一种利用酵母突变株检测纳米材料细胞毒性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用酵母突变株快速检测纳米材料细胞毒性的方法，其步骤：A、酵母特异基因的敲除：①提取酿酒酵母基因组；②构建基因敲除组件；③醋酸锂转化法将基因敲除组件转入酵母细胞；④筛选得到基因敲除酵母；B、纳米材料悬浮液配置；C、酵母受试纳米材料；D、酵母受试后细胞浓度检测；E、结果计算和分析：扣除空白，计算生长抑制率/细胞活力；F、根据纳米材料对酵母生长抑制率大小，得出纳米材料对酵母菌的半数效应浓度EC50，进而判定纳米材料毒性大小。方法易行，操作简便，检测速度快，灵敏度高，价格低廉，适用范围广，可以用于检测不同水溶液中纳米材料对生物的细胞毒性。
【专利说明】一种利用酵母突变株检测纳米材料细胞毒性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属新型材料的微生物毒性检测领域，更具体涉及一种利用酵母突变株快速 检测纳米材料细胞毒性的方法，它适用于纳米材料的环境影响评价。
【背景技术】
[0002] 纳米科学是20世纪80年代末发展起来的新兴学科，与信息科学、生命科学并列为 21世纪最有前途的三大新技术科学领域。纳米材料因其纳米尺度和纳米结构而具有优越的 磁性、导电性、反应活性、光学性质等，这些独特的性能使它们能够广泛应用于传感器、催化 齐U、超导体、化妆品、环境保护等多个领域。目前，纳米产品已走出实验室，进入人们的生活， 估计在2011~2015期间，全球在纳米技术上的总投资约为50亿英镑，而与纳米技术相关的 年产值(包括信息和通讯技术）在10000亿美元左右。
[0003] 在纳米材料和纳米产品的生产、使用和处理过程中，纳米材料难免会通过各种途 径进入环境，其独特的物理化学属性将可能给生态环境带来难以预料的影响。越来越多的 研究证实，纳米材料具有一定的生物毒性，已开始被认为是一类潜在的新型污染物。
[0004] 近年来，中国大范围出现雾霾天气，环境问题进入人们的视野，PM2. 5成为人们日 常生活关注的焦点。科学报道指出：粒径在2. 5微米以下的细颗粒物被吸入人体后会直接 进入支气管，干扰肺部的气体交换，引发包括哮喘、支气管炎和心血管病等方面的疾病。而 纳米颗粒的尺度更小，性质更独特(如高表面反应活性)，因此，纳米材料的生物安全问题比 总悬浮颗粒物、PM2. 5等更加复杂。
[0005] 在纳米技术快速发展的今天，随着各类新型纳米材料的大量出现，传统的毒理学 检测方法越来越难以满足要求，迫切需要建立快速检测纳米材料生物毒性的方法。为评价 纳米材料的环境风险提供评估依据的同时，也可以为设计、生产环境无害型纳米材料提供 参考，在保护环境的基础上促进纳米技术的快速发展。
[0006] 酿酒酵母菌属于单细胞真核生物，与大肠杆菌等微生物相比，其结构和功能与高 等生物更相似，并且人类已经完成了对酵母菌的基因组测序，酵母约30%编码蛋白的基因 与哺乳动物编码蛋白的基因高度同源。且酵母菌易于培养，生长迅速，被广泛用于现代生物 学研究，其作为模式生物已被广泛应用于重金属、抗癌物、有机污染物等各种药物的生态毒 理性评价，但目前还鲜有用于纳米材料毒性方面的研究。
[0007] 此外，传统生物毒性检测的方法主要包括体内动物暴露实验和体外动物细胞系暴 露实验。但这两种检测方法都有其不可忽视的缺点，如对动物体内暴露实验来说，缺点包括 样本数量少、个体差异大、暴露时间长、价格昂贵等；而对于动物细胞系暴露实验来说，缺点 有操作技术要求高、对设备和环境要求高，且所用动物血清价格非常昂贵等。这些缺点都限 制了这两种方法在实际生产中的运用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是在于提供了一种利用酵母突变株检测纳米材料细胞毒性的方法， 方法易行，操作简便，为纳米材料的环境安全性评价提供了依据，检测速度快，灵敏度高，价 格低廉，适用范围广，可以用于检测在不同水溶液中纳米材料对生物的细胞毒性。
[0009] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 本发明通过敲除酵母菌中与毒性应激相关的特异基因，如针对纳米金属及纳米金属氧 化物而言，大量研究表明这类纳米材料主要通过自由金属离子、金属离子在细胞内的积累 以及产生的活性氧（R0S)导致的氧化损伤等机制对细胞产生毒性，所以通过敲除酵母细胞 中与氧化应激、膜通透性等相关的基因，能够提高酵母菌受试纳米金属及金属氧化物的敏 感性，进而能够更迅捷更灵敏检测纳米材料的细胞毒性。
[0010] 一种利用酵母突变株快速检测纳米材料细胞毒性的方法，其步骤是： 四基因敲除酵母菌株及五基因敲除酵母 菌株的构建： ①提取酿酒酵母基因组(提取方法参见邢福国、张培军、谭训刚、徐永立《酵母基因组的 提取》《食品科学》2007年03期）； 接种野生型酵母菌到酵母YH)培养基中，30°C，培养16?18h ;离心收集菌体；菌体用 SCED(lmol/L 山梨醇、10mmol/L 柠檬酸钠、10mmol/L EDTA、10mmol/L 二硫苏糖醇）溶液重 悬，加入10mg/ml溶菌酶，37°C温浴lh ;再加入2% (w/v) SDS混匀，-20°C冰冻，然后室温 (20-25°C)震荡溶解，反复3次；向悬浮液中加入5mol/L醋酸钾（pH=8.9)轻轻混匀，离心 5min ;将上清转移到一新的离心管中，加入2倍体积的乙醇，轻轻混匀，室温放置5min后离 心 lOmin;除去上清，将沉淀溶解在 300μ1 TE(10mmol/L Tris-HCl，pH7.4;lmmol/L EDTA， ρΗ8·0)中，加入RNA酶（10mg/ml)，37°C温浴30min ;加入饱和酚及氯仿，并充分混匀，离心 5min ;转移上清到新的离心管中，加入1/2体积的7. 5mol/L醋酸铵（pH=7. 5)和等体积的异 丙醇，-20°C放置20min后离心10min ;除去上清，加入70% (v/v)乙醇漂洗沉淀一次，离心 5min ;风干除去乙醇，用TE溶解酵母DNA。
[0011] ②构建基因敲除组件； ③ 醋酸锂转化法将基因敲除组件转入酵母细胞； ④ 筛选得到基因敲除酵母； 四基因敲除酵母参见专利CN101717736A《一种超高通透性面包酵母及其制备方 法》（专利申请号：CN200910272505)。制备方法为：提取面包酵母基因组DNA，通过特异 性引物，以面包酵母基因组DNA为模板，PCR扩增分别得到CF/^7、基因；将 CF/^7基因中的一段替换为选择性标记基因（尿嘧啶合成酶基因），获得 Z .· J-Ai%基因敲除组件；将基因中的一段替换为选择性标记 基因（组氨酸合成酶基因），获得基因敲除组件；将基因中的一段替 换为选择性标记基因（亮氨酸合成酶基因），获得基因敲除组件；将 Z / 基因敲除组件、cfppiM : 基因敲除组件、转入 S/7说单基因敲除面包酵母，发生同源重组，通过筛选得到^/77^/7办说四基因敲除面 包酵母。五基因敲除酵母参考专利CN102120968A《一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母及 其制备方法》（专利申请号为CN201010594171)，在四基因敲除酵母的基础上，敲除1?%基 因，获得缺失五基因的面包酵母。一种对氧化损伤高敏感性面包酵 母的制备方法是：提取面包酵母基因组DNA，通过特异性引物，以面包酵母基因组DNA为模 板，PCR扩增得到基因，构建得到7a/72 J .· 敲除组件，并将该组件转 入超高通透性面包酵母，发生同源重组，通过筛选得到五基因缺失高敏感性的菌株。
[0012] B、纳米CuO溶液的配制：用酵母液体培养基（SD/YPD)配置纳米材料悬溶液，超声 使其充分分散在溶液中。其中：Yro培养基的配方为：1% (w/v)酵母膏，2% (w/v)蛋白胨， 2% (w/v)葡萄糖，余者为水；SD培养基的配方为：0· 17% (w/v)酵母氮源；0.5% (w/v)硫酸 铵；腺嘌呤，组氨酸，甲硫氨酸，色氨酸的浓度都为20 Pg/ml ;亮氨酸，赖氨酸，缬氨酸的浓 度都为30 Pg/ml。
[0013] C、酵母受试纳米材料：收集在SD/Yro培养基中过夜培养16-18 h处于稳定生长期 的野生型酵母菌 BY4741、四基因敲除酵母和 五 基因敲除酵母(其中野生型酵母菌BY4741，购买自酵母基因敲除工程Saccharomyces Gene Deletion Project,四基因及五基因敲除酵母构建如步骤A中④所示)，4500rpm离心10 min (5804R型，德国Eppendorf公司），倒去上清，将沉淀菌体重新用SD/YH)培养基稀释，30°C， 200rpm培养2 h，再次离心，收集菌体，用SD/YH)培养基洗涤2次，最终用SD/YH)培养基调 节菌液0D600=0. 01 (光程=lcm)。将菌液移取75-10〇μ?至96孔板中，加入0. l-100mg/L的 纳米材料，30°C，200rpm受试24 h。
[0014] D、酵母受试后细胞浓度检测：由于酵母细胞数量与0D6(l(lmi显著正相关，多功能酶 标仪（SpectraMaxM5,美国分子仪器公司）在600nm处检测各孔吸光值。
[0015] E、结果计算和分析：扣除空白，生长抑制率/细胞活力=(1-Tc/CKc) *100%，CKc-空 白对照对应的吸光值；Tc-受试后菌液对应的吸光值。
[0016] F、根据纳米材料对酵母生长抑制率大小，得出纳米材料对酵母菌的半数效应浓度 EC50,进而判定纳米材料毒性大小。
[0017] 以上实验步骤是在酵母液体培养基中进行的，可以模拟在有机物含量较高的水体 中纳米材料的毒性。通过更改受试体系的性质，如D0M、pH、离子强度等，该方法便可模拟在 各种自然水体中纳米材料的毒性。
[0018] 本发明可以有效地快速检测纳米材料的细胞毒性，为评价纳米材料毒性大小提供 依据，同时，本发明检测方法具有以下优点： (1)检测速度快，能够在两天时间内得出结果，评估纳米材料细胞毒性大小。
[0019] (2)灵敏度高，由于提升了酵母细胞受试纳米材料的敏感性，降低了纳米材料的使 用量。
[0020] (3)操作简单，只需掌握简单的无菌操作技术及常用的仪器操作，就能完成实验。 此外，在保证多个平行实验的基础上，相对于繁琐的传统的细菌毒性检测的平板涂布法，结 果更加准确。
[0021] (4)敲除特异基因的酵母突变株，能够长久地保存在-80°c冰箱，且突变株细胞活 力、生理状况等指标能够保持稳定，不同机构和单位还可以共享突变菌株。
[0022] (5)酵母菌作为微生物，样本量大，相对于动物实验，克服了样本数量少、个体差异 大等缺点。同时采用96孔板，能够一次检测多个样品。
[0023] (6)敲除特异基因，通过野生型与基因突变型酵母菌株受试纳米材料的对比，在检 测纳米材料毒性的同时，能够研究特异基因缺失对酵母受试敏感度的影响，进而为研究纳 米材料对细胞毒性的作用机制提供参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为一种使用酿酒酵母野生型菌落形态。
[0025] 如图所示，酵母菌落大小一致，呈白色或乳白色，圆形。
[0026] 图2为一种实施例所用纳米CuO的透射电镜图。
[0027] 纳米CuO颗粒粒径约20 nm，且颗粒大小比较一致，为圆形或椭圆形。
[0028] 图3为一种实施例中酵母野生型及突变型菌株受试纳米CuO时的生长抑制率。
[0029] 由图可知，相对于野生型酵母，纳米CuO对酵母突变株的毒性更大。
【具体实施方式】
[0030] 现将本发明的具体实施例进一步说明于后。
[0031] 实施例1 : 一种利用酵母突变株快速检测纳米材料细胞毒性的方法，其步骤是： 1. 四基因敲除酵母菌株及五基因敲除酵母 菌株的构建：（参见专利CN102120968A《一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母及其制备方 法》及CN101717736A《一种超高通透性面包酵母及其制备方法》）。
[0032] ①提取酿酒酵母基因组，所用野生型酵母菌为BY4741，基因型为 iferaAisJzl 0 (购买自酵母基因敲除工程 Saccharomyces Gene Deletion Project)(提取方法参见邢福国、张培军、谭训刚、徐永立《酵母基因组的提取》 《食品科学》2007年03期）； 酵母基因组提取方法：接种酵母到酵母YH)培养基中，30°C，培养16?18h ;离心收集 菌体；菌体用 SCED(lmol/L 山梨醇、10mmol/L 朽1 樣酸钠、10mmol/L EDTA、10mmol/L 二硫苏 糖醇）溶液重悬，加入l〇mg/ml溶菌酶，37°C温浴lh ;再加入2% (w/v) SDS混匀，-20°C冰 冻，然后室温（20-25°C)震荡溶解，反复3次；向悬浮液中加入5mol/L醋酸钾（pH=8.9) 轻轻混匀，离心5min ;将上清转移到一新的离心管中，加入2倍体积的乙醇，轻轻混匀， 室温放置5min后离心10min ;除去上清，将沉淀溶解在300μ 1 TE(10mmol/L Tris-HCl， ρΗ7· 4 ;lmmol/L EDTA，ρΗ8· 0)中，加入 RNA 酶（10mg/ml)，37°C温浴 30min ;加入饱和酚及 氯仿，并充分混匀，离心5min ;转移上清到新的离心管中，加入1/2体积的7. 5mol/L醋酸铵 (pH=7. 5)和等体积的异丙醇，-20°C放置20min后离心10min ;除去上清，加入70% (v/v)乙 醇漂洗沉淀一次，离心5min ;风干除去乙醇，用TE溶解酵母DNA。
[0033] ②构建:仇^應J-AiW基因敲除组件；将含有沿〇7内切酶位点的上游 引物CF/^7-7和含有5於7内切酶位点的下游引物以酵母细胞基因组DNA为模板，进 行PCR扩增，得到基因，将基因与AiW--AiW片段连接，得到Zl .· .· 仇^應J-AiW基因敲除组件； ③构建::班d基因敲除组件；将含有及^7内切酶位点的上游引物 和含有5^7内切酶位点的下游引物以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增， 得到0. 5kbCWC基因价序列；将含有fe?///内切酶位点的上游引物和含 有5^7内切酶位点的下游引物以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到 0. 3kbCWC基因序列，将基因与Aid片段连接，得到Λ ::班·^基 因敲除组件； ④ 构建:Z汉^基因敲除组件；将含有您///内切酶位点的上游引物和含 有5^7内切酶位点的下游引物以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到 1. 5kb/^/6基因，将基因与MZ/J?片段连接，得到/7办5 Λ 基因敲除组件； ⑤ 将cr/77 Λ ::历Λ ::历Λ 汉泛基因敲除组件转入 577说单基因敲除酵母，筛选得到四基因敲除酵母； ⑥ 五基因敲除酵母是在四基因敲除酵母的基础上构建：其具体构建步骤如下； (1) 、卿7 Λ :基因敲除组件;通过上游引物YAP1-1和含有Sphl内切酶位点的 下游引物YAP1-2以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到2. 5kbYAPl基因，将 7#7基因与仇sJ片段连接，得到7^7 Λ ::仇sJ基因敲除组件； (2) 、将7<3/?7 Λ : 基因敲除组件转入四基因敲除酵母，筛选 得到 _F<3/77cff/77cff/^/7￡/rfe/7(J^ 五基因敲除酵母。
[0034] 2.纳米CuO溶液的配制： 用分析天平称取1. OOOg纳米Cu0(r=20nm，纯度：99. 9%，购自北京纳辰)于1L去离子水 中（18. 2 Μ Ω . cm)，纳米CuO的母液浓度为1 g/L，超声（上海杰理科技有限公司）分散20 min，4 °C避光保存，用前涡旋。
[0035] 3.细胞毒性实验： 接种野生型酵母四基因敲除酵母和 五基因敲除酵母于液体培养基SD中，30°C，200 rpm (恒温摇床)，过 夜培养16?18 h。4500rpm (5804R型，德国Eppendorf公司）收集菌体，SD培养基将菌体稀 释至〇〇_"=〇. 300±0.001 (光程lcm)。继续培养菌体2 h，4500rpm离心收集菌体后，用去 离子水洗涤一次，并用SD培养基将菌体稀释至(?__=0. 010±0. 001 (光程lcm)，受试纳米 CuO。将纳米CuO母液稀释，根据预实验将纳米CuO受试浓度定为10、20、50及100 Pg/ml， 移取菌液及纳米CuO悬浮液各75μ?于96孔板中。将24 h分别作为受试终点，受试终止时， 多功能酶标仪（SpectraMaxM5,美国分子仪器公司）在600nm处检测各孔的吸光值。受试纳 米CuO后酵母菌液各孔吸光值，减去纳米CuO溶液本身吸光值，计算生长抑制率。
[0036] 4.数据处理和分析： 实验设3个平行，实验结果表示为平均数土标准误（Mean 土 SEM)，如下表所示。实 验数据采用SPSS13. 0软件进行t检验及单因素方差分析，p < 0.05表示差异显著。
【权利要求】
1. 一种利用酵母突变株检测纳米材料细胞毒性的方法，其步骤是： 四基因敲除酵母菌株及五基因敲除酵母 菌株的构建： ① 提取酿酒酵母基因组：酵母基因组提取方法，接种酵母到酵母YH)培养基中，30°C， 培养16?18 h;离心收集菌体；菌体用SCE:lmol/L山梨醇、10mmol/L朽1檬酸钠、10mmol/L EDTA、10mmol/L二硫苏糖醇溶液重悬，加入10mg/ml溶菌酶，37°C温浴1 h ;再加入2%w/vSDS 混匀，-20°C冰冻，然后室温震荡溶解，反复3次；向悬浮液中加入5mol/L醋酸钾：pH=8. 9 混匀，离心5min ;将上清转移到离心管中，加入2倍体积的乙醇，混匀，室温放置5min后离 心10min;除去上清，将沉淀溶解在300 μlTE中，加入RNA酶，37°C温浴30min;加入饱和酚 及氯仿，混匀，离心5min ;转移上清到离心管中，加入1/2体积的7. 5mol/L醋酸铵和等体积 的异丙醇，_20°C放置20min后离心lOmin ;除去上清，加入70%v/v乙醇漂洗沉淀一次，离心 5min ;风干除去乙醇，用TE溶解酵母DNA ; ② 构建....班基因敲除组件；将含有通〇7内切酶位点的上游引 物CF/^7-7和含有5^7内切酶位点的下游引物以酵母细胞基因组DNA为模板，进 行PCR扩增，得到基因，将cr/77基因与AiW--AiW片段连接，得到cr/77 Λ :: 仇^應J-AiW基因敲除组件； ③ 构建::班d基因敲除组件；将含有及^7内切酶位点的上游引物 和含有5^7内切酶位点的下游引物以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增， 得到0. 5kbCWC基因价序列；将含有fe?///内切酶位点的上游引物和含 有5^7内切酶位点的下游引物以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到 0. 3kbCWC基因序列，将基因与Aid片段连接，得到Λ ::班·^基 因敲除组件； ④ 构建:Ζ汉^基因敲除组件；将含有您///内切酶位点的上游引物和含 有5^7内切酶位点的下游引物以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到 1. 5kb/^/6基因，将基因与MZ/J?片段连接，得到/7办5 Λ 基因敲除组件； ⑤ 将cr/77 Λ ::历Λ ::历Λ 汉泛基因敲除组件转入 577说单基因敲除酵母，筛选得到四基因敲除酵母； ⑥ 五基因敲除酵母是在四基因敲除酵母的基础上构建： 8、7^2 4....班>^基因敲除组件：通过上游引物1^7-7和含有5^7内切酶位点的下 游引物以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到2. SkbZAW基因，将 基因与班d片段连接，得到: 基因敲除组件； b、将Ta/?7 zl，基因敲除组件转入四基因敲除酵母，筛选得 五基因敲除酵母； B、 纳米CuO溶液的配制： 用分析天平称取1. OOOg纳米CuO :r=20nm，纯度：99. 9%，于1L去离子水中，纳米CuO的 母液浓度为1 g/L，超声分散20 min，4°C避光保存，用前涡旋； C、 细胞毒性实验： 接种野生型酵母四基因敲除酵母和 五基因敲除酵母于液体培养基SD中，30 °C，200 rpm，过夜培养 16?18h，4500rpm收集菌体，SD培养基将菌体稀释至0D6(l(lmi=0. 300,继续培养菌体2 h， 4500rpm离心收集菌体后，用去离子水洗涤一次，用SD培养基将菌体稀释至0D6(l(lnm=0. 010， 受试纳米CuO,将纳米CuO母液稀释，将纳米CuO受试浓度定为10、20、50及100 Pg/ml，移 取菌液及纳米CuO悬浮液各75μ?于96孔板中，将24 h分别作为受试终点，受试终止时，多 功能酶标仪在600nm处检测各孔的吸光值，受试纳米CuO后酵母菌液各孔吸光值，减去纳米 CuO溶液本身吸光值，计算生长抑制率； D、 数据处理和分析： 实验设3个平行，实验结果表示为平均数土标准误差，实验数据采用SPSS13. 0软件 进行t检验及单因素方差分析，p < 0. 05表示差异； E、 试验结果： 敲除与膜通透性及氧化损伤修复相关基因的酵母突变株受试纳米CuO时，其敏感性增 强，其中五基因缺失突变株与野生型相比，其对纳米材料的敏感性有显著性提高； F、 最终结果： 在SD培养基中，纳米CuO对野生型酿酒酵母的半数效应浓度为EC?139mg/L，对五 基因缺失性菌株半数效应浓度为EC?33 mg/L，敲除酵母菌与毒性作用机制相关的特异基 因，增强其易感性，快速地检测纳米材料毒性。
【文档编号】C12R1/865GK104099397SQ201410351760
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】方涛, 鲍少攀, 陆其聪, 唐巍, 戴和平 申请人:中国科学院水生生物研究所