专利名称：马传染性贫血病毒致病强毒株驴胎皮肤细胞适应株及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus, EIAV)强毒 株，尤其涉及马传染性贫血病毒致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应株及其构建方法，本发明 还涉及该马传染性贫血病毒致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应株在构建具致病力感染性克 隆中的应用，属于马传染性贫血病毒领域。
背景技术：
马传贫弱毒疫苗是将野外分离的高致病力毒株(EIAVW)经体外驴单核细胞120余 代的人工致弱过程而获得的。强毒株(EIAVW)通过细胞传代，经历着毒力逐渐减弱，免疫原 性逐渐增强的过程。 马传贫弱毒疫苗作为唯一成功应用的慢病毒疫苗，为慢病毒免疫保护机理提供了 重要的模型。中国特有的强毒株和弱毒疫苗株的评价体系更有助于阐明其免疫保护机制。 但是，由于马传贫强毒株特有的培养特性(原代单核细胞和全血清培养)，限制了其生物学 特性的研究。因此，在保持致病力的前提下，改变强毒株培养方式，对其生物学特性和免疫 保护的研究，以及马传贫疫苗的改进和新型疫苗构建均有重要意义。
发明内容
本发明目的之一在保持马传染性贫血病毒致病强毒株的致病力的前提下，改变其 培养方式，得到一株马传染性贫血病毒致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应株，该驴胎皮肤细 胞适应株可以在体外培养的驴胎皮肤细胞FDD上进行良好复制，并保持其致病性和基因特 点； 本发明目的之二是将上述的马传染性贫血病毒致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应 株应用于构建感染性克隆，为马传贫病毒及慢病毒毒力和免疫原性相关研究提供重要的研 究材料； 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的 —株马传染性贫血病毒致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应株，其微生物保藏号是 CGMCC No. 3231 ;分类命名马传贫病毒；保藏时间是2009年8月13日；保藏单位中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院 微生物研究所。 马传贫弱毒疫苗是将野外分离的高致病力毒株(EIAVW)经体外驴单核细胞120余 代的人工致弱过程而获得的。强毒株(EIAVW)通过细胞传代，经历着毒力逐渐减弱，免疫原 性逐渐增强的过程。因此，本发明根据我国强、弱毒株的致弱及产生特点，选择了传代过程 EIAV^m毒株。马体试验显示该毒株仍具有较高的致病力，可引起马急性死亡(图1)。考虑 到病毒的大量培养及免疫检测的可操作性，本发明选择FDD细胞作为感染介质，将EIAVm34 毒株在FDD细胞进行6次传代，获得的毒株命名为EIAV-DLV34-F6。 免疫荧光及RT酶活性检测显示，单核细胞嗜性的强毒株(EIAVDW34)逐渐获得了在
3驴皮肤细胞中复制的适应性，病毒对FDD细胞的感染能力随着传代的增加而增强。经6次 传代后，已经获得4X 107PFU/ml的感染滴度(图2)。为了探究细胞嗜性的改变对病毒毒力 的影响，本发明将EIAV-DLV34-F6复归马体进行毒力测定，实验结果显示，马体分别在接种 后10天、24天出现马传贫典型临床症状，急性发病的诱发时间与强毒株(EIAVW)较为一致， 说明该毒株仍保持与亲本强毒株相似的致病力。可见，细胞嗜性的改变并未对病毒毒力产 生影响。 此外，感染性克隆是进行病毒基因功能研究的重要手段。以此毒株为骨架构建感 染性克隆是本发明的重要应用。利用该方法获得的致病力毒株的感染性克隆保持完整的强 毒株基因背景。SEQ ID N0:1是EIAV-DLV34-F6全基因序列，序列比对表明该毒株与亲本 强毒株的同源性平均为96. 1 % (表2)，在马传贫病毒准株多样性范围内，本发明建立的强 毒株EIAV-DLV34-F6为构建具致病力感染性克隆，奠定了基础。 以上结果证实本发明已成功构建了可以在体外培养的驴胎皮肤细胞FDD上进行
良好复制，并保持其致病性和基因特点的马传贫强毒株，该毒株的建立为马传贫病毒及慢 病毒毒力和免疫原性相关研究提供了重要的研究材料。
图1DLV34毒株马体毒力测定试验结果 图2免疫荧光检测毒株DLV34转接驴皮肤细胞后不同代次的感染水平 图3EIAV-DLV34-F6病毒滴度图4EIAV-DLV34-F6马体毒力测定试验结果 图5感染性克隆构建示意图 图6感染性克隆构建前期工作结果图
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验例1EIAV-DLV34-F6毒株的筛选及鉴定 本试验选择了传代过程EIAVDW34毒株(EIAVDW34为EIAVW通过驴单核细胞体外连 续传代获得)。马体试验显示该毒株仍具有较高的致病力，可引起马急性死亡(图l)。本 发明选择FDD细胞作为感染介质，将EIAVDW34毒株在FDD细胞进行6次传代，获得的毒株命 名为EIAV-DLV34-F6。 免疫荧光及逆转录酶(RT)活性检测显示(参见图2，表1)，单核细胞嗜性的强毒 株(EIAVm34)逐渐获得了在驴皮肤细胞生长活性，病毒感染能力随着传代的增加而增强。经 6次传代后，已经获得1. 8X 107PFU/ml的感染滴度(图3)。为了探究细胞嗜性的改变对病 毒毒力的影响，本发明将EIAV-DLV34-F6复归马体进行毒力测定。图4结果显示，马体分别 在接种后10天、24天出现马传贫典型临床症状，急性发病的诱发时间与强毒株(EIAVW)较 为一致，说明该毒株仍保持与亲本强毒株相似的致病力。可见，细胞嗜性的改变并未对病毒毒力产生影响。
表1
单位DLV34-F1阳性对照阴性对照
0D405/492nm1. 9713. 4570. 131 具体实验方法如下将所检毒株500 i！ 1接入培养成单层的驴胎皮肤细胞(FDD)细 胞。37t:温箱培养8天后抽取接毒细胞培养上清200ia。同时，设立相应的阴性对照(未 接毒细胞培养上清)和阳性对照(EIAVDLV毒株细胞培养液)。加入100ii1 PEG8000溶液， 充分混匀后4。C过夜。次日，按照Reverse Transcriptase AssayColorimetric Kit说明书 测定接毒细胞培养上清中逆转录酶活性。判定标准OD ^阴性对照+2SD即为阳性，说明所 检毒株具有逆转录酶活性可以表达完整的病毒粒子。 利用该方法获得的致病力毒株的感染性克隆保持完整的强毒株基因背景。SEQ ID NO :1显示EIAV-DLV34-F6全基因序列，通过基因组中变异率较高的几个基因与亲本强毒株 的序列比对表明，该毒株与亲本强毒株的同源性平均为96. 1%，其主要几个变异率较高基 因的同源性见表2，基因变异程度在马传贫病毒准株多样性范围内。
表2
肌v毒抹同EIAVW的同源性(IO
gp90gp45 S2 LTR
E跳一—_ 一
E亂96,197,65 97,0 97.55
EIAV曙94, 3亂8 93.9 94,8
95. 2197. 42 95,1 96, 6 试验例2EIAV-DLV34-F6毒株的应用例 以EIAV-DLV34-F6毒株为骨架构建感染性克隆是本发明的重要应用。本发明建立 的强毒株EIAV-DLV34-F6为构建具致病力感染性克隆，奠定了基础。 首先设计引物(引物序列LTR-L :TGT GGG ATT MTATA AGA TTCT ;LTR-R :TGT TAG ATC TTG AAA ACA AGA C)扩增LTR 316bp基因，克隆到pMD18_T上获得质粒pMD18_T_LTR， 利用载体两端Hind III和EcoR I位点将该目的基因亚克隆到由低拷贝载体pLG338(将 pLG338上Mlu I位点缺失后)(pLG338可购买于ATCC(The American TypeCulture Collection, www, atcc. org，商品代号:37130 )上获得了质粒pLG-338-LTR ;PCR分别扩增 包含gag基因3. 5kb片段(引物序列Pltr-L :CTC ATT ATA GTT CCG CTT TTG TGA CG ; Ppol-R :GATGTG AAT ATA TCA TGT CTG)和包含pol-env基因(引物序歹lj :Pgag-L :CTGGAA TTC GTC GAC AGC AGA GGA GM CTT ACA G ;Pltr-R :CAG ACT CGAGCA GGG ACT CAG ACC GCA GAA TC)及部分3' LTR的7. 7kb片段并分别克隆于pMD18_T上获得质粒pMD18-T_3. 5kb 和pMD18-T-7. 7kb。 Hind III酶切pMD18_T_3. 5kb，回收2. 6kb的酶切片段；Hind III酶切 pMD18-T-7. 7kb，回收8. lkb的酶切片段；将两片段进行连接，获得质粒pMD18-T_8. Okb ;利用Mlu I将两重组质粒进行酶切后连接，转化感受态大肠杆菌HB101获得包含全基因的重 组质粒。经测序分析鉴定后，转染驴胎皮肤细胞(FDD)，盲传4-6代，通过免疫荧光及RT酶 活性检测，确定是否获得感染性克隆。试验结果见图6。试验结果表明，本试验已经获得了以本发明毒株EIAV-DLV34-F6
为基因背景的马传贫致病力感染性克隆的构建骨架，可以继续后期的感染性试验。 SEQUENCE LISTING 〈110〉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 〈120〉马传染性贫血病毒致病强毒株驴胎皮肤细胞适应株及应用 〈130>KLPI080678 〈160>1 〈170〉Patentln version 3. 1 〈210>1 〈211>8237 〈212>DNA 〈213>Equine Infectious Anemia Virus 〈400〉 1tgtgggatte:cttataagtg aatatgaaag ttgctgatgc tctcataacc60ttatgteaccc皿皿gactegctcatgttgcteggcaactg皿ctgtgataaccttttgt120tcctcattetagttccgcttttgtgacgcgtteagttcctgtttttecagteteteagtg180cttgtettctgacatttggacactcagattctgcggtctgagtcccttctctgctgggct240aactctegccttggteateactgcteagtccctgttcttegtttgtcttg300ttttcaagatcteacagttggcgcccgaac3ggg3CCtg3gggcgc卿ccctgcctgct360gaacctggctgatcgteggatcccteggac3gC卿gg3g皿cttec3gacgtcttctgg420aggtgtttctggCC3C皿C3C3gg皿g3C3ggte卿tgggagactctttg3C3tgg3gC■3朋gcgctcag皿ggtgacggtec朋gggtctcaaaagct皿ctegtggt540aactgteattgggcgctg皿tttggtggacttettccatgacaccaattt600a朋gactggc朋tteagggacgtcattccattgtt卿ggacgtttcccagacgttgtca660ggac^gagag卿ggratttggtggg咖tegctgccgtte卿tgggc720atectgtg皿agccaagttt780g朋3ga朋gactgcaaatectecca朋皿gcagtctgagcccatgg^ga840atgattgatggggctgg腿cagaaactttcggccatteaC3CCC3g3ggatatectacc■tgggte朋tectetecagcactegtgtg皿tctetttggt960attttetcagtagactgtecttctgagg皿atg^tgcatttttggatgt3gteccagg31020C朋gC3gg3Cactettggataatcttgate卿atgggat1080cgteggcaccCg3tgCC3皿tcctccattegtggcaccacC3C朋gggCCtettcccatg11403C3gC皿ggttratteggggattgggagttcctegaga朋g3C3gatgg3acctgctttt1200gatcagtttegac皿3cttetegac皿tggateateg皿gggggate朋a1260ateatgattggg皿3CCC皿atteggc皿gg3CCC皿3g3accctetcca1320g賜tttgtegacagattgctgtctcagate皿皿gtgagggacatccggctgatateact1380
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一株马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus)致病强毒株的驴胎皮肤细胞适应株，其特征在于，其微生物保藏号是CGMCC No.3231。
2. 按照权利要求1所述的驴胎皮肤细胞适应株，其特征在于所述毒株既保持了马传 染性贫血病毒强毒株毒力特征又能在驴胎皮肤细胞中有效复制。
3. 权利要求1所述的驴胎皮肤细胞适应株在构建具马传染性贫血病致病力感染性克 隆中的用途。
全文摘要
本发明公开了马传染性贫血病毒(Equine Infectious AnemiaVirus，EIAV)致病强毒株EIAVDLV34的驴胎皮肤(FDD)细胞适应株及其应用。本发明选择FDD细胞作为感染介质，将EIAVDLV34毒株在FDD细胞进行6次传代，获得的毒株命名为EIAV-DLV34-F6，其微生物保藏号是CGMCC No.3231。本发明所建立的毒株可以在体外培养的FDD细胞上进行良好复制，并保持其致病性和基因特点，该毒株的建立为EIAV及慢病毒毒力和免疫原性相关研究提供了重要的研究材料。
文档编号C12N7/01GK101696398SQ200910180318
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月22日 优先权日2009年10月22日
发明者吕晓玲, 周建华, 姜成刚, 曹学智, 李利, 林跃智, 王雪峰, 马建 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所;