疗或预防缺血性心脏病或急性冠状动脉综合征， 以及治疗或预防预期与其相关的疾病。所述疾病或状况的非限制性实例包括AMI或MI、ST上升MI (STEMI)、心肌病(包括缺血性心肌病)、不稳定型心绞痛、充血性心力衰竭和心室功 能异常、心力衰竭、内皮功能障碍疾病、任选的高血压或与它们相关的任何疾病或状况。治疗或预防本文定义的AMI或MI (包括治疗或预防与AMI或MI相关的疾病或状 况)的方法还包括对有需要的患者施用封装在本文定义的(球形)微囊中的细胞或本文定 义的(球形)微囊，或者施用含有上述(球形)微囊的药物组合物。有需要的患者通常是 例如动物，优选哺乳动物，例如人类。此处治疗方法情况下的施用通常以活性剂(即封装在 本文定义的(球形)微囊中的细胞或本文定义的(球形)微囊)的“安全且有效”的量进 行。如本文所用，“安全且有效的量”是指封装在本文定义的(球形)微囊中的这些细胞或 本文定义的(球形)微囊的量，该量足以显著地诱导本文提及的疾病或障碍的积极变化。 但是，同时，“安全且有效的量”足够小从而避免严重的副作用，这就是说能够在优点和风险 之间取得明智关系。这些限制的确定通常处于明智的医学判断的范围内。在本发明的情况 下，表述“安全且有效的量”优选是指适于发挥GLP-I的已知有益效果的封装在本文定义的 (球形)微囊中的细胞或本文定义的(球形)微囊的量，所述有益效果例如有其活性强烈减 少由缺血或缺氧引起的损伤和心脏组织的可能死亡，而不需要重复地施用GLP-I肽，和/或 没有针对例如植入的表达GLP-I的同种异体细胞的不期望的免疫应答的风险。封装在本文 定义的(球形)微囊中的细胞或本文定义的(球形)微囊的“安全且有效的量”还会根据 待治疗的具体疾病以及待治疗患者的年龄和身体状况、疾病的严重性、治疗持续时间、伴随 治疗的性质、特别是所使用的药学上可接受载体的性质以及类似因子在施用医生知识和经 验内而变化。通常而言，创造性药物组合物中含有的(球形)微囊每天分泌约0. 2 μ g本文定义 的GLP-I肽/ml (球形)微囊。因此，剂量范围可以例如是约0. 01 μ g 20mg分泌的生物 活性GLP-I肽/天(虽然还设想Img IOOmg的更高量)，例如约0. 01 μ g IOmg/天、优 选0. 01 μ g 5mg/天，还更优选约0. 01 μ g Img/天，并且最优选约0. 01 μ g 500 μ g/天。此处治疗方法的情况下的施用通常通过以下方式进行将封装在本文定义的(球 形)微囊中的细胞或本文定义的(球形)微囊或含有上述(球形)微囊的药物组合物提供 至待治疗患者中的特定施用位置中。所述特定施用位置通常是心脏肌肉或心脏组织、心肌 或心肌组织，特别是梗死区域、周围区域和/或梗死周围区域(periinfarct zone)，例如所 有这些区域均通过诸如心电图法或NOGA电机械标测(electromechanical mapping)或MRI 等本领域的常规手段检测。施用位置还包括心脏的血管或心脏周围的血管，例如供给心脏 肌肉或组织的微动脉、供给心肌或心肌组织的微动脉，特别是供给梗死区域、周围区域和/ 或梗死周围区域的微动脉等，例如心脏的LAD(LAD=左前降支(LAD)冠状动脉)，或其它冠 状动脉。施用位置还包括心脏肌肉或组织的表面，特别是梗死区域、周围区域和/或梗死周 围区域的表面，其可以通过在开胸手术之后或期间进行心外膜注射而治疗，但其不限于此， 其中梗死可以通过目视区分。梗死后，组织迅速变成胶冻样，并且失去物理完整性。还可将 封装在本文定义的(球形)微囊中的细胞或本文定义的(球形)微囊或含有上述(球形) 微囊的药物组合物的注射入梗死的该液化的胶冻样区域中或进入本文定义的任何其它区 域中。如果通过将(球形)微囊施用到心脏的血管或心脏周围的血管，例如供给心脏肌肉或组织的微动脉、供给心肌或心肌组织的微动脉，特别是供给梗死区域、周围区域和/或 梗死周围区域的微动脉等，例如心脏的LAD(LAD =左前降支(LAD)冠状动脉)，或其它冠状 动脉而进行施用，则创造性的(球形)微囊通常施用的量和时间可防止闭塞和任何栓塞效 应，例如心脏的梗死、微梗死等。这可以通过使待施用(球形)微囊的施用总量为例如约 5，000珠 约1，000, 000珠、约10，000珠 约750，000珠、约10，000珠 约500，000珠、约 10，000珠 约250，000珠、或约10，000珠 约100，000珠、例如约40，000珠 约100，000 珠、例如约40，000珠、约50，000珠、约60，000珠、约70，000珠、约80，000珠、约90，000珠或 约100，000珠、约60，000珠(例如相当于例如约三百万 四百万个细胞)、或约100，000 约 300，000 珠、例如约 100，000珠、约 150，000 珠、约 200，000 珠、约 250，000 珠或约 300，000 珠，或由这些值中任何两个形成的任何范围。施用优选以低俗或时间交错模式发生。举例 而言，可以向左前降支(LAD)冠状动脉缓慢施用最多10，000，000珠而不会引起梗死。向本文定义的特定施用位置中施用封装在本文定义的(球形)微囊中的细胞、或 本文定义的(球形)微囊、或含有所述(球形)微囊的药物组合物可以使用不同的施用模 式进行。例如，可以全身地或局部地施用封装在本文定义的(球形)微囊中的细胞、或本文 定义的(球形)微囊、或含有所述(球形)微囊的药物组合物。全身施用的途径通常包括， 例如，透皮途径或胃肠外途径，包括静脉内注射、皮下注射和/或动脉内注射。局部施用的 途径通常包括，例如，局部施用途径以及透皮、肌肉内注射、皮下注射、心脏内注射、心肌内 注射和/或心包注射。更优选的是，可以通过皮内途径、皮下途径或肌肉内途径，更优选通 过心脏内注射、心肌内注射和/或心包注射施用封装在本文定义的(球形)微囊中的细胞、 或本文定义的(球形)微囊、或含有所述(球形)微囊的药物组合物。可以适于治疗任何以上提及的疾病或障碍的其它施用模式，包括移植编码和分泌 GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽的本文定义的细胞(其中这 些细胞封装在本文定义的(球形)微囊中)或本文定义的(球形)微囊(优选以合适的形 式配制，例如通过添加合适的药物载体，例如以凝胶、胶囊、片剂等的形式)。可以通过介入 性手段，例如使用导管导引到受影响区域，并且通过注入心肌组织而植入所述珠，从而将封 装在本文定义的(球形)微囊中的细胞而直接递送到心脏的受影响位置(本文定义的施用 位置)。可以在AMI后的常规血管成形术期间进行植入。植入还可以通过直接注入心脏组 织，或通过血管内递送通过供给受影响心脏组织的微动脉而进行，并进入AMI或AMI后哺乳 动物患者的心肌的受影响区域。不受以下限制，可以例如通过应用合适的注射针(例如尺寸为12G ^G，更优选 为18G 22G的注射针)或者例如通过移植本文定义的细胞或(球形)微囊(优选以合 适的形式配制)，使用外科手术装置(例如手术刀、本文定义的注射针等)施用编码和分泌 GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽的本文定义的细胞(其中将 这些细胞封装在本文定义的(球形)微囊中)，或本文定义的(球形)微囊。根据一个不应 视为限制本发明的具体实例，罹患AMI或MI或者与它们相关的任何疾病或本文所述的任何 疾病的有需要的患者，可以接受将本文定义的细胞或(球形)微囊的肌肉内注射或植入本 文定义的施用位置等。施用其核中包埋有编码和分泌GLP-I的细胞的本文定义的(球形)微囊、或所述 细胞或包含这些(球形)微囊的药物组合物来治疗或预防本文定义的AMI或MI疾病和障碍，优选产生GLP-I的有益效果，例如其活性(强烈)减少由缺血或缺氧引起的损伤和心脏 组织的可能死亡。所述有益效果包括使患有AMI和严重心脏收缩障碍的患者在成功地进行 直接血管成形术后改善局部和综合LV功能。编码和分泌GLP-I的(球形)微囊的原位心 脏保护作用特别归因于胰高血糖素样肽-I(GLP-I)融合蛋白的局部分泌和连续递送至损 伤位置的其它旁分泌因子。根据本发明人所知，但不受其束缚，编码和分泌GLP-I的(球形)微囊的原位心脏 保护作用至少部分基于以下事实本发明成功地利用具有发挥直接心脏保护作用的潜力的 GLP-I的性质。在这点上并且除了其肠降血糖素作用之外，GLP-I显示减少胰腺β-细胞凋 亡。GLP-I受体在心脏中的定位证明GLP-I促进β -细胞中ΡΙ3Κ(—种激酶，与在缺血再 灌注损伤以及预处理情况下的心肌保护明显相关)的活性，并由此允许人们假设GLP-I在 缺血/再灌注情况下的新型的独立作用。GLP-I另外诱导心肌细胞中cAMP水平的增加，该 cAMP水平增加接着激活蛋白激酶A。GLP-I由cAMP和PII介导而对胰岛素-分泌细胞具 有抗凋亡作用。PII的激活通过引起促凋亡肽BAD与14-3-3蛋白质结合而导致促凋亡肽 BAD的磷酸化和失活。BAD是Bcl-2家族的促凋亡成员，可以取代Bax与Bcl_2和Bcl_xl 结合，引起细胞死亡。蛋白质印迹使得研究者确认BAD通过GLP-I在丝氨酸136处磷酸化。 因此，作为令人惊奇的结果，似乎GLP-I在所用模型中对心脏肌肉具有直接的抗凋亡作用。 另外，认为cAMP的水平上升在缺血的心肌细胞中是有害的。但是，产生的cAMP的量可以 在确定引起抗凋亡途径的分叉性信号传导途径(divergent signalling pathway)中起作 用。产生的cAMP还可以位于描述为区室化的特定微域中，该微域限制其作用。GLP-I-介导 的cAMP的增加(与异丙基肾上腺素相比)不能引起任何变力性(inotropic)或松弛性效 果，支持所述区室化的看法。G蛋白-偶联信号传导的区室化已经是许多报道的主题，并且 越发意识到蛋白激酶A活性的时空调控包括离散cAMP库的调控。还显示GLP-I增加大鼠 的血压和心率，虽然现有技术不能证明任何血液动力学变化。这可能是由于剂量、递送方法 或物种的差异。GLP-I显示对血压和脉搏的集中控制具有作用。另外，之前重组GLP-I已 经在猪心肌缺血模型中显示防止丙酮酸盐和乳酸盐的累积，但不显示梗死的任何减少。但 是，本发明的发明人能够令人惊奇地证明本文所示的GLP-I或者GLP-I的融合肽对心肌的 保护。总之，本发明的发明人已经首次令人惊奇地发现GLP-I在猪心脏中的心脏保护作用， 以及该可能用于GLP-I激动剂(一类目前正在进行治疗2型糖尿病的试验的药物)的治疗 潜力的新观点，其中施用本文定义的(球形)微囊不显示免疫反应。本发明还包括编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体 的融合肽的本文定义的细胞(其中所述细胞封装在本文定义的(球形)微囊中)在制备用 于治疗动物，优选诸如人类等哺乳动物的AMI或MI的产品中的应用，所述产品例如为药物 组合物或试剂盒。用于所述治疗的细胞可以是编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含 GLP-I或其片段或变体的融合肽的本文定义的细胞，例如间充质干细胞或间充质基质细胞， 或可用于本发明情况下的任何另外的细胞，其中将这些细胞封装在(球形)微囊中以防止 待治疗的患者的免疫系统的应答。本发明的另一方面是药物组合物，所述药物组合物含有编码和分泌GLP-1、其片段 或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽的本文定义的细胞(其中将这些细胞封装 在本文定义的(球形)微囊中)或者含有本文定义的(球形)微囊。可以以本文定义的模式将所述药物组合物应用到罹患本文疾病的患者，优选应用到本文定义的施用位置。含有编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽 的本文定义的细胞(其中将这些细胞封装在本文定义的(球形)微囊中)或者含有本文定 义的(球形)微囊作为“活性成分”的药物组合物的制备，通常是本领域中充分理解的，如 美国专利第 4，608，251 ；4，601，903 ；4，599，231 ；4，599，230 ；4，596，792 ；和 4，578，770 号所 例举，通过参考将上述全部专利并入本文。通常而言，将药物组合物制备成可注射的液体溶液或悬浮液，该液体溶液或悬浮 液优选含有水(水性制剂)，或者可以将其乳化。将术语“水性制剂”定义为包含至少50重 量％水的制剂。类似地，将术语“水性溶液”定义为包含至少50重量％水的溶液，将术语“水 性悬浮液”定义为保护至少50重量％水的悬浮液。对于在本文定义的痛苦位置处的肌肉内注射、静脉内注射、皮肤注射或皮下注射 或任何另外的注射，本文定义的细胞或(球形)微囊可以是胃肠外可接受的水性溶液的形 式，该水性溶液不含热原并且具有合适的PH、等渗性和稳定性。液体药物组合物通常包括诸 如水等液体载剂。优选的是，液体载剂包括生理盐水溶液，也可以包括右旋糖乙醇或其它糖 溶液/或者二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇以及它们的组合。另外的实例包括其它等渗 载剂，例如生理盐溶液，如林格氏溶液或乳酸盐林格氏溶液。如果创造性的药物组合物包含本文定义的细胞或(球形)微囊和例如缓冲液的水 性溶液，所述(球形)微囊通常以0. lmg/ml的浓度存在于药物组合物中，或者本文中，所述 药物组合物的PH通常为约2. 0 约10. 0，优选为约7. 0 约8. 5。创造性药物组合物中可以存在于其它成分，这是可行的。所述另外的成分可以包 括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、膨胀剂、PH缓冲剂(例如磷酸盐或柠檬酸盐或马来酸盐缓冲 剂)、防腐剂、表面活性剂、稳定剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油质载剂、蛋白质(例如 人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和/或两性离子(例如诸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨 酸、赖氨酸和组氨酸等氨基酸)。所述成分可由本领域技术人员根据本发明使用的包埋在 (球形)微囊的核中的细胞的具体要求来选择，即所述成分没有细胞毒性并且确保所述细 胞的生活力。另外，所述成分可以使已经由本发明使用的包埋在(球形)微囊的核中的细 胞编码和分泌的GLP-I肽稳定化。关于缓冲液，其优选选自由以下物质组成的组中乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、双甘 氨肽、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)_氨 基甲烷、羟乙基哌嗪乙磺酸(h印es)、N_ 二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、三(羟甲基)甲基 甘氨酸(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或它们的混合物。 这些特定缓冲剂中的每一种组成本发明的替代性实施方式。在含有本文定义的细胞和/或本发明使用的(球形)微囊的药物组合物中使用所 有上述添加剂，特别是关于上述添加剂的浓度范围是本领域技术人员众所周知的。方便起 见，请参考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，1995。优选以本文定义的方式施用含有编码和分泌本文定义的GLP-I的细胞和/或本文 定义的(球形)微囊的创造性药物组合物以用于通常的治疗。所述施用优选与剂型相容，并 且优选包含安全且有效量的本文定义的活性成分，即视为安全但是治疗上有效的所述量。 与创造性药物组合物一起施用(或，如果需要，单独施用)的编码和分泌本文定义的GLP-I的细胞和/或本文定义的(球形)微囊的量，取决于要治疗的受试对象和疾病，包括，例如 患者疾病的严重性。合适的剂量范围依赖于预定时间中由(创造性药物组合物中含有的) (球形)微囊分泌的生物活性GLP-I肽的量，并且该剂量范围如本文定义，通常为1 数百 微克(GLP-I)/天的级别。如果不是另外指出，本发明还可以包括本文所述实施方式和特征的组合，并且本 发明不旨在限于这些特别定义的单独实施方式。通过以下附图进一步说明本发明。但是，不旨在使本发明的范围限于以下所示的 图的内容。


图1 显示了示例性构建体a m的非限制性概观(还参见实施例1)，其还包含于 用于制备本发明使用的(球形)微囊的细胞中。图2 描述了瞬时转染后在hTERT-MSC和HEK293细胞中不同GLP-I构建体和活性 GLP-I的瞬时表达的结果(还参见实施例2)。在单聚GLP-I构建体#103和#317 (仅具有 一个拷贝的GLP-I (7-37))中仅能够观察到少量的活性GLP-I水平。在hTERT-MSC细胞中 和在HEK293细胞中都观察到二聚GLP-I构建体#217(具有作为成分(I)和作为成分(III) 的GLP-I (7-37))的表达的巨大增加。图3 显示来自GLP-I分泌细胞的细胞培养物上清液的蛋白质印迹分析(还参 见实施例3)。泳道1 溶解于模拟(mock)转染的hTERT-MSC细胞的上清液中的IOOng合 成GLP-I (7-37)；泳道2 分泌来自构建体#217的二聚GLP-1的hTERT-MSC细胞(克隆 79TM217/13)的上清液；泳道3 分泌来自构建体#217的二聚GLP-I的AtT20细胞(克隆 81-A-217/3)的上清液；泳道M 预染色的蛋白标记[kDa])。结果表明，含有GLP-I (7_37) 和C末端附属物(appendix)(图3中的2和3)的本文定义的肽由经转染的细胞系分泌并 且可以使用与GLP-I (7-37)的中间分子表位结合的抗-GLP-I抗体进行检测。图4 描述了使用本发明所用的GLP-I肽进行的血浆稳定性测试(体外)。因此， 使用构建体(l)#103GLP-l(7-37)、(2)#317GLP-l(7-37)-IP2-延长有 11 个氨基酸和(3) #2 17GLP-1 (7-37)-IP2-GLP-l (7-37)瞬时转染HEK293细胞。HEK293细胞对于基因构建是有 效的宿主(还参见实施例4)。图5 描述了使用分泌由构建体#217GLP-l(7-37)-IP2-GLP-l (7-37)产生的GLP-1 肽CMl的经稳定转染hTERT-MSC细胞克隆79TM217/18K5的上清液和作为对照的合成 GLP-I (7-37)进行的血浆稳定性动力学(体外)。结果获自三个独立的实验。使用GLP-I(活 性)ELISA (Linco)测定活性 GLP-I。图6 显示以下所示肽的蛋白质印迹。给出以下值SEQ ID NO=I(IDlsyn)对应于 GLP-I (7-37)，31 个氨基酸，3. 3kD ；SEQ ID NO 8 (ID8syn, CM3)对应于 GLP-I (7-37) -IP2，46 个氨基酸，5. IkD ；SEQ ID NO 7 (ID7rec, CM2)对应于 GLP-1 (7-37)-IP2-RR-GLP2，83 个氨基 酸，9. 4kD ；SEQ ID NO 6 (ID6syn, CMl)对应于 GLP-I (7-37) -IP2-RR-GLP1 (7-37)，79 个氨基 酸，8. 7kD(还参见实施例5)。图7 说明在生物测定细胞系111CH0349/18中GLP-I受体介导的cAMP增加的 剂量响应曲线。使用分泌由构建体#217GLP-1 (7-37)-IP2-GLP-1 (7-37)产生的CMl的79TM217/18K5细胞的连续稀释条件培养基进行刺激。在亲代hMSC_TERT细胞系中未发现 可检测的cAMP响应。该图从5个独立实验制得。确定在cAMP生物测定中产生半最大效应 (ED50)的肽剂量为353pM(还参见实施例6)。图8 描述了用于瞬时和稳定基因表达的示例性载体。该载体由两个分开的转录 单元组成，一个转录单元用于目的基因(GOI)，一个转录单元用于自杀基因HSV胸腺嘧啶核 苷激酶和抗性基因杀稻瘟菌素(blasticidin)的融合。对于第一转录单元，使用人类泛素 B启动子，并且对于第二转录单元，使用人类铁蛋白启动子(还参见实施例9)。图9 说明了在事先使本文定义的(球形)微囊所用的细胞永生化之后对所述细 胞进行的表征。从图9A可以看出，永生化细胞与作为未永生化的其对应物相比，仍然能够 分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞(左，右)。例如使用为此处使用的原代细胞的特征的 ⑶44和⑶166表位标记物，通过流式细胞术所示，永生化细胞具有成纤维细胞形态以及比 短命MSC (mortal MSC)更均勻的尺寸和粒度。永生化细胞表达与其未永生化对应物相同的 CD标记物(参见图9B)。图10 显示C末端延长的GLP-I类似物CMl的抗凋亡功效。通过添加终浓度分别 为10 μ g/ml和100 μ g/ml的蛋白生物合成抑制剂环己酰亚胺(cycloheximide, CHX)，在 RIN-5F细胞中诱导凋亡。不同浓度的重组大肠杆菌产生的二聚GLP-I融合蛋白CMl的存在 引起细胞生活力的显著(P < 0. 01)增加，在温育M小时后对细胞生活力定量。图11 是使用在治疗AMI和MI中所用的编码和分泌GLP-I的(球形)微囊的创 造性概念的示意图。将诸如间充质干细胞、间充质基质细胞或同种异体细胞等细胞封装在 较薄的选择性渗透的藻酸盐基质中，形成编码和分泌GLP-I的(球形)微囊。藻酸盐基质 对于供应封装细胞的氧和营养物以及由所述细胞编码和分泌的GLP-I或GLP-I融合蛋白是 可渗透的。另一方面，如此处所述，细胞和免疫系统的成分不能通过该屏障。左使用编码 和分泌GLP-I的(球形)微囊的创造性概念的示意图。纯藻酸盐的层(灰色)围绕含有核 珠(奶油色)的细胞。右体外编码和分泌GLP-I的(球形)微囊。图12显示其中使用藻酸盐珠(A)或创造性(球形)微囊(细胞珠(CellBeads)) (B)治疗的冠状动脉已经栓塞(黑色虚线)的心脏的宏观病理学。(A)上白色勾勒出的区 片表示在心脏表面上可见的梗死区域，而在(B)中见到非常小的梗死区域。图13 显示在使用藻酸盐对照以及创造性(球形)微囊(细胞珠)治疗的栓塞心 脏表面上的LV梗死区域的％。图14:显示栓塞前、栓塞后立即和栓塞后4周的％射血分数，证明了创造性(球 形)微囊(细胞珠)组带来的恢复。图15 显示在可以鉴定动脉内珠递送后，在梗死区(IZ)区域、边界区(BZ)区域和 远端区的受控梗死之后，猪心脏的中段LAD (LAD=左前降支(LAD)冠状动脉)的组织切片 (从左到右)。图16 显示动脉内珠递送后4周在梗死组织和远端组织中GLP-I受体的蛋白质印 迹分析(左总体右分别是梗死区和远端区)。实验确定了在健康猪模型中使用GLP-I的 有说服力的基本原理。使用蛋白质印迹方法对梗死后4周的心脏样品进行的分析确定，猪 心脏内的细胞拥有GLP-I受体。图16显示，该受体确实存在(使用GAPDH作为加载对照) 并且在编码和分泌GLP-I的创造性(球形)微囊(细胞珠)或藻酸盐对照之间在梗死区中或在远端区中没有显著差异。图17 显示假性血友病因子(von Willibrand Factor)的免疫化学组织切片，显 示编码和分泌GLP-I的创造性(球形)微囊(细胞珠)对心脏中血管发生的作用。为此目 的利用假性血友病因子抗体染色程序对来自梗死边界区和远端区的心脏切片进行染色。图18:显示当使用图17的假性血友病因子抗体染色程序染色时，动脉内递 送4周后编码和分泌GLP-I的创造性(球形)微囊(细胞珠)的血管发生作用的结果 (A)总体和⑶按照区域。血管密度的分析表明，与对照-总体(图18(A))和按照区 域(图18(B))相比，使用GLP-I细胞珠递送的心脏也含有显著更多的血管。在LV区内 可以看到该模式(左心室尖(apex-LV) :39. 25士7. 5vs 6. 8士2. 2 ;P = 0. 002和中段LV 34. 5士3. 8vsl4. 6士6. 2 ;P = 0. 04)。关于血管尺寸，在对照和GLP-I细胞珠组中测定直径 为4μπι IOym血管都是最丰富的。图19 显示证明在猪心肌中的炎性细胞浸润的组织切片，以及在来自动脉内珠递 送4周后的组织切片的炎性细胞浸润的染色。结果示于图20中。图20 显示证明在猪心肌中的炎性细胞浸润的图19的组织切片的结果。在来自动 脉内珠递送4周后的组织切片的炎性细胞浸润的染色显示，与对照相比，编码和分泌GLP-I 的创造性(球形)微囊(细胞珠)的炎性细胞的量统计学上更多(图20 (A)&(B))。这表明 这些诸如已知可由hMSC细胞产生的单核细胞趋化因子等因子释放的旁分泌效应，负责将 这些重要的细胞(单核细胞和嗜中性粒细胞)募集到梗死区域。图21 描述了动脉内珠递送4周后猪心肌的TUNEL染色。结果示于图22中。图22 显示图21的动脉内珠递送4周后猪心肌的TUNEL染色结果。通过动脉内 珠递送4周后的组织切片的TUNEL染色评价凋亡显示，与对照相比，编码和分泌GLP-I的创 造性(球形)微囊(细胞珠)的凋亡细胞(TUNEL+)统计学上更少(图22 (A) & (B))。图23 描述了 160 μ m的编码和分泌GLP-I的创造性(球形)微囊(细胞珠)的 明视野图像(A)和生活力染色(B)的示例性显微照片，表明了这些创造性(球形)微囊的 示例性内径和总直径。在以下实施例中进一步说明本发明。但是，本发明的范围不限于以下所示实施例 的内容。
实施例实施例1遗传构建体的制备 以合成方式合成GLP-I (7-37) cDNA的编码序列，如图Ia中所示，其依次包括 HincII和EcoRl位点。单独地合成图Ib中所示的cDNA，如图Ib中所示，其包括GLP-I (7-37) 的编码序列、IP2以及用于SfoI, EcoRI和XbaI的限制性位点。为了将GLP-I导向分泌途 径，使用异源性的基质溶素3的信号序列(Acc号NM_005940)。因此，从人类RNA进行逆转 录酶PCR扩增编码基质溶素信号和前导序列的cDNA，并且将其与图Ia或图Ib的构建体一 起使用，以分别形成图Ic和图Id中所示的构建体。 将图Ia构建体的HincII/EcoRI片段克隆到图Id序列的SfoI位点中，以形成构 建体图le。类似地，将图Id的EcoRI片段克隆到真核表达质粒的EcoRI位点中，以制备图If中所示的构建体。为了形成图Ig中所示的构建体，将图Ib中所示的构建体的HincII/ XbaI片段重复地克隆到图Id中所示的构建体的SfoIAbaI位点中。图Ih显示编码基质溶 素前导和信号序列的合成的、密码子经优化的序列，其被缩短的内源性内含子序列隔断，与 编码人类GLP-I (7-37)、IP2和GLP-2 (1-35)的序列融合。构建体图Ih的DNA序列是SEQ ID N0:16，而SEQ ID NO 15也显示所翻译肽的序列。同样合成的是图Ii和Ij中的序列。通过将图Ij的Nael/BssHII片段克隆到图 Ih的Nael/BssHII线性化序列中，将其用于形成图Ik中的构建体。构建体图Ik的DNA序 列是SEQ ID N0:14，而SEQ ID NO 13也显示所翻译肽的序列。图11的构建体通过图Ih 序列的BssHII消化和再连接而形成。构建体图11的DNA序列是SEQ ID NO :18，而SEQ ID NO 17也显示所翻译肽的序列。图Im的构建体通过将图Ii的序列的Afel/BssHII片段克 隆到图Ih的Afel/BssHII线性化序列中而形成。构建体图Im的DNA序列是SEQ ID NO 20，而SEQ ID NO 19也显示所翻译肽的序列。此处构建体可由本领域技术人员使用常规技术制备。实施例2哺乳动物细胞的转染、克隆选择和GLP-I表达细胞的来源HEK293 (人类胚胎肾细胞系，#ACC 305，DSMZ Cell Culture Collection，德国)，AtT20(小鼠 LAFl 垂体瘤细胞系，#87021902, European Cell Culture Collection, UK)，hTERT-MSC细胞由丹麦欧登塞大学医院的Kassem教授制得和提供。为了转染IO6个细胞，使用0. 5 μ g 2 μ g的具有不同GLP-1构建体的质粒DNA。 如实施例 1 中所述生产构建体。如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等 1994ff Harvard Medical School Vol2.，Unit 9. 1)所述，使用标准磷酸钙共沉淀法转染 HEK293 细胞。如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等· 1994ff，Harvard Medical School Vol 2. , Unit 9.4)所述，使用 FuGene (Roche)转染 AtT20 细胞。使用核 转染技术(Amaxa)进行hTERT-MSC细胞的转染，所述核转染技术是基于电参数和细胞-类 型特异性溶液的组合的非病毒方法。使用核转染装置(程序C17)和核转染溶液VPE-1001， 获得>60%的转染效率。转染后48小时，通过向培养基中添加选择剂杀稻瘟菌素Qyg/ ml)，进行对具有将DNA稳定整合到染色体中的细胞克隆的选择。12 15天后，可以分离稳 定转染的细胞克隆并进行扩增以用于表征。在hTERT-MSC细胞和HEK293细胞中测定不同GLP-I构建体的瞬时表达。在单 聚GLP-I构建体#103和#317 (仅具有一个拷贝的GLP-I (7-37)中仅能观察到少量的活性 GLP-I水平，而在hTERT-MSC细胞中和在HEK293细胞中都观察到二聚GLP-I构建体#217(具 有作为成分⑴和作为成分(III)的GLP-I (7-37))的表达的巨大增加。结果总结于图2。 GLP-I构建体#159(具有作为成分(II)的4个IP2拷贝)的延长未导致进一步的增加(未 示出)。用不同构建体转染hTERT-MSC细胞后，选择稳定表达GLP-I的克隆。表达水平示于 表1。表 权利要求
1.编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽的细 胞在制备用于治疗急性心肌梗死(AMI或MI)的药物中的应用，其中，将所述编码和分泌 GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽的细胞封装在球形微囊中 以防止所治疗患者的免疫系统的应答。
2.如权利要求1所述的应用，其中所述球形微囊优选包含球形核和至少一个表面涂布层，其中，所述球形核包含交联聚合物和编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-I 或其片段或变体的融合肽的细胞的混合物，或由交联聚合物和编码和分泌GLP-1、其片段或 变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽的细胞的混合物组成；和其中所述至少一个表面涂布层包含交联聚合物或由交联聚合物组成。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中，所述球形微囊的总直径为约120μ m 约 800 μ m、约120 μ m 约700 μ m、约150 μ m 约650 μ m或约165 μ m 约600 μ m,或者甚至 约120 μ m 约300 μ m、约150 μ m 约250 μ m、约165 μ m 约225 μ m或约180 μ m 约 200 μ m,包括约 180 μ m、185 μ m、190 μ m 或 200 μ m。
4.如权利要求1 3中任一项所述的应用，其中，所述细胞为编码和分泌GLP-I、其片 段或变体或者包含GLP-I或其片段或变体的融合肽的间充质干细胞、间充质基质细胞、人 类间充质干细胞、源自人类间充质干细胞的分化细胞、同种异体细胞或自体细胞。
5.如权利要求2 4中任一项所述的应用，其中，所述交联聚合物选自包含生物聚合物 和藻酸盐的组。
6.如权利要求2 5中任一项所述的应用，其中，所述核和/或所述至少一个表面涂布 层的交联聚合物包含浓度相同或不同的化学上相同的聚合物，其中所述聚合物还可以具有 不同的分子量和/或可以不同地进行交联。
7.如权利要求1 6中任一项所述的应用，其中，所述球形微囊包括1层、2层、3层、4 层、5层、5 10层或更多层表面涂布层。
8.如权利要求1 7中任一项所述的应用，其中，所述球形微囊包括由聚阳离子组成的 另外的外部表面涂布层。
9.如权利要求1 8中任一项所述的应用，其中，所述GLP-I是选自由以下肽组成的组 中的肽a)包含GLP-I的第7-35位氨基酸的肽；或者b)包含GLP-I的第7-36位氨基酸的肽或GLP-1(7-36)酰胺；或者c)包含GLP-I的第7-37位氨基酸的肽；或者d)包含以下式II的序列的肽:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-Xa a22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa3 6_Xaa37,其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ； Xaa 18 是 Ser > Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ； Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或酰胺或不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺 或不存在；或者e)何含以下式III的序列的肽Xaa7~Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa 23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val, Leu、Ile 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或不 存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或不存在；或者f)与此处a) e)中的任何肽显示有至少80%同一性的肽。
10.如权利要求1 8中任一项所述的应用，其中，所述GLP-I融合肽或其片段或变体 包含成分(I)和成分(II)，其中N末端的成分(I)选自由以下序列组成的组或者包含以下序列的组a)GLP-I (7-35，7-36 或 7-37)序列，或b)序列SEQ ID NO :1 ；或c)包含以下式II的序列的肽或由以下式II的序列组成的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-Xa a22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa3 6_Xaa37,其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ； Xaa 18 是 Ser 、 Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ； Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或酰胺或不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺 或不存在；或d)包含以下式III的序列的肽或由以下式III的序列组成的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala,Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或不 存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或不存在；或者e)与a) d)中任何序列的序列具有至少80%序列同一性的序列；并且成分(II)的成分(II)C末端选自至少9个氨基酸的肽序列或其功能片段或变体。
11.如权利要求10所述的应用，其中，所述的GLP-I融合肽的成分(II)选自a)含有序列 SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI), SEQ ID NO :27 (DFPEEVAI)、SEQ ID NO: 28 (RDFPEEVA)或 SEQ ID NO :29 (RRDFPEEV)、SEQ ID NO :30 (AADFPEEVAI)、SEQ ID NO: 31(ADFPEEVA)或 SEQ ID NO :32 (AADFPEEV)、或者与 SEQ ID NO :22、27、28、29、30、31 或 32 具有至少80%序列同一性的序列的肽序列；或b)含有序列SEQ ID NO :23(RRDFPEEVAIVEEL)或 SEQ ID NO :24 (RRDFPEEVAIAEEL)、或 SEQ ID NO 33 (AADFPEEVAIVEEL)或 SEQ ID NO :34 (AADFPEEVAIAEEL)、或者与 SEQ ID NO: 23、24、33或34具有至少80%序列同一性的序列的肽序列；或c)含有序歹IjSEQ ID NO 2 (RRDFPEEVAIVEELG)、SEQ ID NO 3 (RRDFPEEVAIAEELG)、SEQ ID NO :35(AADFPEEVAIVEELG)或 SEQ ID NO :36 (AADFPEEVAIAEELG)、或者与 SEQ ID NO :2、 3、35或36具有至少80%序列同一性的序列的肽序列。
12.如权利要求10或11所述的应用，其中，所述GLP-I融合肽的成分⑴和成分(II) 直接相连或经由连接物序列相连。
13.如权利要求10 12中任一项所述的应用，其中，所述GLP-I融合肽替代性地包含 成分(III)，或者除包含成分(I)和成分(II)之外还包含成分(III)，其中如果所述融合蛋 白中存在成分⑴和成分(III)，则成分(III)可以与成分⑴的C末端和/或成分⑴的 N末端相连；或者其中如果所述融合蛋白中存在成分(I)、成分(II)和成分(III)，则成分 (III)可以与成分(II)的C末端和/或成分(I)的N末端相连。
14.如权利要求13所述的应用，其中，成分(III)包含至少4个氨基酸残基、至少10个 另外的氨基酸残基、至少20个另外的氨基酸残基或至少30个另外的氨基酸残基；并且成分 (III)优选选自a)胰高血糖素原中GLP-2的N末端序列，或b)GLP-I (5-37、6-37 或 7-37)序列，或c)包含以下式II的序列的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-Xa a22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa3 6_Xaa37,其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ； Xaa 18 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ； Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或酰胺或不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺 或不存在；或d)包含以下式III的序列的肽Xaa7~Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa 23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或不 存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或不存在；或者e)与a) d)中任何序列的序列具有至少80%序列同一性的序列；或f)其中成分(III)含有序列SEQID NO :4或5或者与SEQ ID NO :4或5具有至少80% 序列同一性的序列。
15.如权利要求10 14中任一项所述的应用，其中，所述GLP-I融合肽另外地含有或包含作为成分(IV)的载体蛋白，特别是转铁蛋白或白蛋白。
16.如权利要求1 15中任一项所述的应用，其中，所述GLP-I融合肽包含选自以下 序列的肽序列或由选自以下序列的肽序列组成SEQ ID NO 6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44, SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47 或 SEQ ID N0:48，或者与 SEQ ID NO: 6、7、8、10、11、12、26或37 48具有至少80%序列同一性的序列。
17.如权利要求1 16中任一项所述的应用，其中，所述球形微囊的核中的细胞经工 程化从而另外地分泌选自由以下因子组成的组中的因子抗凋亡因子、生长因子、VEGF、促 红细胞生成素(EPO)、抗血小板药、抗凝血药和抗血栓形成药，和/或分泌作为旁分泌因子 的内源性蛋白或肽，所述旁分泌因子以治疗水平通过所述囊释放，并且选自VEGF、IL6、IL8、 GDNF、NT3 禾口 MCPl0
18.如权利要求1 17中任一项所述的应用，其中，通过直接注入心脏组织，或通过 经供给受影响心脏组织的微动脉进行的血管内递送，将所述球形微囊植入哺乳动物AMI或 AMI后患者的心肌的受影响区域。
全文摘要
本申请涉及编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-1、其片段或变体的融合肽的细胞(诸如间充质细胞干细胞或间充质基质细胞或任何另外的合适细胞)在治疗急性心肌梗死(AMI或MI)中的应用，其中将编码和分泌GLP-1、其片段或变体或者包含GLP-1或其片段或变体的融合肽的细胞封装在(球形)微囊中以防止所治疗患者的免疫系统的应答。本申请还涉及这些(球形)微囊或者含有这些细胞或(球形)微囊的药物组合物在治疗急性心肌梗死(AMI或MI)中的应用。
文档编号C12N5/00GK102149370SQ200980135623
公开日2011年8月10日 申请日期2009年9月11日 优先权日2008年9月12日
发明者克里斯蒂娜·沃尔拉普, 埃里克·索内斯, 安德鲁·伦哈德·刘易斯, 彼得·威廉·斯特拉特福德 申请人:生物相容英国公司