一种褐飞虱不同龄期体内类酵母共生菌检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种褐飞虱不同龄期体内类酵母共生菌检测方法。选取不同龄期的褐飞虱，针对多种类酵母共生菌，结合变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术进行定量检测。龄期为1及2龄、3龄、4龄、5龄、刚羽化成虫。酵母共生菌为Noda菌（Hypomyceschrysospermus）、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、假丝酵母(Candidaquercitrusa)。本发明利用DGGE和qPCR技术检测了褐飞虱不同龄期多种类酵母共生菌的变化规律，为今后研究类酵母共生菌与褐飞虱生长发育之间的联系提供了有效的工具。
【专利说明】一种褐飞虱不同龄期体内类酵母共生菌检测方法
【技术领域】
[0001]本发明通过结合变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术对褐飞虱不同龄期时多种类酵母共生菌群落结构的变化规律进行研究，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]褐飞風属于同翅目飞風科，是危害东南亚国家和我国南方稻区最严重的水稻害虫之一，对农作物的危害除刺吸汁液和产卵危害外，还传播水稻条纹叶枯病、黑条矮缩病、小麦丛矮病和玉米粗缩病等病毒病，给农业生产造成巨大损失，因此急需一种经济、有效和环保的方式来遏制褐飞虱的发生和危害。
[0003]同其他同翅目昆虫一样，褐飞虱体内存在共生菌，类酵母共生菌(Yeast-likeSymbiotes, YLS)是飞虱体内的优势菌群。YLS主要聚集在腹部脂肪体和卵中，并随卵垂直传递给下一代。YLS还参与氮素循环，为寄主提供氨基酸、固醇类物质以及蛋白质等多种营养成分，并对稻飞虱生长、发育、繁殖、致害性变化等起到重要作用。经过高温或抗生素减菌处理后，发现缺共生菌的飞虱若虫的龄期明显比正常若虫长，且存活率也比正常若虫低。随着褐飞虱若虫的生长发育，褐飞虱体内共生菌的数量也随之增加。这些结果表明类酵母共生菌与飞虱的生长发育息息相关，因此明确褐飞虱体内类酵母共生菌具体的变化规律具有十分重要的意义。
[0004]然而，褐飞虱体内的类酵母共生菌生存环境较为特殊，因此难以进行离体培养。传统研究主要基于显微法观察褐飞虱不同生长发育期类酵母共生菌的变化，但这种方法效率低且准确性差。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术的 不足，本发明提供了一种褐飞虱不同龄期体内类酵母共生菌检测方法。
[0006]褐飞虱是一种农业害虫，研究发现其生长发育和体内的类酵母共生菌有密切的联系，明确褐飞虱体内类酵母共生菌的变化规律具有十分重要的意义。尚未见有关利用分子生物学技术分析褐飞虱不同龄期类酵母共生菌的研究报道。
[0007]本发明首先收集不同龄期的褐飞虱作为研究对象，利用变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)技术和实时突光定量 PCR(Real-time Quantification PCR, qPCR)技术，特定地研究三种类酵母共生菌:Abt/a菌(Hypomyces chrysospermus),季也蒙毕赤酵母 ipichia guiIliermondii),假丝酵母{Candida querci trusa)在褐飞風不同虫龄之间的变化规律。
[0008]所述的类酵母共生菌为AbtZa菌(Jfypomyces chrysospermus)，季也蒙毕赤酵母{Pichia gui I Iiermondii),{Candida querci trusa) 0
[0009]所述的褐飞虱不同发育时期为1，2龄、3龄、4龄、5龄以及刚羽化雌成虫。
[0010]所述的检测不同龄期三种类酵母共生菌的方法过程如下:1)褐飞虱脂肪体中的类酵母共生菌进行分离纯化，并提取基因组，以上述提取的基因组为模板；
2)根据三种菌株的ISSrDNA的特征序列设计引物进行PCR扩增；
3)利用变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术对多种菌株的变化规律定量分析。
[0011]利用DGGE和qPCR结合技术揭示了三种菌在褐飞虱不同龄期呈现相近的变化规律。在4龄若虫期之前，不同共生菌的数量均随着虫龄的增加而增加，5龄若虫期数量有显著的下降趋势，而到成虫期数量又有显著地回升。其中办菌的数量在这三种共生菌中占有绝对优势。
[0012]本发明的有益效果:
本发明利用DGGE和qPCR技术检测了褐飞虱不同龄期多种类酵母共生菌的变化规律，为今后研究类酵母共生菌与褐飞虱生长发育之间的联系提供了有效的工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是三种菌在不同龄期的变性梯度凝胶电泳图；A: Hypomyceschrysospermus，B: Pi chi a gui Ili ermondi i，C: Candi da querci trusa 0
[0014]图2A良Hypomyces chrysospermus质粒标准品的标准曲线图。
[0015]图2B是Pichia guiIliermondii质粒标准品的标准曲线图。
[0016]图2C是Candida querci trusa质粒标准品的标准曲线图。
[0017]图3A良Hypomyces chrysospermus菌特异序列扩增的标准曲线图。
[0018]图3B是Pichia guiIliermondii菌特异序列扩增的标准曲线图。
[0019]图^Candi da querci trusa菌特异序列扩增的标准曲线图。
[0020]图4A隻Hypomyces chrysospermus菌特异序列的懷解曲线图。
[0021]图4B IPichia gui I Iiermondii菌特异序列的熔解曲线图。
[0022]图4C是Candida querci trusa菌特异序列的懷解曲线图。
[0023]具体实施方法
以下结合附图和【具体实施方式】对本发明做进一步的说明。
[0024]实施例1:用变性梯度凝胶电泳对褐飞風不同龄期三种菌(Mypomyceschrysospermus Λ Pi chi a gui Ili ermondi i Λ Candi da querci trusa )的半定量分析:
分别取褐飞虱I及2龄、3龄、4龄、5龄各500、400、300、200头，取刚羽化雌成虫100头，对其脂肪体中的类酵母共生菌进行分离纯化，并提取基因组。以上述提取的基因组为模板，扩增所用引物为依据3种菌获得的DGGE序列设计的引物310F/310RQfypomyces chrysospermus ), 305F/305R (PicAia gui I liermondii ), 248F/248R (Candidaquerci trusa),为了提高DGGE的检测效率，在三对上游引物的5’端添加约40个碱基的GC夹子(表1)。
[0025]表1三种菌的引物序列
【权利要求】
1.一种褐飞虱不同龄期体内类酵母共生菌检测方法，其特征在于，选取不同龄期的褐飞虱，针对多种类酵母共生菌，结合变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术进行定量检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的龄期为I及2龄、3龄、4龄、5龄、刚羽化成虫。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酵母共生菌为AbtZa麗(Mypomyceschrysospermus ) > 季也蒙毕赤酵母{Pichia guiIliermondii)、假丝酵母{Candidaquercitrusa)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，过程如下: 1)将褐飞虱脂肪体中的类酵母共生菌进行分离纯化，并提取基因组，以上述提取的基因组为模板； 2)根据三种菌株的18SrDNA的特征序列设计引物进行PCR扩增； 3)利用变性梯度凝胶电泳与荧光定量PCR技术对多种菌株的变化进行定量分析。
【文档编号】C12Q1/06GK103468798SQ201310358330
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月17日 优先权日:2013年8月17日
【发明者】马正, 俞晓平, 曹伟, 侯云, 边亚琳, 郝培应, 许益鹏, 申屠旭萍, 王正亮 申请人:中国计量学院