专利名称：一种纳米材料毒性检测方法
技术领域：
本发明涉及一种将含有绿色荧光蛋白质粒的大肠杆菌应用到检测环境中纳米材料毒性的方法，属于环境检测技术领域。
背景技术：
纳米材料是指粒径在1-100纳米之间的纳米结构材料，这种尺度的材料展示了独特的反应活性、光学性质和电磁学性质。纳米颗粒物的来源包括两种， 一种是自然来源，另一种是人为来源。自然来源很早就存在，最典型就是由火山爆发产生的灰尘在大气中形成的气溶胶，还有水体中因生物作用下形成的有机胶体等；人为来源主要是通过一些人类活动(如汽车尾气排放，煤、天然气的燃烧及其人工合成的纳米材料使用等)而产生的纳米尺寸物质。在这些纳米颗粒物的来源中，以人为来源最为人们所关注，且由此引起的健康和环境问题更为严重，本文重点讨论人工来源纳米颗粒物的毒性效应。
因具有独特的理化性质，纳米材料在科学研究以及日常生产、生活中得到了较广泛应用。目前采用纳米技术和纳米材料的商品广泛出现在市场上，其包括电子元件、光学元件、纺织品、医药检测及其药物、高性能运动器材、化妆品、食品包装、水处理技术、燃料电池、催化剂、生物传感器等。以二氧化钛为例，纳米二氧化钛被广泛用于自净玻璃、太阳电池、电器、食品添加剂、药品、化妆品以及污染物处理和污染修复中，每年的使用量数以万吨。而且随着纳米技术不断发展，将使得采用纳米技术和纳米材料的产品会越来越多。有人估测，2006年时全球的纳米材料的市场价值大约为105亿美元，然而到2015年后这个值将达到1万亿美元。这意味着越来越多的含有纳米材料的产品出现在我们日常生产和生活中。随着这些产品的大量使用，大量的纳米材料将通过不同途径进入到环境中，如进入到大气环境、水环境和土壤环境。于是，具有独特物理化学属性的纳米结构材料及其纳米颗粒物逐步引起了人们对可能引发的环境和健康危害的关注。
近年来各国研究人员相继开展了对纳米材料的毒性检测，并进行了较为广泛的研究，主要是通过细菌、真菌或者藻类等低等细胞的Live/Dead的方式来判定纳米材料的毒性，还有通过哺乳动物细胞线(动物细胞线、人体细胞等)的氧化应激反应来判别。例如，Huang等人在"朗缪尔"(Langmuir)杂志(2008年第24期第4140-4144页)上借助细菌的存活率来评价纳米颗粒物的毒性。Long等人在"环境科学与技术"(Environmental Science&Technology)杂志(2009年第40期第4346-4352页)上通过哺乳动物细胞的应激反应程度来评价纳米颗粒物的毒性。以上两种方法存在检测不准、操作复杂、价格昂贵、可重复性差等缺点。通过以上分析可知，目前检测纳米颗粒物细胞毒性的方法存在的问题很多。
本发明的目的正是为了解决上述几个问题，本发明中采用了能稳定产生荧光的荧光蛋白质粒和能迅速繁殖的大肠杆菌菌体。 一方面提供了一种可以通过荧光来判定纳米颗粒物毒性的方法，另一方面采用大肠杆菌作为宿主菌简化了评价装置的操作方式，有助于实现环境中纳米颗粒物毒性检测和分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过绿色荧光蛋白能高效、稳定检测环境中纳米颗粒物毒性的方法。此方法在于实现检测的高通量和灵敏度，分析的速度较快，试样用量少，且成本较低。
本发明所采用的技术方案如下所述
一种利用绿色荧光蛋白检测纳米颗粒物毒性的方法，其特征在于包括步骤如下
1) 质粒转化和大肠杆菌培养
(a) 取一管100微升DH5a感受态细胞，加入绿色荧光蛋白质粒1微升，混合均匀，冰浴中放置30分钟；
(b) 将管放到42。C水浴循环，热击90秒；
(c) 将所述管转移到冰浴中2-5分钟；
(d) 向冰浴后的所述管中加入常温下700-800微升无抗性的SOB培养基，转入到摇床中，37'C下摇动1小时；
(e) 取已转化的感受态细胞450微升加入到50毫克/升卡那霉素抗性的培养基上，等培养基全部吸收后，在37"C下培养12-16小时；
(f) 通过菌落PCR鉴定单菌落，确定含有能够表达绿色荧光的蛋白的质粒；
(g) PCR鉴定完毕无误之后，挑选该单菌落接种于含有卡那霉素抗性的LB培养基中，37。C培养12-16小时；
2) 纳米材料毒性的检测
(a) 将步骤1)中培养得到的含有绿色荧光蛋白质粒的大肠杆菌，用0.9%生理盐水离心洗涤三次，然后用l毫升的含有卡那霉素抗性的M9培养基重悬；
(b) 把事先用M9液体培养基准备好的不同种类和不同浓度的纳米颗粒物的悬浊液依次加入到96孔黑色荧光酶标板孔板上；
(C)通过酶标仪检测不同种类和不同浓度的纳米颗粒物荧光强度变化；
(d)通过一段时间内荧光强度变化来评价不同种类和不同浓度纳米颗粒物对大肠杆菌的毒性。
作为用于本发明的纳米材料毒性检测方法，其培养基要选用低荧光背景的M9培养基；
所述的纳米颗粒物为金红石型纳米二氧化鈦、锐钛矿型纳米二氧化钛、纳米氧化铜或纳
米氧化锌；
本发明的方法中，待检测的大肠杆菌在孔板中的密度为lxl(^个/cm、本发明的方法中，所述的纳米颗粒物在M9培养基中分散的颗粒粒径小于等于100纳米，优选20纳米；
本发明的方法中，检测仪器为Tecan公司生产的Infinite M200。
图1为含有绿色荧光蛋白质粒的大肠杆菌的激发波长扫描图；图2为含有绿色荧光蛋白质粒的大肠杆菌的发射波长扫描图3为分别加入不同浓度的纳米颗粒物(nano-Ti02、 nano-ZnO、 nano-CuO)后，大肠杆菌荧光强度变化曲线(pO.05);
其中，图3a)为金红石型纳米二氧化钛，图3b)为锐钛矿型纳米二氧化钛，图3c)为纳米氧化铜，图3d)为纳米氧化锌。
具体实施例方式
下面将结合实施例参照附图进行详细的说明，以对本发明方法的目的、特征和优点有更深入的了解。以下的实施例具体解释本发明，本发明的范围不受实施例的限制。
实施例1
本实施例涉及到纳米材料毒性检测的方法，包括如下步骤，其中所述的纳米材料为金红石型纳米二氧化钛。
1. 取一管100微升DH5a感受态细胞，加入绿色荧光蛋白质粒l微升，混合均匀，冰浴放置30分钟；
2. 将管放到42'C水浴循环，热击90秒，转移到冰浴中2-5分钟；
3. 向冰浴后的所述管中加入常温下700-800微升无抗性的SOB培养基，转入到摇床中，37"C下摇动1小时；
4. 取已转化的感受态细胞450微升加入到卡那霉素抗性的培养基上，等培养基全部吸收后，在37'C下过夜培养；
5. 挑选单菌落，并通过菌落PCR鉴定；
6. 接种在37。C下培养12-16小时；准备好黑色酶标板，并配制好200毫克/升的金红石型二氧化钛颗粒物储备液，超声波分散30分钟；
7. 在4000转/分转速下离心5分钟，并用0.9%生理盐水洗涤三次；最后用1毫升的M9液体培养基重悬；
8. 依次向每个检测池中加入100微升的大肠杆菌重悬液，接着加入金红石型纳米二氧化钛，使得终浓度分别为5、 10、 20、 30、 50毫克/升，让最终每孔的体积达到200微升；每个样品设置三个平行，并预留未加入纳米颗粒物的检测池作为对照；
9. 将混合样品放到振动摇床150转/分、37。C下孵育30分钟；
510.利用Tecan酶标仪检测在488纳米激发光，520纳米发射光条件下的荧光强度变化。实施例2
本实施例涉及到纳米材料毒性检测的方法，包括如下步骤，其中所述的纳米材料为锐钛矿型一.氧化钛。实施例2中采用与实施例1中相同的纳米颗粒物毒性检测板来进行以下步骤
1. 取一管100微升DH5a感受态细胞，加入绿色荧光蛋白质粒1微升，混合均匀，冰浴放置30分钟；
2. 将管放到42C水浴循环，热击90秒；转移到冰浴中2-5分钟；
3. 向冰浴后的所述管中加入常温下700-800微升无抗性的SOB培养基，转入到摇床中，37'C下摇动1小时；
4. 取已转化的感受态细胞450微升加入到卡那霉素抗性的培养基上，等培养基全部吸收后，在37'C下培养12-16小时；
5. 挑选单菌落，并通过菌落PCR鉴定；
6. 接种在37'C下培养12-16小时；准备好黑色酶标板，并配制好200毫克/升的锐钛矿型二氧化钛颗粒物储备液，超声波分散30分钟；
7. 在4000转/分转速下离心5分钟，并用0.9%生理盐水洗涤三次；最后用1毫升的M9液体培养基重悬；
8. 依次向每个检测池中加入100微升的大肠杆菌重悬液，接着加入锐钛矿型二氧化钛，使得终浓度分别为5、 10、 20、 30、 50毫克/升，让最终每孔的体积达到200微升；每个样品设置三个平行，并预留未加入纳米颗粒物的检测池作为对照；
9. 将混合样品放到振动摇床150转/分、37'C下孵育30分钟；
10. 利用Tecan酶标仪检测在488纳米激发光，520纳米发射光条件下的荧光强度变化。实施例3
本实施例涉及到纳米材料毒性检测的方法，包括如下步骤，其中所述的纳米材料为纳米氧化锌。实施例3中采用与实施例1中相同的纳米颗粒物毒性检测板来进行以下步骤
1. 取一管100微升DH5a感受态细胞，加入绿色荧光蛋白质粒l微升，混合均匀，冰浴放置30分钟；
2. 将管放到42'C水浴循环，热击90秒；转移到冰浴中2-5分钟；
3. 向冰浴后的所述管中加入常温下700-800微升无抗性的SOB培养基，转入到摇床中，37'C下摇动1小时；
4. 取己转化的感受态细胞450微升加入到卡那霉素抗性的培养基上，等培养基全部吸收后，在37。C下培养12-16小时；5. 挑选单菌落，并通过菌落PCR鉴定；
6. 接种在37'C下培养12-16小时；准备好黑色酶标板，并配制好100毫克/升的纳米氧 化锌颗粒物储备液，超声波分散30分钟；
7. 在4000转/分转速下离心5分钟，并用0.9%生理盐水洗涤三次；最后用1毫升的M9 液体培养基重悬；
8. 依次向每个检测池中加入100微升的大肠杆菌重悬液，接着加入纳米氧化锌，使得 终浓度分别为5、 10、 20、 30、 50毫克/升，让最终每孔的体积达到200微升；每个 样品设置三个平行，并预留未加入纳米颗粒物的检测池作为对照；
9. 将混合样品放到振动摇床150转/分、37。C下孵育30分钟；
10. 利用Tecan酶标仪检测在488纳米激发光，520纳米发射光条件下的荧光强度变化。
实施例4
本实施例涉及到纳米材料毒性检测的方法，包括如下步骤，其中所述的纳米材料为纳米 氧化铜。实施例4中采用与实施例1中相同的纳米颗粒物毒性检测板来进行以下步骤
1. 取一管100微升DH5a感受态细胞，加入绿色荧光蛋白质粒l微升，轻轻混合，冰浴 放置30分钟；
2. 将管放到42'C水浴循环，热击90秒；转移到冰浴中2-5分钟；
3. 向冰浴后的所述管中加入常温下700-800微升无抗性的SOB培养基，转入到摇床中， 37'C下摇动1小时；
4. 取已转化的感受态细胞450微升加入到卡那霉素抗性的培养基上，等培养基全部吸 收后，在37'C下培养12-16小时；
5. 挑选单菌落，并通过菌落PCR鉴定；
6. 接种在37'C下培养12-16小时；准备好黑色酶标板，并配制好100毫克/升的纳米氧 化铜颗粒物储备液，超声波分散30分钟；
7. 在4000转/分转速下离心5分钟，并用0.9%生理盐水洗涤三次；最后用1毫升的M9 液体培养基重悬；
8. 依次向每个检测池中加入100微升的大肠杆菌重悬液，接着加入纳米氧化铜储备液， 使得终浓度分别为5、 10、 20、 30、 50毫克/升，让最终每孔的体积达到200微升； 每个样品设置三个平行，并预留未加入纳米颗粒物的检测池作为对照；
9. 将混合样品放到振动摇床150转/分、37。C下孵育30分钟；
利用Tecan酶标仪检测在488纳米激发光，520纳米发射光条件下的荧光强度变化。
权利要求
1.一种利用绿色荧光蛋白检测纳米颗粒物毒性的方法，其特征在于包括如下步骤1)质粒转化和大肠杆菌培养(a)取一管100微升DH5α感受态细胞，加入绿色荧光蛋白质粒1微升，混合均匀，冰浴中放置30分钟；(b)将管放到42℃水浴循环，热击90秒；(c)将所述管转移到冰浴中2-5分钟；(d)向冰浴后的所述管中加入常温下700-800微升无抗性的SOB培养基，然后转入到摇床中，37℃下摇动1小时；(e)取已转化的感受态细胞450微升加入到50毫克/升的卡那霉素抗性的培养基上，等培养基全部吸收后，在37℃下培养12-16小时；(f)通过菌落PCR鉴定单菌落，确定含有能够表达绿色荧光的蛋白的质粒；(g)PCR鉴定完毕无误之后，挑选该单菌落接种于含有卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃培养12-16小时；2)纳米材料毒性的检测(a)将步骤1)中培养得到的含有绿色荧光蛋白质粒的大肠杆菌，用0.9％生理盐水离心洗涤三次，然后用1毫升的含有卡那霉素抗性的M9培养基重悬；(b)把事先用M9液体培养基准备好的不同种类和不同浓度的纳米颗粒物的悬浊液依次加入到96孔黑色荧光酶标板孔板上；(c)通过酶标仪检测不同种类和不同浓度的纳米颗粒物荧光强度变化；(d)通过1小时内荧光强度变化来评价不同种类和不同浓度纳米颗粒物毒性。
2. 根据权利要求1中所述的方法，其特征在于待检测的大肠杆菌在孔板中的密度为lx107 个/cm2。
3. 根据权利要求1中所述的方法，其特征在于所述的待检测的纳米颗粒物为金红石型纳米二氧化钛、锐钛矿型纳米二氧化钛、纳米二氧化铜或纳米二氧化锌。
4. 根据权利要求I中所述的方法，其特征在于所采用的培养基为低荧光背景的M9培养基。
5. 根据权利要求]中所述的方法，其特征在于所述的纳米颗粒物在M9培养基中分散的颗 粒粒径小于等于100纳米，优选20纳米。
全文摘要
本发明涉及到一种环境检测技术领域的检测方法。具体是一种利用含有绿色荧光蛋白质粒的大肠杆菌检测环境中纳米材料毒性的方法，该方法克服了环境中存在的一些自然有机质对纳米材料毒性检测的干扰，使得纳米材料的毒性检测更加方便和准确。具体的方法是选用转化了绿色荧光蛋白质粒的大肠杆菌作为检测用细菌，包括以下步骤第一步用M9培养基制备含有绿色荧光蛋白质粒的大肠杆菌的菌悬液；第二步，利用超声分散纳米材料，制备纳米颗粒物悬浊液；第三步，把纳米颗粒物与大肠杆菌菌悬液置于37℃条件下培养，并利用酶标仪检测其在一定时间内荧光强度变化，然后根据其荧光强度变化的不同来判定纳米颗粒物对大肠杆菌的毒性。本发明提供了一种高效、稳定的纳米材料毒性检测方法，该方法不易受到其他因素干扰，且实验方法简单、成本低廉。
文档编号C12Q1/02GK101671718SQ20091018062
公开日2010年3月17日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者杨志峰, 沈珍瑶, 牛军峰, 姣 王, 蒋国翔 申请人:北京师范大学