一种基于稀土金属铈的荧光纳米簇的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于稀土金属铈的荧光纳米簇的制备方法及其应用。本发明涉及基于稀土金属元素铈绿色合成金铈纳米簇的制备方法及其在肿瘤成像和检测中的应用。相关纳米簇材料具有尺寸小，稳定性高等特点，在实际应用中有良好的生物相容性和稳定的荧光特性，且在室温下长期放置不发生聚集而且荧光性能稳定。本发明的方法简便易操作；合成出的纳米材料毒性低，易分离提纯；在相关生物检测和成像过程中性噪比高，灵敏度和特异性强，具有广阔的医学临床应用价值和前景。
【专利说明】一种基于稀土金属铈的荧光纳米簇的制备方法及其应用【技术领域】
[0001]本发明公开了一种基于稀土金属铈的荧光纳米簇的制备方法及其应用。具体涉及以还原型谷胱甘肽做还原剂，基于稀土金属元素铈绿色合成铈及金铈纳米簇的制备方法及其在肿瘤成像和检测中的应用，并将相关荧光纳米探针应用于肿瘤靶向成像和环境中重金属离子的检测；其次利用肿瘤的生理环境，原位合成荧光金铈纳米簇，实现活体肿瘤细胞的实时动态成像分析。
【背景技术】
[0002]在环境污染方面，重金属是指汞、镉、铅以及“类金属”一砷等生物毒性显著的重金属。其中铅，汞，砷等对人体毒害巨大，这些重金属在水中不能被分解，人饮用后毒性放大，与水中的其他毒素结合生成毒性更大的有机物。人食入汞后直接沉入肝脏，对大脑、神经、视力破坏极大；人食入镉后导致高血压，引起心脑血管疾病，破坏骨骼和肝肾，并引起肾衰竭；铅是重金属污染中毒性较大的一种，人食入铅后，一旦进入人体将很难排除，能直接伤害人的脑细胞，特别是胎儿的神经系统，可造成先天智力低下；砷是砒霜的组分之一，有剧毒，会致人迅速死亡，长期接触少量，会导致慢性中毒且还有致癌性。这些重金属中任何一种都能引起人的头痛、头晕、失眠、健忘、神精错乱、关节疼痛、结石、癌症。因此，对重金属污染进行防治和检测，是改善环境和防止人体中毒及水质保护的重要举措。
[0003]癌症，又称恶性肿瘤，是人类健康的重大威胁，其中以肺癌、胃癌、食管癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌最为常见，占全部恶性肿瘤的70-80%。如今抗癌工作依然严峻，开发针对肿瘤的高灵敏靶向成像和治疗方法是亟待解决的重要问题。目前，临床医疗工作中，恶性肿瘤的发现主要依赖于影像学、病理学及常规肿瘤标志物等检查技术，这些传统的诊断方法虽在临床上应用多年，但缺乏足够的敏感度和特异度，更重要的是难以早期发现肿瘤。开发肿瘤早期诊断的方法尤为重要，它不仅为人类提早预防肿瘤做准备而且对疾病治疗预后提供保障。癌症治疗一直极其困难，所以在癌症早期阶段的高灵敏诊断策略是至关重要的。在这方面，成像在癌症的临床试验和医学实践中成为一个不可缺少的工具。肿瘤成像的方法有很多，如核磁共振，PET-CT，放射性同位素等，但是过程复杂且对于普通患者来说过于昂贵且灵敏度不够高。肿瘤体内荧光成像将提`供一个用于肿瘤直接生物成像的可能性，以此可在癌症治疗过程中进行精确的诊断和监控。相关精准荧光标记的多模态成像方法将为实现高灵敏、快速的癌症早期诊断提供新技术和新方法。
[0004]纳米材料因其自身具备的一些特殊性质在癌症检测等研究中备受瞩目。纳米材料以优越的性能在活细胞内靶向性传输，具有巨大的、潜在的研究前景，并且纳米材料在生物影像中的应用具有重要的价值。以金等贵金属纳米材料为例，生物相容性好，荧光特性稳定，在生物医学中具有广阔的应用前景:如在肿瘤等疾病的早期诊治中，可应用于体内肿瘤演化过程的分析检测或分子显像；提高药物治疗的靶向性，避开体内的生物或生理学屏障；还可以对治疗效果进行实时监测。高特异性和稳定性的纳米荧光探针受到越来越多的亲睐，在肿瘤成像标记及重金属离子检测中具有潜在的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明发现和建立了一种基于稀土金属铈的荧光纳米簇的制备方法，并由此实现了肿瘤精准成像标记与重金属低成本、高灵敏的快速检测，为癌症等疾病早期发现和实时诊断监测提供了新的方法和依据，具有重要的应用前景和价值。
[0006]本发明提出了一种基于稀土金属铈的荧光纳米簇的制备方法，包括以下步骤:
O配制一定浓度的还原型谷胱甘肽水溶液、金试剂和铈试剂水溶液；
2)将1.5至10mmol/L的还原型谷胱甘肽水溶液与0.5至5mmol/L的金试剂混合均匀，充分震荡，直至溶液颜色变为无色；
3)将混合溶液放入水浴锅中加热一段时间后，向其中的金试剂混合溶液中加入0.025至5mmol/L铈试剂，继续反应一段时间，然后从水浴锅中取出，冷却即得到荧光优良的金铈纳米复合材料；其中加热时间为0.5至4h，加热温度为37至90°C，谷胱甘肽与金试剂和铈试剂的比例可以进行调节，从而得到不同荧光产率的纳米材料。
[0007]本发明还提出了一种在肿瘤原位合成掺杂稀土金属铈的荧光纳米簇的制备方法，包括以下步骤:
O配制一定浓度的金试剂和铺试剂水溶液；
2)将浓度为0.0001至I mmol/L的铈试剂与0.0001至I mmol/L金试剂混合均匀，取一定量的混合溶液与肿瘤细胞在细胞培养箱中孵育4至48小时；
3)用共聚焦荧光显微镜对金铈纳米复合材料在细胞成像及其相关分布定位进行表征，通过荧光成像的荧光分布情况 和其荧光强度对金铈纳米复合材料与肿瘤细胞相互作用及其机制进行分析和定量。
[0008]其中所述的金试剂是氯金酸、八氯化四金、氯化金、三氯化金、一氯化金中的一种或者任意二种的混合溶液；铈试剂是硝酸铈、硫酸铈、氯化铈、氟化铈、碳酸铈、醋酸铈等铈的配合物或者盐中的一种。
[0009]其中所述的肿瘤细胞原位合成荧光纳米簇的制备方法，其中所述肿瘤细胞为选自肝癌、肺癌、宫颈癌、白血病、骨肉的肿瘤细胞株。
[0010]合成出的相关基于稀土金属铈的荧光纳米簇，因其良好的生物相容性和在生理缓冲液中良好的分散性，将其作为高效荧光探针可对肿瘤细胞进行精准标记；又由于其高荧光特性，抗干扰能力强，在重金属离子检测中也具有广泛的应用前景。肿瘤原位合成的荧光金铈纳米簇，无需提纯分离，可实现活体肿瘤细胞的实时动态、高分辨的荧光成像。
[0011]原理说明
金属纳米材料近年来被大量研究，在生物医学领域中具有潜在的应用前景。众所周知，金等纳米材料具有良好的生物相容性，因而受到科学家的亲睐,纳米材料本身具有对肿瘤细胞的靶向性，因而能够作为肿瘤标记的荧光探针。高荧光强度的探针可以大幅提高肿瘤荧光成像的信噪比，又其良好的生物相容性对细胞毒性小，所以在生物医学中具有广泛的用途。利用金铈纳米复合材料稳定的荧光性能，在重金属离子的检测中，某些重金属离子如汞，铜等能够特异地引起金铈纳米复合材料的荧光猝灭，从而达到检测的目的。利用肿瘤细胞复杂的生理环境，金试剂能够被还原出金纳米颗粒，在金纳米颗粒形成晶种初期，由于稀土金属铈的存在，铈掺杂到金纳米颗粒中从而形成金铈纳米复合材料，在肿瘤原位实现了肿瘤细胞的实时、高分辨的荧光成像。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]下面结合【专利附图】
【附图说明】本发明的实施例。
[0013]图1是本发明合成出的金铈纳米复合材料在不同激发波长下的荧光发射光谱；
图2是没有作用金铈纳米复合材料的肿瘤细胞(HeLa)空白对照；
图3是本发明合成出的金铈纳米复合材料标记肿瘤细胞(HeLa)的激光共聚焦效果
图；
图4是本发明合成出的金铈纳米复合材料与一定浓度的铜离子作用引起剧烈的荧光猝灭图。
【具体实施方式】
[0014]本实验所用的还原型谷胱甘肽、氯金酸、八氯化四金、氯化金、三氯化金、一氯化金以及硝酸铈、硫酸铈、氯化铈、氟化铈、碳酸铈、醋酸铈等试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。
[0015]实施例1
第一步，配制一定浓度的还原型谷胱甘肽水溶液、金试剂和铈试剂水溶液；
第二步，将1.5至10mmol/L的还原型谷胱甘肽水溶液与0.5至5mmol/L的金试剂混合均匀，充分震荡，直至溶液颜色变为无色；
第三步，将混合溶液放入水浴锅中加热一段时间后，向其中的金试剂混合溶液中加入
0.025至5mmol/L铈试剂，继续反应一段时间，然后从水浴锅中取出，冷却即得到荧光优良的金铈纳米复合材料；其中加热时间为0.5至4h，加热温度为37至90°C，谷胱甘肽与金试齐_铈试剂的比例可以进行调节，从而得到不同荧光产率的纳米材料。
[0016]实施例2
1）配制一定浓度的金试剂和铺试剂水溶液；
2)将浓度为0.0001至1 mmol/L的铈试剂与0.0001至I mmol/L金试剂混合均匀；
3)选用肝癌细胞(HepG2)作为研究对象，实验组将处于对数生长期的肝癌细胞(H印G2)按照1.6 X IO5个细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养8 h后加入已灭菌并用新鲜无菌的DMEM培养基进行稀释的含有浓度为0.0001至I mmol/L的金铈混合溶液与处于对数生长期的H印G2细胞共孵育4-48小时(37 ° C，5 % C02，RH 95%);对照组将培养基中的肝癌细胞(HepG2)按照1.6 X IO5个细胞/孔的密度接种于6孔板中，与实验组同等条件下培养。培养时间终止后向实验组和对照组的每孔加入磷酸缓冲溶液(PBS，pH=7.2)冲洗2至3次；
4)用共聚焦荧光显微镜等对肿瘤细胞进行成像表征:将其置于激光聚焦荧光显微镜下，采用波长为488 nm蓝光进行激发即可采集到细胞的绿色荧光图像，通过荧光断层扫描技术可以观察细胞上的荧光分布情况。
[0017]所述金试剂是氯金酸、八氯化四金、氯化金、三氯化金、一氯化金中的一种或者任意二种的混合溶液；铈试剂是硝酸铈、硫酸铈、氯化铈、氟化铈、碳酸铈、醋酸铈等铈的配合物或者盐中的一种。[0018]合成出的一种基于稀土金属铈的荧光增强纳米材料，作为高效荧光探针对肿瘤细胞进行标记；由于其高荧光特性，抗干扰能力强，用于检测金属离子。
[0019]由以上实例结果表明:合成出的金铈纳米复合材料具有强荧光特性，在宽的激发波长下，金铈纳米复合材料的荧光发射峰位置保持不变；对肿瘤细胞(如HeLa细胞等)进行荧光标记，激光共聚焦图显示出金铈纳米复合材料特异性靶向肿瘤细胞并且荧光效果显著；在重金属离子检测应用中，铜离子大幅度猝灭了金铈纳米复合材料的荧光，以此为基础检测重金属离子具有良好的效果。
[0020]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本【技术领域】的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。`
【权利要求】
1.一种基于稀土金属铈的荧光纳米簇的绿色合成方法，包括以下步骤: 1)配制一定浓度的还原型谷胱甘肽水溶液、金试剂和铈试剂水溶液； 2)将1.5至10mmol/L的还原型谷胱甘肽水溶液与0.5至5mmol/L的金试剂混合均匀，充分震荡，直至溶液颜色变为无色； 3)将混合溶液放入水浴锅中加热一段时间后，向其中的金试剂混合溶液中加入0.025至5mmol/L铈试剂，继续反应一段时间，然后从水浴锅中取出，冷却即得到荧光优良的金铈纳米复合材料；其中加热时间为0.5至4h，加热温度为37至90°C，谷胱甘肽与金试剂和铈试剂的比例可以进行调节，从而得到不同荧光产率的纳米材料。
2.如权利要求1所述基于稀土金属铈的荧光纳米簇的制备方法，其中所述金试剂是氯金酸、八氯化四金、氯化金、三氯化金、一氯化金中的一种或者任意二种的混合溶液；铈试剂是硝酸铈、硫酸铈、氯化铈、氟化铈、碳酸铈、醋酸铈等铈的配合物或者盐中的一种。
3.—种在肿瘤原位合成掺杂稀土金属铈的荧光纳米簇的制备方法，包括以下步骤: O配制一定浓度的金试剂和铺试剂水溶液； 2)将浓度为0.0001至I mmol/L的铈试剂与0.0001至I mmol/L金试剂混合均匀，取一定量的混合溶液与肿瘤细胞在细胞培养箱中孵育4至48小时； 3)用共聚焦荧光显微镜对金铈纳米复合材料在细胞成像及其相关分布定位进行表征，通过荧光成像的荧光分布情况和其荧光强度对金铈纳米复合材料与肿瘤细胞相互作用及其机制进行分析和定量 。
4.如权利要求书3所述的制备方法，其中所述金试剂是氯金酸、八氯化四金、氯化金、三氯化金、一氯化金中的一种或者任意二种的混合溶液；铈试剂是硝酸铈、硫酸铈、氯化铈、氟化铈、碳酸铈、醋酸铈等铈的配合物或者盐中的一种。
5.如权利要求书3中所述的制备方法，其中所述肿瘤细胞为选自肝癌、肺癌、宫颈癌、白血病、骨肉瘤的肿瘤细胞株。
【文档编号】B82Y40/00GK103820114SQ201410075079
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2014年3月4日
【发明者】王雪梅, 革伟, 张园园 申请人:东南大学