专利名称：检测纳米材料细胞毒性的方法
技术领域：
本发明涉及一种毒性检测方法，特别涉及检测纳米材料细胞毒性的方法。
背景技术：
近年来纳米技术、纳米材料飞速发展，越来越受到人们的重视。纳米材料是指材料 的几何尺寸达到是纳米级尺度水平，包括纳米粉，纳米线、纳米薄膜，并且具有特殊性 能的材料。当粒子的大小进入纳米量级后，将表现出强烈的小尺寸效应，表面效应、量 子尺寸等效应，因而与传统材料相比纳米材料的性质发生了很大的变化，其生物效应也 发生了质的转变。纳米材料己经进入我们的生活，甚至进入人体。但是对于纳米材料的 危险度的评价信息却严重缺乏。事实上，当今世界上己经有很多国家的政府和科学家注 意并且考虑到这个问题，越来越多的科学研究人员开始关注探讨纳米尺度物质的生物效 应、对环境和健康的影响问题。在纳米材料中，包括碳纳米管、碳纳米纤维在内的碳纳 米材料--直是近年来科学的前沿领域之一。因此，了解碳纳米管可能对人和动物健康的 毒性是非常有必要的，研究其可能导致的生物组织的性质的改变及毒性具有相当重要的 科研和实际意义。
近年来各国科学家相继开展了碳纳米管的细胞毒性研究。目前，碳纳米管的细胞毒 性研究主要是指示剂染料比色法如四氮甲唑蓝(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)、 Alamar 蓝、血球计数法等。这些方法通常对实验操作人员具有很高的要求，操作复杂，操作过 程中有可能对细胞就产生了创伤，灵敏度低，可重复性差，耗时长，用量大，所需器材 繁多，成本高。同时，大量研究发现四氮甲唑蓝及四氮甲唑蓝还原后的甲瓒(Formazan)、 中性红、卟啉等染料分子与碳纳米管壁之间具有很强的范德华作用力，电子显微镜可以 观察到染料分子吸附在碳管管壁上，从而不能精确检测到指示剂分子，这就导致了测试 结果的不准确，有可能得到完全相反的结果。
通过以上分析可知，目前检测纳米材料细胞毒性的方法存在的问题还很多，有利于 市场推广的检测方法目前尚未有见。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测纳米材料细胞毒性的方法，此方法易于实现检测的 高通量和高灵敏度，分析速度快，体积小、试样用量少、成本低并且无须昂贵的生化标记材料、对细胞无创伤性、可以实现在线控制和连续检测的非标记细胞分析方法。 为达到上述目的，本发明采用以下技术方案 本发明的一种检测纳米材料细胞毒性的方法，其中
(1) 将待检测细胞种在底部带有微电子传感器的若干个孔板上，然后，将孔 板放在细胞分析系统的检测装置上；
(2) 监测细胞生长曲线，以得到细胞与孔板的微电极表面贴壁或生长情况；
(3) 在细胞贴壁2 — 30小时后，加入经灭菌处理过的纳米材料的培养液或者 缓冲液，继续监测细胞生长曲线。
本发明的一种检测纳米材料细胞毒性的方法，其中所述孔板的个数为6 — 200个。 本发明的一种检测纳米材料细胞毒性的方法，其中所述待检测细胞在孔板中的密
度为lxl()4-lxl07个/cm2。
本发明的一种检测纳米材料细胞毒性的方法，其中所述纳米材料为单壁碳纳米管、
多壁碳纳米管、碳纤维或石墨。
本发明的一种检测纳米材料细胞毒性的方法，其中所述细胞分析系统为Roche 公司生产的xCELLigence系统。
本发明纳米材料毒性检测方法的优点是全过程自动、实时监测；无需标记；对细 胞无创伤性；高信息含量；高精确性和高重复性；易于操作。并且该方法可用于检测多 个对象，实现了检测的高通量和高灵敏度，具有体积小、试样用量少，成本低廉。本发 明方法的检测装置操作简单、方便，可广泛用于高通量、高灵敏度的碳纳米材料毒性方 面的检测，加快了分析速度，并且易于实现在线控制和检测自动化。
图1为分别加入不同浓度的单壁碳纳米管后，Balb/c3T3细胞的生长曲线，反应了 不同浓度的单壁碳纳米管对Balb/c3T3细胞的毒性的影响；
图2为分别加入相同浓度的单壁碳纳米管、多壁碳纳米管和经赖氨酸修饰的多壁碳 纳米管后，Balb/c3T3细胞的生长曲线，反应了相同浓度的单壁碳纳米管、多壁碳纳米 管和经赖氨酸修饰的多壁碳纳米管对Balb/c3T3细胞的毒性的影响。
具体实施例方式
下面将结合实施例参照附图进行详细说明，以对本发明方法的目的、特征和优点有 深入的理解。
下面以实施例说明检测碳纳米材料对细胞毒性的过程，本实施例以碳纳米管对
4Balb/c3T3细胞为例进行说明。
所采用的细胞分析系统为Roche公司生产的xCELLigence系统。首先，在底部带 有微电子细胞传感器的96孔板上种上密度为lxl0"个/cr^的Balb/c3T3细胞，然后将 孔板放在细胞分析系统的检测装置上，细胞会在孔板中的微电极表面贴壁或生长，贴壁 程度紧密与否都会引起微电极阻抗发生变化。因此，黏附在微电极表面的细胞越多，细 胞指数(CI)值越大。同样，细胞与微电极表面黏附越紧密伸展，电阻抗增加越大。测 量微电极间阻抗可得到细胞在微电极上生长状态的重要信息。当细胞生物状态发生变化 时，系统可以实时并自动获取其模拟电信号，并可以转换成数字信号以进行进一步的分 析。细胞与微电极间的相互作用产生的阻抗与孔内细胞数量、细胞形态以及细胞黏附质 量相关，如图1和图2的纵坐标所示，阻抗的大小用的细胞指数CI进行衡量，图l和 图2的横坐标表示细胞的生长时间，当细胞贴壁约23小时后，在孔板中加入经过灭菌 的碳纳米管的培养液溶液，继续在细胞分析系统上监测细胞生长曲线。
图1为在孔板内加入七种不同浓度的单壁碳纳米管溶液后，对Balb/c3T3的细胞毒 性作用。由曲线可以看出，不用浓度单壁碳纳米管对细胞的生长产生了不同程度的影响， 导致细胞数量、细胞形态及其黏附情况有明显不同。系统可动态检测单壁碳纳米管的细 胞毒作用及起作用时间。
图2为在孔板内加入浓度为50ug/ml的单壁碳纳米管、多壁碳纳米管或经赖氨酸修 饰的多壁碳纳米管后，Balb/c3T3细胞的生长曲线，反应出相同浓度的单壁碳纳米管、 多壁碳纳米管或经赖氨酸修饰的多壁碳纳米管对Balb/c3T3的细胞毒性作用大小有明显 差异，其中最上边的一条曲线为加有经赖氨酸修饰的多壁碳纳米管的Balb/c3T3细胞的 生长曲线；中间的一条为加有多壁碳纳米管的Balb/c3T3细胞的生长曲线；最下边的一 条曲线为加有单壁碳纳米管的Balb/c3T3细胞的生长曲线。
以上描述是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要 求，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改。
权利要求
1. 一种检测纳米材料细胞毒性的方法，其特征在于(1)将待检测细胞种在底部带有微电子传感器的若干个孔板上，然后，将孔板放在细胞分析系统的检测装置上；(2)监测细胞生长曲线，以得到细胞与孔板的微电极表面贴壁或生长情况；(3)在细胞贴壁2—30小时后，加入经灭菌处理过的纳米材料的培养液，继续监测细胞生长曲线。
2. 如权利要求2所述的检测纳米材料细胞毒性的方法，其特征在于所述孔板的个数为6—200个。
3. 如权利要求2所述的检测纳米材料细胞毒性的方法，其特征在于所述待检测细胞在孔板中的密度为lxl0、lxl(^个/cm2。
4. 如权利要求l所述的检测纳米材料细胞毒性的方法，其特征在于所述纳米材料为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、碳纤维或石墨。
5. 如权利要求1所述的检测纳米材料细胞毒性的方法，其特征在于所述细胞分析系统为Roche公司生产的xCELLigence系统。
全文摘要
本发明涉及一种检测纳米材料细胞毒性的方法，包括将待检测细胞种在底部带有微电子传感器的若干个孔板上，然后，将孔板放在细胞分析系统的检测装置上；监测细胞生长曲线，以得到细胞与孔板的微电极表面贴壁或生长情况；在细胞贴壁2-30小时后，加入经灭菌处理过的纳米材料的培养液或者缓冲液，继续监测细胞生长曲线，本发明的检测纳米材料对细胞毒性方法的优点是全过程自动、实时监测；无需标记；对细胞无创伤，该方法可用于检测多个对象，具有体积小、试样用量少，成本低廉、检测装置操作简单、方便，可广泛用于高通量、高灵敏度的碳纳米材料毒性方面的检测，加快了分析速度，并且易于实现在线控制和检测自动化。
文档编号C12Q1/18GK101487040SQ200910078298
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月24日 优先权日2009年2月24日
发明者任冬梅, 铭 李, 王军兵, 董益阳 申请人:中国检验检疫科学研究院