一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法

一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，包括：步骤1）酵母目标突变体的获得；步骤2）多重逆境筛选；步骤3）候选基因测序；步骤4）抗多重逆境检验。本发明根据异源功能互补、利用对各种逆境条件均敏感的酵母突变体，快速筛选出植物cDNA文库中对多种逆境都具有抗性的抗逆基因。可在短时间内筛选出大量与植物多重逆境抗性相关的基因，且实验成本低、操作程序简单、稳定性好、效率高。
【专利说明】一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于遗传工程领域，涉及一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，具体涉及一种根据异源功能互补、利用对各种逆境条件均敏感的酵母突变体，快速筛选出植物CDNA文库中对多种逆境都具有抗性的抗逆基因的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，由于环境变化加剧，对世界范围内的作物生长带来了巨大的影响。据统计，在世界范围内，适于耕种的土地不足10%，大部分土地处于干旱、高温、低温、盐碱、重金属等逆境中。而且，因人口的不断增长对粮食需求的压力越来越大，迫切需要培育出能在各种非生物胁迫下生长的经济作物。在植物抗逆性研究中，目的不仅在于从分子水平上解释植物适应逆境的机制，而且更希望获得各种抗逆基因，用于作物的抗逆育种。
[0003]目前，已获得了许多与非生物胁迫抗性有关的基因，为植物抗逆性的生物工程提供了可靠的理论依据和实践基础。对植物抗逆性的分子机制研究表明，植物的抗逆性是由多基因控制的，而且植物生长在自然界中，往往处于多种逆境条件的共同胁迫下，多种非生物胁迫的同时出现对植物来说是最致命的，最有效应对的方法是找出调控逆境组合反应的基因。
[0004]目前，分离抗逆基因的方法很多，但或多或少都存在一些不足。如mRNA差异显示方法，假阳性比例高；cDNA文库的差示筛选，容易找到表达量高的基因，很难找到低拷贝数、低表达的基因；图位克隆法，准确率高，但是代价昂贵，操作复杂。最主要的是，这些方法一般仅能得到与某种特定胁迫相关的若干基因，基因数量有限，并且只是针对那些遗传背景和基因组信息齐全的植物。如果能够快速筛选出非模式抗逆植物资源中的多重逆境抗性相关的大量基因，将具有非常重要的意义。
[0005]酵母作为研究高等真核生物的一种重要的模式生物，不仅在生物信息学方面发挥着重要的作用，其丰富的突变体在其他生物基因克隆和功能验证等方面也发挥着重要的作用。多重逆境单细胞筛选酵母异源互补方法是利用对各种逆境组合敏感的酵母突变体，来建立异源功能互补筛选平台，筛选植物体内控制逆境组合的新基因，将在植物抗逆基因的筛选中发挥重要作用，为高等真核生物的基因克隆提供了一种捷径。

【发明内容】

[0006]本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，以克服现有技术的不足，快速筛选出抗11202、211(:12』(1(:12、似(:1及耐高温、耐低温的植物多重逆境抗性基因，该方法具有成本低、操作程序简单、筛选效率高、稳定性好等优点。
[0007]为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。
[0008]一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，包括如下步骤:
[0009]步骤I)酵母目标突变体的获得[0010]将酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突变体库的各种突变体,接种于YPD液体培养基中，30°C过夜培养，转入新鲜YPD液体培养基，至分裂2代。收集处于对数生长期的细胞(OD6tltl=0.4~0.6)，10倍梯度稀释5次，分别置于含0.5-2.0mmol/L H2O2,20-80mmol/L ZnCl2,50-250mmol/L CdCl2、150-350mmol/L NaCl 的 YPD 固体培养基中培养，及分别在高温37°C、低温15°C、正常条件(30°C)下置于YPD固体培养基中培养；从中筛选出对上述逆境条件均敏感的酵母菌株突变体AHogl,作为文库筛选的宿主菌株。
[0011]步骤2)多重逆境筛选
[0012]用植物cDNA文库转化步骤I)中筛选出的突变体菌株AHogl得到酵母转化子，并培养于含0.25-1.0mmol/L H2O2的营养缺陷型SD培养基上。挑取生长出的单克隆，培养于含
0.25-1.0mmol/L H2O2的营养缺陷型SD培养基上。将生长状态良好的酵母转化子分别培养于含 0.25-1.0mmol/L H202、5-15mmol/L ZnCl2,20-100mmol/L CdCl2、100-350mmol/L NaCl的营养缺陷型SD固体培养基上，及分别在高温37°C、低温15°C、正常条件(30°C)下置于营养缺陷型SD固体培养基中培养。
[0013]步骤3)候选基因测序
[0014]提取步骤2)中在上述各种逆境条件下都生长良好的酵母转化子质粒，进行测序，所得植物基因进行抗多重逆性检验。
[0015]步骤4)抗多重逆性检验
[0016]选取缺失步骤3)中所得植物基因的植物突变体，与植物野生型同时培养于分别含有 1.0-15mmol/L H202、100_450umol/L ZnCl2、50-350mmol/L CdCl2、50-300mmol/L NaCl、的MS固体培养基，及在高温37°C、低温15°C、正常条件22°C下置于MS固体培养基。如果该植物突变体的生长状态差于植物野生型，则步骤3)测序得到的基因即为该植物的多重逆境抗性基因。
[0017]进一步，所述植物为拟南芥，但不局限与该植物，水稻、二穗短柄草、小麦、大豆、杨树等多种植物均可适用于该方法，从而筛选出这些植物中与多重逆境抗性相关的基因。
[0018]所述拟南芥中多重逆境抗性基因为富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620。
[0019]所述植物的多重逆境抗性基因是指植物中与抗H2O2、ZnCl2、CdCl2、NaCl及抗高温、低温环境相关的基因。
[0020]优选地，步骤I)中，YPD固体培养基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl浓度分别为1.0-2.0mmol/L、30_60mmol/L、100-250mmol/L、200-350mmol/L。
[0021]更优选地，步骤I)中，YPD固体培养基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl浓度分别为 1.5mmol/L、50mmol/L、200mmol/L、300mmol/Lo
[0022]步骤2)中所述营养缺陷型SD培养基的缺失营养成分为亮氨酸。
[0023]优选地，步骤2)中，所述营养缺陷型SD培养基所加入H2O2浓度为0.5mmol/L,所述营养缺陷型SD固体培养基加入的H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl浓度分别为0.25-0.75mmol/L、7.5-15mmol/L、40-lOOmmol/L、150-300mmol/L。
[0024]更优选地，步骤2)中，所述营养缺陷型SD固体培养基加入的H202、ZnCl2, CdCl2,NaCl 浓度分别为 0.5mmol/L、10mmol/L、60mmol/L、200mmol/L。
[0025]优选地，步骤4)中，所述MS固体培养基中加入的H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl的浓度分别为 2.0-10mmol/L、200-400umol/L、100-300mmol/L、100-300mmol/L。[0026]更优选地，步骤4)中，所述MS固体培养基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl的浓度分别为 H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl 的浓度分别为 7.5mmol/L、350umol/L、250mmol/L、200mmol/
L0
[0027]本发明所用的YPD液体培养基、YPD固体培养基、SD液体培养基、SD固体培养基、MS固体培养基均为市售常规产品。
[0028]本发明所述的利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法从多种酵母突变体中筛选出对各种逆境条件(抗H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl及抗高温、低温环境)均敏感的酵母突变体AHogl,将该酵母突变体作为宿主菌株，并根据异源功能互补，快速筛选出植物cDNA文库中对多种逆境都具有抗性的抗逆基因，具体的筛选流程图参见图1。本发明以拟南芥为例，将拟南芥cDNA文库转化酵母突变体△ Hogl得到酵母转化子，并将酵母转化子进行多重逆境抗性检测，研究发现转化了拟南芥基因I的酵母转化子对所述各种逆境处理均表现出抗性，对该基因I进行测序，通过比对，确认该基因I为拟南芥中富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620，从而快速筛选出拟南芥中抗H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl及抗高温、低温条件的多重逆境抗性基因为富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620。
[0029]本发明的有益效果如下:
[0030]1.本发明利用的是单细胞系统-酵母，酵母菌为真核生物，与植物表达系统更为接近，也具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠翻译后加工等过程，从而使得筛选出的植物基因所编码的蛋白功能正常发挥，多重逆境抗性基因假阳性的概率大大降低。
[0031]2.本发明可在短时间内筛选出大量与植物多重逆境抗性相关的基因，且实验成本低、操作程序简单、稳定性好、效率高 。
【专利附图】

【附图说明】
[0032]图1为本发明利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的筛选流程图；
[0033]图2为本发明实施例1酵母野生型和各种突变体在不同逆境条件下的生长情况图，突变体1:AStel，突变体2:ABckl，突变体3:APbs2，突变体4:AMkkl，突变体5:△ Hogl，突变体 6:ASLT2，突变体 7: AMsn2 ；
[0034]图3为本发明实施例1中拟南芥cDNA文库转化酵母突变体Λ Hogl后在含H2O2的营养缺陷SD培养基上的生长情况图；
[0035]图4为本发明实施例1中已经转化了基因I的酵母转化子在多重逆境条件下的生长情况图；
[0036]图5为本发明实施例1中富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620发生突变的拟南芥突变体在多重逆境条件下的生长情况图。
【具体实施方式】
[0037]以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。应当说明的是，以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。[0038]如无特殊说明，本发明所述各实验材料及生物用品均为市售常规产品，所用生物学手段均为本领域技术人员常用方法实施。
[0039]实施例1
[0040]1、多重逆境敏感性酵母菌株的获得
[0041]将酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突变体库中各种菌株接种于YPD液体培养基中，30°C过夜培养，转入新鲜YPD培养基，至分裂2代。收集处于对数生长期的细胞(OD6tltl=0.4-0.6)，10倍梯度稀释后，共梯度稀释5次，置于分别含有1.5mmol/LH202、50mmol/L ZnCl2,200mmol/L CdCl2,300mmol/L NaCl 的 YPD 固体培养基，培养条件为 30°C、培养48h，并同时，在高温37°C、低温15°C和正常条件(30°C)下置于将不含上述成分的YPD固体培养基培养，培养48h。
[0042]观察酵母野生型和各种酵母突变体在不同逆境条件下的生长情况，筛选出对上述6种逆境条件均敏感的酵母突变体，各酵母突变体的生长情况以以下7种酵母突变体为例(突变体1: Λ Stel，突变2: Λ Bckl，突变体3: Λ Pbs2，突变体4: Λ Mkkl，突变体5: AHogl,突变体6:ASLT2，突变体7:AMsn2)，具体结果参看图2。其中，其他的酵母突变体的生长情况均与图2中突变体1-4及突变体6-7的生长情况类似，在此不再一一罗列。
[0043]从图2可以看出突变体5即突变体AHogl对各种逆境条件均敏感，适合作为文库筛选的宿主菌株。
[0044]2、拟南芥cDNA文库转化酵母突变体
[0045]2.1取适量过夜培养于YPD液体培养基的突变体Λ Hogl菌液，接种于300ml新鲜的YPD培养基，至OD600=0.2~0.3，30°C恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4~0.6。
[0046]2.2室温离心5000rpm、5m`in，弃上清，加入25_50ml无菌水重悬洗涤酵母沉淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用1.5ml TE/LiAc重悬酵母细胞。
[0047]2.3取Iml用1.5ml TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入以下成分:cDNA文库质粒lOOug，和10mg/ml的鲑鱼精DNA200ul，振荡混匀。
[0048]2.4 加入 6ml PEG/LiAc，剧烈振荡，30°C恒温，200rpm 振荡培养 30min。
[0049]2.5加入700ul DMSO,缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴热休克5min，迅速插入冰浴冷却l-2min。
[0050]2.6室温离心2500rpm、5min,尽量弃尽上清，以IOml无菌水重悬沉淀细胞,涂布于含0.5mmol/L H2O2的营养缺陷型SD培养基(不含亮氨酸)上，30°C倒置培养3_5天。结果参看图3，从图3可以看出平板上长出单克隆数量多，菌落密度大，说明转化效率高，满足植物cDNA文库筛选要求。
[0051]挑取生长出的单克隆，培养于含0.5mmol/L H2O2的营养缺陷型SD培养基(不含亮氨酸)上。
[0052]3、利用多重逆境检验所得到的转化子的抗逆性
[0053]将上述所得到的酵母转化子和已经转化了空载体pGADGH的空载体酵母转化子，接种于营养缺陷型SD液体培养基(不含亮氨酸)中，30°C过夜培养，转入新鲜营养缺陷型液体SD培养基(不含亮氨酸)，至分裂2代，收集处于对数生长期的细胞(0D_=0.4~0.6)，10倍梯度 3 次，置于含0.Smmol /T, H2O2、10mmol /T, ZnCl2、60mmol/L CdCl2、200mmol/LNaCl 的营养缺陷型SD固体培养基(不含亮氨酸)中，培养条件为30°C、培养48h，并同时在高温37°C、低温15°C和正常条件(30°C )下置于将不含上述成分的SD固体培养基中培养,培养48h。每个转入文库质粒的酵母转化子做3个重复，其中转化了基因I的酵母转化子对上述各种逆境处理均表现出抗性，已经转化了基因I的酵母转化子在多重逆境条件下的生长情况如图4所示。
[0054]4、对在多重逆境条件有抗性的质粒，进行测序
[0055]提取上述步骤3中在各种逆境条件下都生长良好的含基因I的酵母转化子质粒，进行测序，测序结果如SEQ ID N0:1所示，具体如下:
[0056]TTTCTTTTCGGTGATGAGAACCCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGCTCAACCAAACCCACTAAATATCTACATTACCAAAAATGTTCACAAAATCTATCCTTTTGGCTTCTCTTCTTATCATCATCCTCGTCTCTGCAACTGAATCAGCTCGTCAAAAGAGCGGGAACGATGGTTTAGGATTCGGTGGTGTACCCGGATCCGGATTTATACCCGGGTTTGGAAACGGGTTTCCGGGGACTGGAGTTGGTGGTGGATACGGTGGAGGGTTTGGTGGTCCTAGCGGAGGGTTTGGGAAAGGAGGTGTGGTGAGACCAACGGTTACTTGCAAAGAGAAAGGACCTTGTAACGGCAAGAAGCTTAGGTGTCCTGCTAAGTGTTTCAAATCTTTTAGCCGCTCCGGGAAAGGATACGGCGGTGGAGGTGGCGGTGGAGGATGTACTATGGATTGTAAGAAGAAGTGTATCGCTTATTGTTAAGATATAATAAAGATCACATCATCTTTATAATATATAGTCATTATGATGGTTATGTATTTTCTATGTTATAGCCTATAGATTATGAGATCATGAGGATCCTTTTGTCTTGATTCGATTTGTAGCAGTTTTATATGCATAATATATGGTTGTGATGAATAAATGAGGGAACTTTACTGTTTTCTCTATTGTATGTTTGTGTAAGAGATTCTAAGTTAATTGTGATTTGATCTGTTTTATGCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGATCTATGAATCGTAGATACTGAAAAACCCCGCAAGTTCACTTCAACTGTGCATCGTGCACCATCTCAATTTCTTTCATTTATACATCGTTTTGCCTTCTTTTATGTAACTATACTCCTCTAAGTTTCAATCTTGGCCATGTAACCTCTGATC [0057]经比对(网址http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)得知该基因 I 为富含甘氨酸蛋白基因(AT4G21620)。
[0058]5、利用多重逆境检验富含甘氨酸蛋白基因的抗逆性。
[0059]根据测序结果，选取富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620发生突变的拟南芥突变体(即不再编码出富含甘氨酸蛋白的拟南芥植株)。将拟南芥野生型(品种哥伦比亚)和突变体种子用75%酒精消毒lmin，无菌水洗3次，再用5%漂白粉消毒15min，播种于MS固体培养基。14天后，选取生长正常的植株，转移至分别含7.5mmol/L H202、350umol/L ZnCl2,250mmol/L CdCl2,200mmol/L NaCl的MS固体培养基(培养条件为22°C、培养7天)及在高温37°C、低温15 °C、正常温度22 °C条件下置于MS固体培养基培养(培养7天)，生长情况如图5所示。从图5可知，该基因发生突变的拟南芥突变体，在H202、NaCl、CdCl2、ZnCl2、高温37°C、低温15°C等逆境条件下，相对于野生型，均表现出敏感，即拟南芥野生型有基因AT4G21620的正常功能，生长良好，拟南芥突变体丧失该基因功能，生长状态较差。
[0060]综上所述，说明富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620可提高拟南芥在!1202、NaCl,CdCl2, ZnCl2、高温37°C、低温15°C的逆境条件下的抗逆性，在拟南芥多重逆境抗性方面具有重要作用。
[0061]实施例2
[0062]1、多重逆境敏感性酵母菌株的获得
[0063]将酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突变体库中各种菌株接种于YPD液体培养基中，30°C过夜培养，转入新鲜YPD培养基，至分裂2代。收集处于对数生长期的细胞(OD6tltl=0.4-0.6)，10倍梯度稀释5次，置于分别含有0.5mmol/L H202、20mmol/LZnCl2,50mmol/L CdCl2、150mmol/L NaCl 的 YPD 固体培养基，培养条件为 30°C、培养 48h，并同时，在高温37°C、低温15°C和正常条件(30°C)下置于将不含上述成分的YPD固体培养基培养，培养48h。
[0064]观察酵母野生型和各种酵母突变体在不同逆境条件下的生长情况，筛选出对上述6种逆境条件均敏感的酵母突变体，可以看出突变体AHogl对各种逆境条件均敏感，适合作为文库筛选的宿主菌株。
[0065]2、拟南芥cDNA文库转化酵母突变体
[0066]2.1取适量过夜培养于YPD液体培养基的突变体Λ Hogl菌液，接种于300ml新鲜的YPD培养基，至OD600=0.2~0.3，30°C恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4~0.6。
[0067]2.2室温离心5000rpm、5min，弃上清，加入25_50ml无菌水重悬洗涤酵母沉淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用1.5ml TE/LiAc重悬酵母细胞。
[0068]2.3取Iml用1.5ml TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入以下成分:cDNA文库质粒lOOug，和10mg/ml的鲑鱼精DNA200ul，振荡混匀。
[0069]2.4 加入 6ml PEG/LiAc,剧烈振荡，30°C恒温，200rpm 振荡培养 30min。
[0070]2.5加入700ul DMSO,缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴热休克5min，迅速插入冰浴冷却l-2min。
[0071]2.6室温离心2500rpm、5min,尽量弃尽上清，以IOml无菌水重悬沉淀细胞,涂布于含0.5mmol/L H2O2的营养缺陷型SD培养基(不含亮氨酸)上，30°C倒置培养3_5天。从生长结果看出平板上长出单克隆数量多，菌落密度大，说明转化效率高，满足植物cDNA文库筛选要求。
[0072]挑取生长出的单克隆，培养于含0.5mmol/L H2O2的营养缺陷型SD培养基(不含亮氨酸)上。
[0073]3、利用多重逆境检验所得到的转化子的抗逆性
[0074]将上述所得到的酵母转化子和已经转化了空载体pGADGH的空载体酵母转化子，接种于营养缺陷型SD液体培养基(不含亮氨酸)中，30°C过夜培养，转入新鲜营养缺陷型SD液体培养基(不含亮氨酸)，至分裂2代，收集处于对数生长期的细胞(0D_=0.4~0.6)，10倍梯度稀释 3 次，置于含 0.25mmol/L H2O2,5.0mmol/L ZnCl2,20mmol/L CdCl2'100mmol/LNaCl的营养缺陷型SD固体培养基(不含亮氨酸)中，培养条件为30°C、培养48h，并同时在高温37°C、低温15°C和正常条件(30°C)下置于将不含上述成分的SD固体培养基中培养，培养48h。每个转入文库质粒的酵母转化子做3个重复，其中转化了基因I的酵母转化子对上述各种逆境处理均表现出抗性。
[0075]4、对在多重逆境条件有抗性的质粒，进行测序
[0076]提取上述步骤3中在各种逆境条件下都生长良好的含基因I的酵母转化子质粒，进行测序，测序结果如SEQ ID NO:1所示。
[0077]经比对(网址http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)得知该基因 I 为富含甘氨酸蛋白基因(AT4G21620)。
[0078]5、利用多重逆境检验富含甘氨酸蛋白基因的抗逆性。[0079]根据测序结果，选取富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620发生突变的拟南芥突变体(即不再编码出富含甘氨酸蛋白的拟南芥植株)。将拟南芥野生型品种哥伦比亚和突变体种子用75%酒精消毒lmin，无菌水洗3次，再用5%漂白粉消毒15min，播种于MS固体培养基。14天后,选取生长正常的植株,转移至分别含1.0mmol/L H202> 100umol/L ZnCl2、50mmol/LCdCl2,50mmol/L NaCl的MS固体培养基(培养条件为22°C、培养7天)及在高温37°C、低温15°C、正常温度22°C条件下置于MS固体培养基培养(培养7天)。从其生长情况可知，该基因发生突变的拟南芥突变体，在H202、NaCl, CdCl2, ZnCl2、高温37°C、低温15°C等逆境条件下，相对于野生型，均表现出敏感，即野生型有基因AT4G21620的正常功能，生长良好，突变体丧失该基因功能，生长状态较差。
[0080]综上所述，说明富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620可提高拟南芥在!1202、NaCl,CdCl2, ZnCl2、高温37°C、低温15°C的逆境条件下的抗逆性，在拟南芥多重逆境抗性方面具有重要作用。
[0081]实施例3
[0082]1、多重逆境敏感性酵母菌株的获得
[0083]将酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突变体库中各种菌株接种于YPD液体培养基中，30°C过夜培养，转入新鲜YPD培养基，至分裂2代。收集处于对数生长期的细胞(0D600=0.4-0.6)，10倍梯度稀释5次，置于分别含有2.0mmol/L H202、80mmol/LZnCl2,250mmol/L CdCl2,350mmol/L NaCl 的 YPD 固体培养基，培养条件为 30°C、培养 48h，并同时，在高温37°C、低温15°C和正常条件(30°C)下置于将不含上述成分的YPD固体培养基培养，培养48h。
[0084]观察酵母野生型和各种酵母突变体在不同逆境条件下的生长情况，筛选出对上述6种逆境条件均敏感的酵母突变体，可以看出突变体AHogl对各种逆境条件均敏感，适合作为文库筛选的宿主菌株。
`[0085]2、拟南芥cDNA文库转化酵母突变体
[0086]2.1取适量过夜培养于YPD液体培养基的突变体Λ Hogl菌液，接种于300ml新鲜的YPD培养基，至OD600=0.2~0.3，30°C恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4~0.6。
[0087]2.2室温离心5000rpm、5min，弃上清，加入25_50ml无菌水重悬洗涤酵母沉淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用1.5ml TE/LiAc重悬酵母细胞。
[0088]2.3取Iml用1.5ml TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入以下成分:cDNA文库质粒lOOug，和10mg/ml的鲑鱼精DNA200ul，振荡混匀。
[0089]2.4 加入 6ml PEG/LiAc,剧烈振荡，30°C恒温，200rpm 振荡培养 30min。
[0090]2.5加入700ul DMSO,缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴热休克5min，迅速插入冰浴冷却l-2min。
[0091]2.6室温离心2500rpm、5min,尽量弃尽上清，以IOml无菌水重悬沉淀细胞,涂布于含0.5mmol/L H2O2的营养缺陷型SD培养基(不含亮氨酸)上，30°C倒置培养3_5天。从生长结果可以看出平板上长出单克隆数量多，菌落密度大，说明转化效率高，满足植物cDNA文库筛选要求。
[0092]挑取生长出的单克隆，培养于含0.5mmol/L H2O2的营养缺陷型SD培养基(不含亮氨酸)上。[0093]3、利用多重逆境检验所得到的转化子的抗逆性[0094]将上述所得到的酵母转化子和已经转化了空载体pGADGH的空载体酵母转化子，接种于营养缺陷型SD液体培养基(不含亮氨酸)中，30°C过夜培养，转入新鲜营养缺陷型SD液体培养基(不含亮氨酸)，至分裂2代，收集处于对数生长期的细胞(0D_=0.4~0.6)，10 倍梯度稀释 3 次，置于含 1.0mmol/L H202、15mmol/L ZnCl2、100mmol/L CdCl2,350mmol/LNaCl的营养缺陷型SD固体培养基(不含亮氨酸)中，培养条件为30°C、培养48h，并同时在高温37°C、低温15°C和正常条件(30°C)下置于将不含上述成分的SD固体培养基中培养，培养48h。每个转入文库质粒的酵母转化子做3个重复，其中转化了基因I的酵母转化子对上述各种逆境处理均表现出抗性。
[0095]4、对在多重逆境条件有抗性的质粒，进行测序
[0096]提取上述步骤3中在各种逆境条件下都生长良好的含基因I的酵母转化子质粒，进行测序，测序结果如SEQ ID NO:1所示。
[0097]经比对(网址http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)得知该基因 I 为富含甘氨酸蛋白基因(AT4G21620)。
[0098]5、利用多重逆境检验富含甘氨酸蛋白基因的抗逆性。
[0099]根据测序结果，选取富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620发生突变的拟南芥突变体(即不再编码出富含甘氨酸蛋白的拟南芥植株)。将拟南芥野生型品种哥伦比亚和突变体种子用75%酒精消毒lmin，无菌水洗3次，再用5%漂白粉消毒15min，播种于MS固体培养基。14天后,选取生长正常的植株,转移至分别含15mmol/L H202、450umol/L ZnCl2、350mmol/LCdCl2,300mmol/L NaCl的MS固体培养基(培养条件为22°C、培养7天)及在高温37°C、低温15°C、正常温度22 °C条件下置于MS固体培养基培养(培养7天)。从其生长情况可知，该基因发生突变的拟南芥突变体，在11202、似(:1、0(1(:12、211(:12、高温371:、低温15°C等逆境条件下，相对于拟南芥野生型，均表现出敏感，即拟南芥野生型有基因AT4G21620的正常功能，生长良好，突变体丧失该基因功能，生长状态较差。
[0100]综上所述，说明富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620可提高拟南芥在!1202、NaCl,CdCl2, ZnCl2、高温37°C、低温15°C的逆境条件下的抗逆性，在拟南芥多重逆境抗性方面具
有重要作用。
【权利要求】
1.一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，包括如下步骤: 步骤1)酵母目标突变体的获得 将酵母野生型和各种酵母突变体，接种于Yro液体培养基中，30°c过夜培养，转入新鲜YPD液体培养基，至分裂2代。收集处于对数生长期的细胞(0D_=0.4~0.6)，10倍梯度稀释 5 次，分别置于含 0.5-2.0mmoI/L H202、20-80mmol/L ZnCl2、50-250mmol/LCdCl2、150-350mmol/L NaCl的YPD固体培养基中培养，及分别在37°C、15°C、30°C条件下置于YPD固体培养基中培养；从中筛选出对上述逆境条件均敏感的酵母菌株突变体AHogl，作为文库筛选的宿主菌株； 步骤2)多重逆境筛选 用植物cDNA文库转化步骤I)中筛选出的突变体菌株AHogl得到酵母转化子，并培养于含0.25-1.0mmoI/L H2O2的营养缺陷型SD培养基上；挑取生长出的单克隆，培养于含0.25-1.0mmoI/L H2O2的营养缺陷型SD培养基上；将生长状态良好的酵母转化子分别培养于含 0.25-1.0mmol/L H202、5-15mmol/L ZnCl2,20-100mmol/L CdCl2、100-350mmol/L NaCl的营养缺陷型SD固体培养基上，及分别在37°C、15°C、30°C条件下置于营养缺陷型SD固体培养基中培养； 步骤3)候选基因测序 提取步骤2)中在上述各种逆境条件下都生长良好的酵母转化子质粒，进行测序，所得植物基因进行抗多重逆性检验； 步骤4)抗多重逆性检验 选取缺失步骤3)中所得多重逆境抗性基因的植物突变体，与植物野生型同时培养于含1.0-15mmol/L H202、100_450umol/L ZnCl2、50-350mmol/L CdCl2、50-300mmol/L NaClJAMS固体培养基及在37°C、15°C、22°C条件下置于MS固体培养基；如果该植物突变体的生长状态差于植物野生型，则步骤3)测序得到的植物基因即为该植物的多重逆境抗性基因。
2.根据权利要求1所述的利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥。
3.根据权利要求2所述的利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，所述拟南芥中多重逆境抗性基因为富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620。
4.根据权利要求1或3所述的利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，所述多重逆境抗性基因是指植物中与抗H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl及抗高温、低温环境相关的基因。
5.根据权利要求1所述的利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，步骤I)中，YPD固体培养基中加入的H2O2、ZnCl2、CdCl2、NaCl浓度分别为1.0-1.5mmol/L、30_60mmol/L、100-250mmol/L、200-350mmol/L。
6.根据权利要求1所述的利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，步骤2)中所述营养缺陷型SD培养基的缺失营养成分为亮氨酸。
7.根据权利要求1所述的利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，步骤2)中，所述营养缺陷型SD固体培养基加入的H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl浓度分别为0.25-0.75mmol/L、7.5-15mmol/L、40_lOOmmol/L、15Q-300mmol/L。
8.根据权利要求1所述的利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，步骤4)中，所述MS固体培养基中加入的H202、ZnCl2.CdCl2.NaCl的浓度分别为2.0-10mmol/L、200-400umol/L、100_300mmol/L、100_300mmol/L。
【文档编号】C12N15/81GK103509876SQ201310509029
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】储昭庆, 李鹏 申请人:上海辰山植物园