专利名称：一种表达人干扰素α的酵母信号肽突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种表达人干扰素α的酵母信号肽突变体，及一种利用该信号肽突变体生产干扰素α的方法，以及有关的表达载体与工程细胞的构建、人干扰素α的表达和纯化工艺。
背景技术：
近一个世纪以来，许多病毒性疾病如乙肝、丙肝及肿瘤严重威胁着人们的健康。然而对这些疾病的治疗以前尚无有效而可靠的治疗药物。近年来，国内外研究表明，一种来自人和动物细胞受到合适刺激时产生的具有高度生物活性的蛋白--干扰素，作为细胞因子所表现出的抗病毒、抗肿瘤功能，给患者带来极大的希望。
干扰素是在1957年，由英国的Isaacs和瑞士的Lindenmann在研究流感病毒的干扰现象时首先发现的。由病毒感染的细胞产生的一种因子，能作用于其他细胞干扰病毒的复制。根据产生干扰素细胞来源不同、理化性质和生物学活性的差异，可分为α-干扰素(interferonα，IFN-α)、β-干扰素(interferonβ，IFN-β)和γ-干扰素(interferonγ，IFN-γ)。
IFN-α主要由白细胞、成纤维细胞等在细菌、DNA或RNA病毒、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(Poly I-C)、多核苷酸等刺激物诱导下产生。IFN-α在pH2或pH11以及热(56℃)条件下仍稳定。
IFN-α分子含166～172个氨基酸，无糖基，分子量约19kDa左右，不同种属之间同源性70％左右。IFN-α分子含有4个Cys，Cys1-99，Cys29-139之间形成两个分子内二硫键。IFN-α由2个亚族(subfamily)组成，分别称为IFN-α1和IFN-α2。IFN-α的生物学作用有一定的种属特异性。
IFN-α的主要生物学作用有(1)抗病毒作用IFN-α具有广谱的抗病毒作用。(2)抑制某些细胞的生长如抑制成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和造血细胞的增殖。(3)免疫调节作用促进大多数细胞MHCI类抗原的表达，活化NK细胞和CTL。(4)抑制和杀伤肿瘤细胞IFN-α杀伤肿瘤细胞主要是通过促进机体免疫功能，提高巨噬细胞、NK和CTL的杀伤水平。
目前已知干扰素并不能直接杀伤病毒，而是诱导宿主细胞产生数种酶，干扰病毒的基因转录或病毒蛋白组分的翻译。它们具有抗细胞感染微生物、抑制细胞分裂、参与免疫调节等多种功能。经多年临床表明，α干扰素对20多种病毒性疾病有效，对自然流感、婴幼儿病毒性肺炎等有显著的短期预防效果，对乙肝的疗效已得到公认，而对丙肝的治疗，目前除干扰素外，还无特效药物。
采用基因工程新技术大量生产IFN是IFN研究工作中的重大突破。自从1979年底日本的Taniguchi等报道IFN-β重组成功后，几年内许多国家都相继报道各类重组IFN获得成功。国内侯云德教授1982年率先重组人干扰素α1b获得成功，现由长春生研所生产。
基因工程方法生产都采用大肠杆菌、枯草菌、哺乳动物细胞和昆虫细胞等多种表达系统来表达人干扰素α，但它们或多或少存在某些不足，主要是提纯的困难，纯化不完全，一些与之分子量非常接近的杂蛋白难以去除干净。
本发明系统提供了一种酵母α信号肽突变体，利用该突变体，采用新型毕赤酵母表达体系可分泌表达人干扰素α，可以大大简化纯化工艺，同时通过优化改进发酵工艺，提高人干扰素α的表达水平，可以获得高表达、高得率、高纯度、极具产业化价值的人干扰素α。
发明内容
本发明的目的就是提供一种酵母的α信号肽突变体(NS)。
本发明的另一目的就是提供一种利用该信号肽突变体高效简便的生产人干扰素α(hIFN-α)的方法。
本发明的另一目的就是提供用于该方法的表达载体及工程细胞。
在本发明的第一方面，就是提供了一种酵母的α信号肽突变体(NS)的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一优选例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种应用本发明提供的酵母α信号肽突变体(NS)生产人干扰素α的方法。
在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的核苷酸序列以及任何一个人干扰素α的成熟肽基因序列。
在另一优选例中，所述的表达载体是pPIC9K/(NS+hIFN-α)。
在本发明的第四方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，整合有权利要求3所述的表达载体。
在另一优选例中，所述的工程细胞是毕赤酵母(Pichia Pastoris)。
在本发明的另一优选例中，所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有2-30拷贝的人干扰素α基因编码序列。
在本发明的另一优选例中，所述的毕赤酵母工程细胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
在本发明的第四方面，提供了一种生产人干扰素α蛋白的方法，该方法包括步骤a)在适合的表达条件下，培养如权利要求5所述的宿主细胞，从而分泌表达出人干扰素α蛋白；较佳地，所述的宿主细胞是毕赤酵母。
b)分离纯化出分泌表达的人干扰素α蛋白。
在本发明的另一优选例中，所述的步骤(a)的培养条件包括培养分为培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到OD600为40-200，诱导时间为12-100hr，发酵及诱导温度保持在25-32℃，微量元素的量为0.1-2ml/L，诱导期的pH值为3-10，诱导期甲醇浓度控制在0.1-5％。
在本发明的另一优选例中，诱导过程还可以添加酪蛋白水解物(CA)、蛋白胨(peptone)、胰蛋白胨(Tryptone)、精氨酸等作为保护剂。
在本发明的另一优选例中，所述的步骤(b)包括步骤(i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除沉淀，获得发酵上清液；(ii)对发酵上清液进行超滤浓缩，更换缓冲液；(iii)层析纯化，所述的层析选自阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、及其组合。
图1是pPIC9k/(NS+hIFN-α2b)表达质粒的构建路线图。
具体实施例方式
本发明人通过深入而广泛的研究，对酵母的α信号肽进行了突变，并提出一种利用该信号肽突变体生产人干扰素α的方法，即该信号肽突变体加上任何一个人干扰素α基因序列，将该序列转入甲醇利用型毕赤酵母(P.pastoris)，并且优化了发酵与纯化工艺，从而实现了人干扰素α高效分泌表达。在此基础上完成了本发明。
本发明根据在酵母中表达人干扰素α时纯化存在的问题，经过深入研究，对酵母α信号肽序列进行了突变，缺失了其第74，75，76位氨基酸和第85位之后的氨基酸，突变后的序列(NS)见SEQ ID NO2，突变的信号肽序列NS并不影响它原来的靶向功能。
根据人干扰素α的天然成熟肽氨基酸序列，全基因合成带有本发明提供的酵母信号肽突变体NS的人干扰素α蛋白的序列，将该序列克隆到pUC19中测序验证后，用分子克隆的常规方法，克隆入表达载体，转化、整合入P.pastoris宿主细胞染色体，通过施加抗生素筛选出多拷贝整合的转化细胞，进而筛选出高表达工程细胞。在另一优选例中，所述的表达载体是pPIC9K/(NS+hIFN-α)。
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。在本发明中，工程菌表达的人干扰素α发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。例如，合适的培养基包括(但不限于)以下组成(iv)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，总浓度0.1-3％；无机氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等铵盐，浓度0-1.5％。
(v)无机盐包括磷酸盐、枸盐酸盐、Mg2+盐等。较佳地，磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-10；Mg2+盐0-5mM。
(vi)在培养基中添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM。
(vii)根据M9培养基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(viii)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是单一碳源，也可以是混合碳源。较佳地，碳源选自下组甘油浓度为0.1-3％；乳糖浓度为0.1-3％；葡萄糖浓度为0.1-1.5％。
为大规模获得人干扰素α，需要在发酵罐中进行表达培养。本发明研究了中试发酵工艺，优化后提高了人干扰素α的表达水平。
在发酵表达后，对表达的人干扰素α蛋白进行分离。通常，发酵样品先以离心、过滤等方式获得发酵液上清。然后进行初步纯化和层析包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
经不同层析过程比较，优化的纯化方法包括1.对发酵样品通过离心和/或过滤方式获得发酵上清液；2.通过盐析和/或超滤进行初步纯化后，或直接通过离子交换、分子筛层析方法，从而得到纯度达到95％的纯品。
纯品的活性按细胞病变抑制法进行测定，结晶紫染色，用酶标仪测定D570值，最后以国际标淮品校正活性单位。
纯化后人干扰素α可用常规技术制成各种剂型。
本发明以人干扰素α2b基因为例，具体描述了利用本发明提供的酵母的α信号肽突变体生产人干扰素α的方法。
在本发明的一个实例中，获得了带有本发明提供的酵母的α信号肽突变体的人干扰素α2b基因，构建了生产人干扰素α2b的P.pastoris酵母表达工程细胞，甲醇诱导，高水平分泌表达，不需变复性。
在本发明的另一个实例中，经过发酵工艺的优化，进一步提高了人干扰素α2b的表达量。
在本发明的另一个实例中，由于蛋白分泌表达，发酵上清可直接纯化，纯化工艺简单，纯化后可得到纯品200mg/L。
纯化后原液加入适当辅料，制成人干扰素α2b的注射用粉针剂。初步稳定性试验表明，该粉针剂稳定。
中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液可获得人干扰素α2b纯品200mg，比活约2×107IU/mg以上。适合产业化生产。
本发明的优点在于(1)纯化工艺简便，回收率高。由于对酵母α信号肽突变之后，与人干扰素α分子量极其接近的蛋白条带消失，因此简化了纯化工序，使纯化后样品纯度大大提高，使得大规模生产人干扰素α成为可能。
(2)选用的是毕赤酵母宿主细胞，能对其表达产物进行合适的修饰和空间折叠。
(3)带有本发明提供的酵母的α信号肽突变体的人干扰素α基因非常适合在毕赤酵母中表达，具有高表达、高稳定的特点。
(4)通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平提高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1表达质粒的构建和高表达工程菌株的获得根据酵母α信号肽天然氨基酸序列，对其进行了突变，获得了酵母的α信号肽突变体(NS)(见SEQ ID N01)，其编码序列为SEQ ID NO2，获得人干扰素α2b基因序列(见SEQ ID NO3)，其编码序列为SEQ ID NO4，全基因合成带有α信号肽突变体(NS)的人干扰素α2b的基因序列，将该基因序列克隆到pUC19中并测序验证。
表达载体构建方法见图1。通过PCR扩增得到带有α信号肽突变体(NS)的人干扰素α2b基因，用BamHI+EcoRI双酶切(MBI，2*TangoTM，37℃)PCR产物及pPIC9K质粒(质粒购自Invitrogen公司)。将两个片段用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌DH5α(购自Promega公司)，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切/PCR鉴定筛选出阳性克隆。获得含有干扰素α2b的重组质粒pPIC9K/(NS+hIFN-α2b)。
表达质粒pPIC9K/(NS+hIFN-α2b)经测序验证后，用Sal I酶切线性化，电穿孔法转化进入毕赤酵母GS115(购自Promega公司)，涂于MD平板上于30℃培养至有转化子长出。再用点种法鉴定酵母转化子的G418抗性。依次用含G418浓度为1、2、3、4mg/mL的YPD平板筛选高抗性转化子，并进行小摇表达筛选得到hIFN-α2b高表达的工程酵母菌株。根据其消耗甲醇的速度，判断此工程细胞株为Mut+。
实施例2不同pH对表达水平的影响取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1∶10的比例二级接种于50ml培养基的500ml三角烧瓶中(每个条件有副管)，培养24hr左右，1％甲醇诱导，诱导阶段的pH需调节(在BMMY培养基中直接用磷酸盐缓冲体系调节pH)。诱导24hr取样，同时测定OD及pH，再加1％甲醇继续诱导。共诱导48hr。诱导前、诱导不同时间样品检测SDS-PAGE。
实验结果表明在摇瓶水平表达hIFN-α2b的最适pH在5～9之间，最佳pH5-7。
实施例3诱导阶段添加不同蛋白保护剂对表达水平的影响取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1∶10的比例二级接种于250ml BMGY的1L三角烧瓶中，培养4~8hr左右，上罐发酵，pH5.0、温度20℃、D0＞35％，待溶氧上升后流加50％甘油。待甘油耗尽，溶氧再次上升后用甲醇开始诱导，逐渐提速。诱导阶段将浓度为10％的CA、Peptone和Tryptone各300ml流加入罐(5L发酵罐，发酵上清3L)，诱导48hr结束。样品检测SDS-PAGE和蛋白含量以确定诱导阶段的最佳蛋白保护剂。
实施例4人干扰素α2b蛋白的纯化将高表达菌株扩大体积进行培养并诱导48h，4℃下5000rpm离心10分钟，获得发酵上清液，然后层析。
(1)层析介质DEAE Sepharose FF平衡液20mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH8.0洗脱液20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.0(2)层析介质SP Sepharose FF平衡液醋酸盐缓冲液，pH4.0洗脱液醋酸盐缓冲液，pH4.0+1M NaCl(3)层析介质Sephecryl S-100以20mM pH7.4的PBS溶液平衡洗脱，收集主峰。
经过以上纯化工艺，最后可得蛋白纯品200mg/L，纯度95％以上。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海新生源医药研究有限公司<120>一种表达人干扰素α的酵母信号肽突变体<160>4<210>1<211>246<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)…(246)<223>酵母的α信号肽突变体核苷酸序列<400>1atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg aagaaggggt atctctcgag240aaaaga 246<210>2<211>82<212>PRT<213>智人<400>2Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45
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<213>智人<400>4Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160Leu Arg Ser Lys Glu16权利要求
1.一种酵母的α信号肽突变体(NS)的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求1所述的核苷酸序列。
3.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体还含有一个人干扰素α基因。
4.一种工程细胞，其特征在于，它整合有权利要求3所述的表达载体。
5.如权利要求4所述的工程细胞，其特征在于，它是毕赤酵母。
6.一种生产人干扰素α的方法，其特征在于，该方法包括步骤(a)在适合的表达条件下，培养如权利要求5所述的工程细胞，从而分泌表达出人干扰素α蛋白；(b)分离纯化出表达的人干扰素α蛋白。
全文摘要
本发明提供了一种酵母的α信号肽突变体(NS)，还提供了一种应用本发明提供的酵母信号肽突变体(NS)生产人干扰素α的方法，利用该突变体，采用新型毕赤酵母表达体系可分泌表达人干扰素α，大大简化纯化工艺，通过优化改进发酵工艺，提高人干扰素α的表达水平，可以获得高表达、高得率、高纯度、极具产业化价值的人干扰素α。同时以人干扰素α2b为例，具体实施了本发明提供的酵母信号肽突变体(NS)生产人干扰素α的方法。
文档编号C12P21/02GK1873007SQ200510026289
公开日2006年12月6日 申请日期2005年5月30日 优先权日2005年5月30日
发明者孙九如, 任军, 黄阳滨, 杜碧金, 丰涛 申请人:上海新生源医药研究有限公司