专利名称：抗体依赖性细胞毒性检测的制作方法
技术领域：
本申请涉及用于检测抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法和(在一 些实施方案中)涉及不需要标记细胞的以实时方式对ADCC进行检测的 方法。
背景技术：
ADCC是免疫应答組成部分，其中IgG抗体结合到病原或致瘤靶细 胞表面的抗原上，标识它们并通过NK效应细胞进行破坏。具有Fey 受体(FcyR)的效应细胞识别结合到靶细胞的抗体的Fc区域并与之 结合。因此抗体给予了由效应细胞介导的靶细胞杀伤特异性，在两种 细胞类型之间形成一个桥梁并随后释放裂解颗粒。
一些治疗性抗体通过增强ADCC来发挥其生物活性。例如， 一种用 于治疗乳腺癌的人源化抗体Herc印tii^能通过结合癌细胞表面上的 HER-2抗原来增强ADCC。同样， 一种用于治疗非何杰金淋巴瘤 (non-Hodgkin's lymphoma)的嵌合抗体Rituxan。通过结合淋巴瘤细 胞表面上的CD20抗原来增强ADCC。
测定抗体是否诱导ADCC的技术通常涉及用放射性物质(例如Cr51) 或荧光染料(例如Calcein AM)标记靶细胞。被标记的细胞与抗体和 效应细胞(例如NK细胞或PBMC)孵育，并通过放射性或荧光的释放 检测通过ADCC进行的乾细胞杀伤。在这种检测中乾细胞的标记需要使 贴壁细胞脱离来进行标记。标记后，用悬浮状态的靶细胞进行检测，
这对于贴壁细胞不是一种正常状态。此外，通常只在将靶细胞与效应
细胞和抗体混合数小时后的一个时间点里测定ADCC介导的细胞杀伤 的程度。已经开发出一种无标记检测，其中通过测定从裂解细胞的细 胞质释放到无细胞上清液中的乳酸脱氩酶(LDH)来检测细胞杀伤。但 是，LDH法不是一种实时的检测，并且它不能将乾细胞的死亡和效应 细胞的死亡区分开，因为两种类型的细胞在溶胞中都将释放LDH。
考虑到目前正在销售的或正在开发中的治疗性抗体产品的数量， 存在着对能测定抗体ADCC活性的体外检测方法的需求。尤其是，需要 一种高通量的、无标记的ADCC检测来实时监测ADCC，并且不需要让 贴壁细胞脱离。
发明内容
本申请提供了体外检测ADCC的方法。方法是无标记的或需要较低 水平标记的，因此和需要标记细胞的检测相比更容易操作并且更安全。 在一些实施方案中，该方法还在贴壁细胞中进行，而不是在悬浮细胞 中进行。此外，该方法可以以实时方式进行，能够追踪ADCC反应的动 力学，因此能够比较不同抗体的ADCC动力学。并且和标准ADCC检测 相比此处提供的方法灵敏度更高，能够检测不同抗体ADCC动力学的较 小的差别。此外，在一些实施方案中，此处所提供的方法的简单性意 味着比标准ADCC检测更快速，并且具有为高通量筛选ADCC活性进行 优化的潜力。
此处提供的方法包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的 非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效应细胞 和结合乾细胞的一种抗体。加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之 间的阻抗下降表明在检测培养基中ADCC功能已经生效。加入效应细胞 和抗体后，基质上的电极之间的阻抗增高或未改变，能够表明在检测 培养基中未发挥ADCC功能。
一方面，本申请描迷了 一种检测抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方 法，包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上
的电极之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效应细胞和结合乾细胞 的一种抗体；其中加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗 下降，表明在检测培养基中ADCC功能已经生效，而在加入效应细胞和 抗体后，基质上的电极之间的阻抗增高或未改变，能够表明在检测培 养基中未发挥ADCC功能。该方法包括在规则周期中检测阻抗。包括从 每次阻抗测量中导出细胞指数(CI)并确定细胞指数是否发生变化， 其中使用下面的公式从每次阻抗测量中导出细胞指数，
其中Rb (f)和R ^胞(f)分别是在细胞存在或不存在情况下的频率依 赖性电极电阻，N是阻抗检测处的频点(frequency points)数。可 以使用RT-CES頃系统进行该方法。可以每15分钟检测一次阻抗。
该方法可以进一步铺板靶细胞。在靶细胞铺板18到24小时之后 加入抗体和效应细胞。靶细胞在基质上可以是单层。能以每孔2K到 100K的密度铺板耙细胞(例如，每孔15K到25K之间，或大约每孔20K )。 效应细胞对靶细胞的比例(E:T)可以是25:1。 E:T可以超过10:1、超 过50:1、或超过100:1。
可以以大约1和大约100 |Lig/ml之间、大约1和大约50 |Lig/ml 之间、或在大约2和大约8 Mg/ml之间的浓度加入抗体。可以包括向 检测培养基中加入结合靶细胞的2种或2种以上的抗体，结合靶细胞 的3种或3种以上的抗体，或者结合靶细胞的的4种或4种以上的抗 体。抗体可以来自于自身免疫性疾病患者.
靶细胞可以表达顶端抗原。该方法可以包括才艮据顶端抗原表达筛 选把细胞的预先步骤。靶细胞可以是癌细胞或病毒感染的细胞。癌细 胞可以来自于一种细胞系，癌细胞可以是SKBR3细胞或MG63细胞。
效应细胞可以包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、 单核细胞、细胞毒T淋巴细胞或中性粒细胞。30.方法的步骤(b)可以 包括向粑细胞中加入已经部分富集效应细胞的全血。方法的步骤(b) 可以包括向效应细胞中加入全血，其中所述全血包含效应细胞。
在另 一方面，本申请描述了 一种根据诱导针对靶细胞的ADCC的能
力筛选候选抗体的方法，包括(a)监测支持靼细胞在检测培养基中 生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效 应细胞和结合靶细胞的候选抗体；其中加入效应细胞和抗体后，基质 上的电极之间的阻抗下降，表明了候选抗体具有影响针对乾细胞的 ADCC功能的能力，而在加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的 阻抗增高或未改变，表明了候选抗体不具有影响针对乾细胞的ADCC 功能的能力。
在另一方面，本申请描述了一种鉴定适合接受候选抗体治疗的、 患有和靶细胞相关疾病的病人的方法，该方法包括(a)监测支持和 疾病相关的靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极之间的 阻抗；和(b)向把细胞中加入分离自患者的PBMC和候选抗体；和(c) 测定在加入PBMC和抗体后，基质上的电极之间的阻抗是否存在变化， 其中基质上的电极之间的阻抗下降，表明病人适合接受该抗体治疗， 而在加入PBMC和抗体后，基质上的电极之间的阻抗增加或没有变化， 表明病人缺乏接受该抗体治疗的适合性。
在另 一个方面，本申请描述了 一种根据调节ADCC的能力筛选候选 化合物的方法，包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非 导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)在存在或不存在候选化合物的情 况下，向检测培养基中加入效应细胞和一种抗体，其中所述抗体和靶 细胞结合；和(c)比较存在候选化合物时加入效应细胞和抗体后基质上
胞和抗体后基质上的电极之i':i的阻抗出、现的任何变化，其中存在^选
化合物时阻抗的变化大于不存在候选化合物时阻抗的任何变化，表明 该候选化合物具有调节ADCC的能力。筛选的化合物能够调节自身免疫 相关的ADCC。
本申请还描述了如此处所述的一种高通量检测方法，其中非导电 基质包含两个或多个微量滴定孔(well)，每个孔包含至少两个电极， 并监测每个孔中的电极之间的阻抗。
在另一个方面，本申请描述了一种用于抗体的质量控制检测，包
括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极之 间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效应细胞和抗体，其中所述抗体 和靶细胞结合；其中在加入效应细胞和抗体后基质上的电极之间的阻 抗下降，表明该抗体适合被释放用于ADCC诱导，而在加入效应细胞和 抗体后基质上的电极之间的阻抗上升或不变，表明抗体不适合被释放 用于ADCC诱导。
而在另一个方面，本申请描述了一种用于抗体的质量控制检测， 包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极 之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效应细胞和抗体，其中所述抗 体和靶细胞结合；和(c)比较加入效应细胞和抗体后基质上的电极之 间的阻抗出现的任何变化和加入效应细胞和对照抗体后对照样品的阻 抗的任何变化；其中加入效应细胞和抗体后基质上的电极之间的阻抗 的下降大于加入效应细胞和对照抗体后对照样品的阻抗的下降，表明 抗体适合被释放用于ADCC诱导，而其中加入效应细胞和抗体后基质上 的电极之间的阻抗的下降不大于加入效应细胞和对照抗体后对照样品 的阻抗的下降，表明抗体不适合被释放用于ADCC诱导。在质量控制检 测中，在加入效应细胞和抗体后阻抗的下降比加入效应细胞和对照抗 体后对照样品的阻抗的下降至少大25°yi，表明该抗体适合被释放用于
ADCC诱导。
本申请还描述了一种筛选用于治疗自身免疫病的候选化合物的方 法，包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的 电极之间的阻抗，其中所述靶细胞是健康的细胞；(b)在存在或不存在 候选化合物的情况下向检测培养基中加入效应细胞和抗体，其中所述 抗体和耙细胞结合，并且其中效应细胞是来自于被诊断有自身免疫病 的受试者的PBMC;和(c)比较存在候选化合物时阻抗的任何变化与不 存在候选化合物时阻抗的任何变化，其中不存在候选化合物时阻抗的 下降大于存在候选化合物时阻抗的任何下降，表明该候选化合物适合 作为治疗自身免疫疾病的试剂，而其中不存在候选化合物时阻抗的下 降不大于存在候选化合物时阻抗的任何下降，表明该候选化合物不适
合作为治疗自身免疫疾病的试剂，
在另一个方面，本申请描述了确定候选抗体是否适合治疗患有自
身免疫疾病的接受者的方法，包括(a)监测支持和自身免疫疾病相 关的靶细胞生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向把细胞中 加入候选抗体和分离自接受者的PBMC;和(c)测定在加入PBMC和候选 抗体后基质上的电极之间的阻抗是否改变，其中电极间的阻抗下降， 表明抗体适合用于治疗接受者，而其中电极间的阻抗不下降，表明抗 体不适合用于治疗接受者。
在另一个方面，本申请描述了一种确定诱导ADCC响应的抗体的最 适浓度的方法，包括(a)监测支持靶细胞的两种或两种以上样品在检 测培养基中生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向靶细胞的 两种或两种以上样品中加入效应细胞和抗体，其中所述抗体和靶细胞 结合，并且其中向靶细胞的两种或两种以上样品中加入不同浓度的抗 体；其中在加入效应细胞和抗体后基质上的电极间的阻抗下降，表明 在检测培养基中ADCC功能受到影响，并测定导致阻抗最大下降的抗体 浓度，作为最适浓度。
在另一方面，本申请描述了一种测定抗体是否结合靶细胞上的顶 端抗原的方法，包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导 电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向耙细胞中加入效应细胞和抗体； 其中加入效应细胞和抗体后基质上的电极间的阻抗下降，表明抗体结 合耙细胞上的顶端抗原。
除非另外定义，此处所用的所有的技术和科学术语具有和这个发 明所属领域的普通技术人员的正常理解相同的含义。虽然可以使用和 此处描述相似或相当的方法和材料来实践发明，但是下面描述了合适 的方法与材料。此处提到的所有的出版物、专利申请、专利和其它参 考都被完整引用作为参考。在矛盾的情况下，以本说明书、包括定义 为准。此外，所述的材料。方法和实施例仅仅是例示性的不用于限定。
在下面的附图和说明中对发明的一个或多个实施方案的细节进行 了阐明。本发明的其他特征、对象和优点在说明书和附图以及权利要
求中是很显然的。 附图简要说明
图1，描绘了如所示以40K、 20K、 IOK或5K每孔的2倍系列稀释 铺板的SKBR3细胞的细胞指数(Cell Index)对时间的曲线。
图2描绘了铺板的SKB R3细胞的细胞指数对时间的曲线，所述 细胞在20小时后被加入的新鲜培养基("单独细胞，，)、或Triton X-100 ("细胞+Triton")处理来诱导细胞死亡。
图3描绘了铺板的SKBR3细胞的细胞指数对时间的曲线，所述细 胞在20小时后被新鲜培养基("单独的靶")、曲妥珠单抗("靶+ 曲妥珠单抗，，)、或IgG对照抗体("靶+IgG")所处理。
图4描绘了单独的SKBR3细胞("靶")或PBMC("效应物") 的细胞指数对时间的曲线。
图5描绘了单独的SKBR3细胞、单独的PBMC或在20小时后被PMBC 处理的SKBR3细胞的细胞指数对时间的曲线。
图6描绘了单独的SKBR3细胞、20小时后被PBMC处理的SKBR3 细胞、或20小时后被PBMC和Herceptin'处理的SKBR3细胞的细胞指 数对时间的曲线。
图7描绘了 SKBR3靶细胞(T)被PBMC效应物(E)裂解的时间曲 线，如所示E: T比例为50: 1或12. 5: l，带有和不带有Herceptin*mAB。
图8A描绘了使用此处描述的方法测定的，被单独的PBMC处理的 SKBR3粑细胞、被PBMC加标明浓度的Herceptii^处理的SKBR3靶细胞、 或被PBMC加对照IgG处理的SKBR3乾细胞的裂解百分比曲线。
图8B描绘了使用标准Calcein-AM检测测定的，被单独的PBMC 处理的SKBR3耙细胞、被PBMC加标明浓度的HercepUn"处理的SKBR3 靶细胞、或被PBMC加对照IgG处理的SKBR3靶细胞的裂解百分比曲线。
图9描绘了 SKBR3和MG63细胞的细胞指数对时间的曲线。
图1 OA描绘了在18-20小时被单独的PBMC、PBMC和RX1靶特异性 抗体、或PMBC和IgG对照抗体处理的MG63细胞的细胞指数对时间的曲线。
图10B描绘了在18-20小时被单独的PBMC、 PBMC和Herceptin* 靶特异性抗体、或PMBC和IgG对照抗体处理的SKBR3细胞的细胞指数 对时间的曲线。
发明详述
本申请提供了通过测量电极之间的阻抗来检测ADCC的材料和方 法，所述电极位于其上铺有细胞的表面上。可以使用任何合适的检测 阻抗设备。在一些实施方案中，可以使用具有非导电基质的、其上定 位有众多电极阵列的、所述阵列与阻抗分析器相连接的设备来检测 ADCC,例如，可以使用在下腔基质上定位有电极阵列的设备检测ADCC， 利用膜将下腔和上腔分割开。还可以使用这种设备检测细胞从上腔向 下腔的迁移，通过下腔中的阵列中的电极之间的阻抗的增加来检测出 对下腔基质的粘附。这种设备已经被公开，例如在专利WO2004/010103 和W02004/010102中。
这种设备还能用于评价化合物对其中的细胞的细胞毒性。例如， 可以将化合物加入到正在含有电极的基质上生长的细胞中，可以监测 化合物对电极之间的阻抗的影响，其中电极之间阻抗的下降表明细胞 死亡。参见，例如，W02005/77104和W02005/047482。并参见美国>^ 开号2005/0112544 (U.S. Publication No. 2005/0112544 )，其公 开的方法包括通过检测阻抗来评价它莫西芬(Tamox i f en)诱导的细胞 毒性。
上面的参考都没有公开使用其公开的设备评价ADCC。和简单的涉 及向乾细胞中加入候选化合物的常规细胞毒检测不同，ADCC涉及加入 (a)—种结合乾细胞的抗体，和(b)结合该抗体的效应细胞。不要期望 阻抗检测提供ADCC检测中靶细胞数量的准确指征，因为预期把细胞、 效应细胞和抗体都将粘附到基质上。因此，高阻抗读数有可能归因于
i) 粘附到基质上的靶细胞，因为抗体和效应细胞没有诱导ADCC;或者
ii) 通过ADCC杀死耙细胞后粘附到基质上的效应细胞和抗体。因此不 能期望例如上面公开的那些设备能用于ADCC检测。
但是令人惊讶的是，发明者已经发现例如在W02005/77104和 W02005/047482中公开的设备能被用于ADCC检测。尤其是，发明者已 经发现，效应细胞没有明显的粘附到含电极的基质上，并且在合适的 靶细胞数量、效应细胞对靶细胞(E: T)的比例以及抗体浓度下，基质上 的电极间的阻抗变化能提供靶细胞数量的准确指征。
通过检测其上生长有靶细胞的基质中的电极之间的阻抗的变化来 检测ADCC具有一些明显优于标准ADCC检测的优势。和多数标准ADCC 检测不同，在一些实施方案中此处提供的方法是无标记的。在一些实 施方案中，该方法不涉及用放射性或其它标记物标记细胞，使得该检 测较需要标记细胞的检测更加容易并且更加安全。此外，如上面讨论 的，在标准ADCC检测中要让粘附细胞从其生长表面上脱离，使其能够 被标记，并且ADCC检测在悬浮液中进行。因为此处提供的方法是无标 记的，不需要使细胞脱离，因此去除了潜在的因粘附细胞的干扰导致 的误差来源。相反，ADCC检测在粘附在基质上的细胞中进行。
此外，和多数标准ADCC检测不同，在一些实施方案中此处提供的 方法能够通过在加入抗体和效应细胞后的不同时间点检测阻抗来实时 跟踪细胞数量。因此，此处提供的方法能跟踪ADCC反应动力学，因此 能比较不同抗体的ADCC动力学。在一些实施方案中，该方法比标准 ADCC检测更灵敏，能检测出不同抗体的ADCC动力学的较小差别。此 外，此处提供的方法的简单性意味着比标准ADCC检测快很多，并且具 有为ADCC活性高通量筛选进行优化的潜力。
可以4吏用在W02004/010102、 W02004/010103、 WO2005/077104或 W02005/047482中描述的设备或基于这些设计的设备来实施此处提供 的方法。在一些实施方案中，可以4吏用ACEABiosciences (SanDiego， CA)生产的RT-CES"系统实施此处提供的方法。RT-CES'系统包括三个组 件 一个电子传感器分析器， 一个设备站和一个16孔的微量滴定板。 阅读者将能理解，这个系统的微小车间变异将属于仪器接收技术人员 的范围之内。例如，该设备可以装备有96孔微量滴定板或256孔微量 滴定板，而不是16孔微量滴定板，使其能同时进行更多检测。
可以使用光刻微加工法在玻璃片上构建微电极传感器阵列，并且 可以将含有电极的玻片组装到塑料托板上形成含电极的孔。
设备站可以接收微量滴定板(例如，16孔、256孔或96孔微量滴 定板)，并能够向传感器分析器电子地开关任意一个孔来进行阻抗检 测。在操作中，带有细胞(在孔中培养的)的设备可以连接到设备站 上并放置于保温箱中。电缆可以将设备站连接到传感器分析器上。使 用RT-CES'软件控制，传感器分析器能够自动选择待检测的孔，并能持 续地指导阻抗的检测。来自于分析器的阻抗数据能被传送到计算机中， 被分析，并被集成软件处理。
在单个孔中的电极之间检测的阻抗很典型地依赖于电极几何、孔 中地离子浓度和是否有细胞粘附到电极上。在没有细胞时，电极阻抗 主要由电极/溶液界面处和总体容液中的离子环境所决定。在存在细胞 时，粘附到电极传感器表面上的细胞能够改变电极/溶液界面处的局部 离子环境，导致阻抗上升。电极上的细胞越多，细胞-电极阻抗增加 的越多。
为了根据检测的细胞-电极阻抗对细胞进行定量，根据如下公式 推导参数"细胞指数(CI)":
其中Rb(f)(第12页，函数)是无细胞时的频率依赖的电极电阻 (阻抗的一个组成部分)，IU胞(f)是有细胞时的频率依赖的电极电阻， N是检领'J阻抗时的频点(frequency points)数。
因此，细胞指数是对含电极孔中细胞的定量检测。在相同的生理 条件下，更多细胞粘附到电极上导致更大的^Uw^V值，导致更大的细 胞指数值。
此处提供的方法可以包括在有规则的间隔中检测阻抗并根据上面 给出的公式从这些阻抗测量中推导出细胞指数，因此能够跟踪ADCC 反应。阻抗检测所采用的间隔可以依赖于期望在多近程度上跟踪反应 动力学。例如，如果期望跟踪一种已知能诱导ADCC的抗体的ADCC动 力学，可以优选短间隔，而如果进行检测的主要目的只是确定一种给
定的抗体是否能够诱导ADCC，较长的间隔有可能是令人满意的。该方 法可以包括在例如每30分钟、每15分钟、每10分钟、每9、 8、 7、 6、 5、 4、 3或2分钟、每l分钟或比每分钟更频繁的时间点中进行阻 抗的检测。
此处描述的方法可以进一步包括在加入效应细胞和抗体之前将把 细胞铺板到基质上。例如，可以将靶细胞铺板到基质上并使其生长一 段时间，再加入效应细胞和抗体。在加入抗体和效应细胞前铺板乾细 胞能使靶细胞粘附到基质上并生长，导致阻抗上升，可以有利于检测 加入效应细胞和抗体后出现的阻抗下降。但是，典型的，不应该使把 细胞过度生长，因为，粘附到基质上的靶细胞有可能因为其上有细胞 生长而无法接触抗体。在这种情况下，不可能检测ADCC。技术人员完
最优时间长度。在一些实施方案中，可以在加入效应细胞和抗体之前 的10-30小时在基质上铺板乾细胞。例如，可以在加入效应细胞和抗 体之前的18-24小时(例如，19-21小时)在基质上铺板靶细胞。
乾细胞铺板密度依赖于细胞大小及其生长率。检测系统典型地具 有最大极限，高于它就不能检测细胞的进一步的生长。因此应该以低 于该极限的密度铺板靶细胞，使因细胞死亡导致的阻抗变化能够被检 测到。但是，还应该以足够高的密度铺板靶细胞，使细胞在生长初始 阶段就对阻抗有影响，这样在加入效应细胞和抗体后阻抗出现的任何 下降就都能被检测到。在一些实施方案中，可以在19. 6 mm2标准孔中 以2K和IOOK的密度铺板靶细胞(例如，在19.6咖2标准孔中以10K 和60K之间的密度，在19. 6 mm'标准孔中以15K和25K之间的密度， 或在19. 6 mi^标准孔中以20K的密度)。
进行阻断测量的时间长度，即，检测长度，可以根据靶细胞铺板 和加入效应细胞与抗体之间的时间而变化。通常能在加入抗体和效应 细胞后的几个小时中检测到因ADCC出现的阻抗减小。但是在一些情况 下，希望在ADCC导致的细胞杀伤出现后继续检测阻抗一段时间，来测 定细胞死亡程度，来确定任何是否有任何细胞发生了再生长以及何时
发生的。因此此处提供的方法可以包括在铺板把细胞后进行无限制的
24小时、36小时、48小时、72小时、100小时、200小时或超过200 小时的阻抗检测。
此处提供的方法可以使用如上述提供的任何数量的效应细胞和任 何数量的靶细胞，靶细胞的数量不能太高以至于妨碍了 ADCC的准确检 测。该方法可以使用比把细胞更多的效应细胞，效应细胞对乾细胞的 比例(E: T)可以，例如，超过10:1、超过20:1、超过50:1、超过100: 1或大约为25:1。
可以以任何浓度将抗体加入到把细胞中。例如，加入抗体的浓度 可以是，例如，大约1到大约1000 pg/ml之间、大约l到大约500 p g/ml之间、大约1到大约100 pig/ml之间、大约l到大约75 p g/ml 之间、大约1到大约50 yg/ml之间、大约1到大约25 ing/ml之间、 大约I到大约IO jig/ml之间、大约2到大约8 jag/ml之间、大约4 到大约6 jig/ml之间。
在一些实施方案中，可以使用此处描述的方法，通过比较使用不 同的抗体浓度所获得的ADCC响应，测定诱导ADCC响应的抗体最适浓 度。例如，方法可以包括(a)检测支持两种或两种以上(例如，2、 3、 4、 5或超过5种)靶细胞样品在检测培养基中生长的非导电基质上的 电极之间的阻抗；和(b)向两种或两种以上靶细胞样品中加入效应细胞 和抗体，其中抗体结合靶细胞，并且其中以不同浓度将抗体加入到两 种或两种以上靶细胞样品中；其中在加入效应细胞和抗体后基质上的 电极间的阻抗下降，表明在检测培养基中ADCC功能得到发挥，并测定 导致阻抗最大下降的抗体浓度，作为最适浓度。
可以将效应细胞和抗体同时或分别加入到靶细胞培养基中。例如， 可以在抗体之前将效应细胞加入到培养基中，或者在效应细胞之前加 入抗体。此处描述的方法可以使用靶细胞、效应细胞和抗体的任意組 合，并且在方法中对把细胞、效应细胞和抗体进行的选择可以依赖于 检测的目的。在下面讨论了适合在此处提供的方法中使用的靶细胞、 效应细胞和抗体的范例，以及使用这些靶细胞、效应细胞和抗体的检
测的可能应用。
在一些实施方案中，靶细胞适粘附细胞。在一些实施方案中，把 细胞表达顶端抗原。许多细胞是极化的，并且在其顶端和基底外侧表
面表达不同的抗原(Nelson等人(2003) Nature 422:766-774)。例 如，上皮细胞表达不同的顶端和基底外侧抗原。当在悬浮液中进行标 准ADCC检测时，抗体可以结合到顶端和基底外侧抗原上。但是在此处 提供的方法中，细胞粘附在基质上，抗体只能结合到顶端抗原上。因 此抗体诱导ADCC的能力表明了抗体能结合靶细胞上的顶端抗原。因此
:原。例如，方法可以包括:'(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长 的非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向靶细胞中加入效应细胞 和抗体；其中在加入效应细胞和抗体后基质上的电极间的阻抗下降， 表明抗体结合到耙细胞的顶端抗原上。 一些治疗性抗体在体内只能接 近顶端抗原。例如， 一些抗体只能接近并结合到肿瘤表面表达的顶端 抗原上。因此，抗体通过结合顶端抗原诱导ADCC的能力提示着该抗体 在体内具有治疗效果。
此处提供的方法可以包括筛选表达顶端抗原的靶细胞预步骤。这 个预步骤可以使用，例如，RT-PCR或FACS来鉴别出表达顶端抗原的、 适用于此处提供的方法的靶细胞。
可以使用任何合适的耙细胞。表达顶端抗原的细胞的例子包括(不 限于)，肿瘤细胞和上皮细胞，例如本领域已知的那些。例如，糖蛋 白(例如DF3抗原和MUC1 )在上皮细胞的表面表达，并且在上皮肿瘤 的顶端表面过量表达(Snijdewint等人 (2001) Int. J. Cancer 93: 97- 106;和Hayes等人(1990) J. Immunol. 145: 962- 970)。
此外，许多种肿瘤细胞在其顶端表面表达对叶酸具有高亲和力的细胞 表面受体(Lu 等人(2002) Cancer Immunol. Immunother.
51 :153-162)。
把细胞可以是疾病细胞，例如，癌细胞或病毒感染的细胞。这些 靶细胞可以是来自于细胞系库的细胞系。此外，细胞可以获自于患有
疾病或紊乱的个体。例如，靶细胞可以来自于癌症患者的肿瘤活组织 取样。
可以被用作靶细胞的癌细胞包括，但不限于，何杰金氏病相关细
胞、非何杰金B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、恶性淋巴瘤、淋巴肉瘤 非白血性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髄瘤、慢性髄细 胞样白血病、慢性骨髄单核细胞性白血病、骨髄增生异常综合征、骨 髄增生病、嗜酸细胞过多综合征、嗜酸细胞性白血病、多发性骨髄瘤、 伴X染色体的淋巴增生性障碍、食管癌、胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、 胰腺癌和胆嚢癌、肾上腺皮质癌、产生ACTH的肿瘤、膀胱癌、脑癌(例 如、成神经细胞瘤和神经胶质瘤)、尤因氏肉瘤、头颈癌(例如、口腔 癌和喉癌)、肾癌(例如、肾细胞癌)、肝癌、肺癌(例如、小和非小细 胞肺癌)、恶性腹水、恶性胂瘤性胸腔积液、皮狀癌(例如、恶性黑色 素瘤、人皮肤角质化细胞的进行性肿瘤、上皮细胞癌、鳞状上皮细胞 癌、基底细胞癌)、间皮瘤、卡波济氏肉瘤、骨癌(例如、骨瘤和肉瘤 例如纤维肉瘤和骨肉瘤)、女性生殖道癌(例如、子宫癌、子宫内膜癌、 卵巢癌、和子宫颈癌)、乳腺癌、前列腺癌、视网膜成神经细胞瘤、睾 丸癌和甲状腺癌。
可以被用作靶细胞的癌细胞系可以是获得的永生粘附细胞系，例 如，来自于细胞库。合适的粘附永生细胞系的范例包括，但不限于 SKBR3、 MG63、 CCD- 1070Sk、 hTERT-HMEl [ ME16C ]、 BJ、 ATRFL0X [Mutatect〗、KEL FIB、 HT-1197、 LL 97A (AlMy) 、 NCI-H510A [H510A; NCI-H510]、 HT-29、 SW756、 293、 IMR-90 [IMR90]、 HIAE-55 [Wistar Special Collection的部分]、SW1417 [SW-1417] 、 Hs 737. T、 NCI-H661 [H661]、 CCD 841 CoN、 Hs 792(C).M、 Per Sel、 NCI-H810 [H810]、 Pane 05.04、 ZR-75-30、 T-47D、 WISH、 HBE135-E6E7、 ARPE-19/HPV-16、 10.014 pRSV-T、 GH354、 MDA-MB-436、 T98G [T98-G]、 Calu-6、 BEAS-2B、 G-292 、克隆A141B1 、 Detroit 539 、 MNNG/H0S Cl #5 [R-1059-D]、 BT-549、 NCI-H1915 [H1915]、 Hs 181.Sk、 Hs 839, T、 RD、 SK-N—MC、 20B8、 NCI-H292 [H292] 、 Hs 863. T、 Hs 181.Tes、 Malme- 3M、 Hs 617. Mg、 JAR、 Hs 144. We、 Hs 742. Sk、 Hs 875. T、 TE 161. T、 Hs 738.St/Int、 Hs 895.T、 RWPE-1、 TE 130.T、 TE 84.T、 HCC1008、 Hs 894 (E)Lu、 SK-LMS-1、 HFF-1、 MRC-5 [MRC5] 、 IRR-MRC-5 [ATCC X-55; ATCCX55;受辐照的MRC-5]、 WI-38 [WI 38] 、 HeLa、 HEKOOl、 FHs 74 Int、 Detroit 548、 Detroit 573、 SW-13、 293T/17、 C211、 Amdur II、 IMR-32、 HeLa [Chang Liver] 、 CHP 3 (M. W.) 、 CHP 4、 LL 47 (MaDo)、 HEL 299、 Detroit 562、 CCD-llLu、 KB、 A549 [A-549] 、 MDA-MB-134-VI、 HLF-a、 TE 354. T、 HeLa 229、 HeLa S3、 COLO 320DM、克隆l-5c-4 [Chang 结膜的Wong-Kilbourne衍生物(D)]、 CCD-13Lu、 CCD-8Lu、 CCD-19Lu、 CCD-16Lu、 AV3、 Hs888Lu、 CCD-25Lu、 C0L0 320HSR [C0L0 320 HSR]、 DLD-1、 C0L0 205、 C0L0 201、 HCT-15、 SW837 [SW-837]、 LoVo、 SW48 [SW-48]、 SW1463 [SW 1463; SW-1463] 、 SW 1353 [SW 1353; SW-1353]、 1205U [Wistar Special Collection的部分]、HCT-8 [HRT-18] 、 AGS、 HCT 116、 T84、 SNU-C2B、 SNU-C2A、 NCI-H716 [H716] 、 NCI-H747 [H747]、 NCI-H498 [H498]、 LS123、 NCI-H1688 [H1688]、 CFPAC-l、 L-132、 TE 353. Sk、肠407、 FL、 Detroit 525、 Detroit 510、 C32、 WI-38 VA—13 subline 2RA [Wistar Special Collection的部分]、瓜氨酸血症、 Cri du Chat、 WI-26 VA4 [Wistar Special Collection的部分]、BeWo、 WM35 [Wistar Special Collection的部分]、MST0-211H、 WRL 68、 NCI-H295 [H295]、 MCF 10A、 MCF 10F、 RWPE2-W99、 SV-HUC-l、 HCC202、 C3A [HepG2/C3A; Hep G2 (ATCC HB-8065)的衍生物]、MCF-10-2A、 293 c18、 F. thy 62891、 Lei Cap、 Sal Mat、 HCE-2 [50.B1]、 A2058、 RWPE-2、 Am Ric、 Lo Ren、 Ron Har、 H69AR、 hF0B 1.19、 Mar Vin、 SCC-4、 Be Sal、 Hs27、 B-3、 U Vin、 Ma San、 El Don、 SK-N-AS、 NCI-H1734 [H-1734; H1734 ]、 LNZTA3WT4 [LNZTA3p53WT4; WT4 ]、 LNZTA3WT11 [LNZTA3p53WTl1; WTll]、 Lo Wen、 NCI-H2227 [H2227]、 COLO 829、 HKB-ll、 CeAr、 90.74、 HRT-18G、 BeAr、 EmAr、 WinMec、 Ce Geg、 T0V-21G、 T0V-112D、 0V-90、 Ja Bos、 Fe Bos、 La Bel、 Bo Gin、 HS-5、 Le Ana、 Mel Neg、 LaBelII、 HEPG2/2. 2.1、 ProPakA. 6 [PPA.6 ; ProPak-A, 6]、 LNCaP克隆FGC [LNCaP. FGC] 、 HCN-1A、 HX [HT1080 xeno]、 HP [HT1080 poly]、 2A、 Ne Loc、 Jay Sen、 Bi Fin、 和Ray Hot。
可以用作靶细胞的病毒感染细胞包括，例如，被EB病毒、人类免 疫缺陷病毒、流感病毒、脊髄灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎 病毒、丙型肝炎病毒、水痘-带状疱渗病毒、风渗病毒、麻渗病毒、单 纯疱渗病毒、登革热病毒、乳头状瘤病毒、呼吸道合胞病毒或狂犬病 病毒感染的细胞。
在此处提供的方法中使用的靶细胞还可以是健康的细胞。在自身 免疫疾病患者中ADCC有可能涉及杀伤健康细胞，所述自身免疫疾病包 括自身免疫的甲状腺疾病、重症肌无力、类风湿性关节炎、系统性红 斑狼疮、免疫溶血性贫血(盘尼西林诱导的)、自身免疫性肝炎 (AIH)、格雷夫斯氏眼病、HIV[CD4缺失]、自身免疫性肠病、腹部疾 病、重症肌无力(MG)、贝切特(氏)病、甲状腺关联的眼病、自身免疫 性曱状腺炎、病毒性心肌炎、自身免疫性心脏病、炎性肠病、溃疡性 结肠炎、南美洲锥虫病、白斑病、克隆(氏)病、特发性血小板减少性 紫癜、自身免疫性中性粒细胞减少症、儿童期癫痫、川畸病(Kawasaki disease)、自身免疫性慢性活动性肝炎、糖尿病、多发性硬化症、抗 肾小球基底膜(GBM)肾炎、慢性活动性肝病(CALD)、肾小球肾炎(从 免疫复合物)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、无解释的男性不育症， 和移植排斥。因此，在此处提供的方法中使用健康细胞作为靶细胞可 用于研究在自身免疫疾病活移植注射中抗体和效应细胞是如何通过 ADCC杀伤健康细胞的。其中靶细胞是健康的细胞，它们可以是，例如， 获自于细胞库的细胞系，或是获自于患有自身免疫疾病个体的组织的 细胞。
在一些情况下，可以联合使用超过一种类型的靶细胞来，例如， 更接近地复制体内环境，其中抗体针对的可能是包含数种细胞类型的 靶器官和组织。因此靶细胞可以包括一种以上的细胞系，或者可以包 括来自于一种以上组织的细胞。在一些实施方案中，耙细胞包括两种
或两种以上或三种或三种以上的细胞类型。
此处描述的方法可被用于筛选具有诱导ADCC响应的能力的任意 抗体。因此本应用提供了筛选具有诱导针对靶细胞的ADCC的能力的候 选抗体的方法。该方法包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的 非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效应细胞 和抗体(例如，结合把细胞的抗体)；其中在加入效应细胞和抗体后 基质上的电极间的阻抗下降，表明候选抗体具有影响针对靶细胞的 ADCC的能力。
如此处所用，"阻抗下降"指的是其上铺有细胞的基质上的电极 之间的阻抗的任何下降。阻抗的下降可以是，例如，和以前测定的阻 抗相比阻抗下降了大约1%或更多、大约5%或更多、大约10%或更多、 大约15%或更多、大约20%或更多、大约25%或更多、大约40%或更多、 大约50%或更多、大约60°/。或更多、大约75%或更多、大约80%或更多、 大约90%或更多、或大约100%。
在此处提到的方法中使用的抗体或候选抗体可以是，例如，单克 隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在此处提到的方法中可以 使用的抗体还包括已经确定具有治疗潜力的抗体(例如，已经经过临 床试验的抗体)。
如此处使用，术语"抗体"指的是完整的分子及其片断，例如Fab、 F(ab0 2合Fv，其能结合靶细胞。通过"结合靶细胞"的意思是，抗 体对靶细胞的抗原是免疫特异性的，例如，靶细胞上的顶端抗原。
术语"免疫特异性的"的意思是，和对其它蛋白质(例如，其它 相关蛋白)的亲和性相比，对于靶细胞上的抗原抗体具有大得多的亲 和性。
"基本上更大的亲和性"的意思是，和对已知的含免疫球蛋白结 构域细胞表面识别分子的亲和性相比，抗体对靶细胞上的抗原具有可 测定的更大的亲和性。例如，和对已知的含免疫球蛋白结构域细胞表 面识别分子的亲和性相比，对靶细胞上的抗原的亲和性可以比前者大 至少l. 5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106 倍。
此处提供的方法还可以被用于释放或稳定性检测，所述检测用于
质量控制(QC)的目的。例如，可以使用如此处所述的方法检测抗体产 物，其中使用ADCC活性的存在或ADCC活性的水平来确定抗体产物符 合质量控制方针(例如，GMP(药品生产质量管理规范)或其它标准)。 在 一 些情况下，仅仅ADCC活性的存在就可以被用作抗体符合质量控制 方针并且适合释放的质量判定。因此这种方法在确定存在检测抗体时 阻抗下降以外可以不需要解释。在一些实施方案中，待验证ADCC抗体 的样品可以被故意降解并用作阴性对照，用于和待释放的抗体进行比 较。可以比较两种样品的实时ADCC读出曲线，并且可以建立定量的或 定性的取舍点用于质量控制验证。可以通过反复试验来确定确切的浓 度依赖性响应和检测参数。
相似的，此处描述的方法可被用于验证小分子或其它ADCC活性抑 制剂的QC和稳定性，通过监测其加入到靶细胞中后出现响应-实时 ADCC信号减小。
可以通过ADCC发生作用的可用抗体的例子包括，但不限于，用于 治疗变态反应和哮喘的抗体，例如，Daclizumab (Protein Design Labs/Roche)和CAT-354 (Cambridge Antibody Technology);用于治 疗自身免疫性疾病的抗体，例如MDX- H210 (Medarex/Novartis)、 Campath* alemtuzumab (ILEX Oncology)和 Daclizumab (Protein Design Labs/Roche);用于治疗癌症的抗体，例如Campath" (ILEX Oncology), R1550 (hu訓FGl， Therex， Antisome/Roche)， Herceptin* (Genentech)， 0mnitarg (Genentech)， Tastuzu咖b-DMll (Genentech/Immunogen)， MDX-OIO (Medarex)， Avastin* (Genentech), Mab-17-I (edrecolomab-IGN101， Igeneon, EDR或Panorex- GSK), labetuzumab， (I隱105) (Immunomedics)， Tarvacin (Peregrine), Theragyn, Therevex (Pemtumomab) (Antisoma/Roche)， TheraCIM hR3 (YM Biosciences/0ncoscience)，HuMax-EGFr (Genmab), SGN-40 (Seattle Genetics),SGN-30 (Seattle Genetics), Rituxan*
(Rituzan⑧Ge織tech/Biogenldec) ， HuMax-CD4 (Ge腿b) ， MDX-060 (Medarex)， Siplizumab (Medlmmune)， AME- 133 (Applied Molecular Evolution/Ully) ， galiximab (Anti-CD80 Mab Biogenldec)， 腿ax-DC20 (隨ax cd20) (Genmab) ， LymphoCide (epratuzumab， Im隠omedics)， MDX-010+gp 100肽(Medarex)， MDX- 010 +/-化疗 (Medarex)， MDX-010 +黑色素瘤肽(Medaex) ， AHM (Roche/Chugai)， OvaRex (AltaRex/Unither Pharma-ceuticals) ， J59I (Biovation/Millennium)， Rencarex (WX-G250)
(Wilex/Centocor〃ohnson & Johnson), WX-G250+IL-2/IFN (Wilex)， TRAIL-RlmAb (HGS-ETR1 Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences), TRAIL-R2mAb (HGS-ETR2Cambridge Antibody Technology/HumanGenomeSciences), Vitaxin (MEDI—522 Medlmmune)， WX-K931 (Wilex)， MT201 (Micromet/Serano), MDX-214 (Medarex), Erbitux (cetuximab, IMC-C255 Imclone， Bristol-Myers Squibb) ， MEDI-507 (Medimmune)， TRU-015 ( —种抗体衍生物， Trubion), Matuzumab (EMD-72000， EMD Pharmaceuticals/ Merck KGaA)， Mab ICR62, CHIR-12. 12 (Chiron/X0MA) ， huGl-M195 (NCI) MOR102 (MorphoSys)， Remitogen (IDIO， II型抗-MHC， Protein Design Labs)和IGN312 (Igeneon);用于治疗心血管疾病的抗体，例 如ABC-48 (AERES);用于治疗感染性疾病的抗体，例如MDX-010 (Medarex);用于治疗炎性疾病的抗体，例如Humira (Cambridge Antibody Technology/ Abbott), Anti- CDlla MAb (Biovation)， MLN02(Millennium/Genentech/Roche),Daclizumab (Protein Design Labs), Enbrel (TNF受体和IgGl的融合物(Amgen/Wyeth)， Remicade (Centocor)，和TRU-016 (—种抗体衍生物，Trubion);用 于治疗肾病的抗体，例如HumiraTM (Cambridge Antibody Technology/ Abbott)和Rituxan* (Ge雄tech/BiogenIdec) ，和其它抗体，例如的 AMG162 (A迈gen)(用于治疗骨质疏松)，Erbitux - C255， BTI-322, Etanercept和Infliximab。
其中此处提供的方法被用于研究在自身免疫性疾病中的ADCC响 应，抗体可以是，例如，获自于患有自身免疫性疾病的个体的自身抗 体。可以使用例如本领域技术人员已知的方法(例如，亲和纯化)获 得这种抗体。
在一些情况下，有可能希望向检测培养基中加入一种以上的抗体 来检测，例如，抗体是否发生协同作用或者它们是否相互干扰其诱导 ADCC的能力。因此此处提供的方法可以包括向检测培养基中加入2、 3、 4、 5或5种以上的抗体。
在此处提供的方法中使用的效应细胞典型的是表达一种或多种 Fcv受体的细胞。合适的效应细胞包括，但不限于，外周血单核细胞 (PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞。
存在一些Fcy受体家族，并且不同的受体细胞表达不同的Fc受 体。例如，中性粒细胞通常表达Fc yRI (CD64)、 FcyRII (CD32)和 FcyRIII的脂锚定异型体(CD16)，而天然杀伤(NK)细胞只表达Fc y RIII的跨膜异型体。此外，在Fc受体中存在多态性。例如，M细胞 上的FcyRIII在位置158含有一个Phe/Val多态性，已经显示影响 IgG结合。在此处描述的方法中使用的效应细胞可以根据其表达的Fc 受体进行选择，并且在一些实施方案中它们表达多态性形式的Fc受 体。因此，此处描述的方法可用于测定抗体和表达已知Fcy受体(例 如，具有特定多态性的)的效应细胞的特定组合是否能够通过ADCC 杀伤靶细胞。这种实验可用于IgG被Fc受体结合的机制的广泛研究， 并且能够确定Fc受体和IgG Fc区域中对结合起关键作用的残基。并 且，这种实验可以开发拥有Fc区域序列的治疗性抗体，所述Fc区域 序列显示和效应细胞上的Fc受体最优结合，因此使ADCC最大化。这 种实验还可用于测定对于已有治疗性抗体的最适效应细胞基因型，使 能够诱导出ADCC响应，因此可以检测预期患者是否具有最适基因型的 Fc受体。
在一些实施方案中，在此处描述的方法中使用的效应细胞是 PBMC。 PBMC是单核细胞与淋巴细胞的混合物，可以使用例如本领域中
以及在下面实施例中描述的标准实验步骤从全血中提取PBMC。在PBMC
抗读数的混乱。但是令人吃惊的是，发明人已经发现，在加入抗体和 PBMC后阻抗或者细胞指数的变化是乾细胞ADCC的准确指征。在此处 提供的方法中，全血，或至少部分纯化的血(这样它富集了或部分富 集了效应细胞(例如PBMC))也是有用的。
此处提供的方法具有多种临床用途。如上面讨论的，在人Fc受体 中存在多态性，对效应细胞结合抗体的能力有影响，并且可能影响效 应细胞介导ADCC的能力。效应细胞在个体中结合治疗性抗体的能力， 可以对抗体的临床效果有较大的影响。例如，在B恶性淋巴增生治疗 中使用的抗-CD20 IgG抗体Rituxar^在Fc y RIII158V纯合基因型患者 中能够产生比在FcYRIII158F纯合基因型患者中更好的临床结果，有 可能是因为带有Fc y RIII158V的NK细胞能更有效率地结合Rituxan。 的Fc区域。
能够使用来自于个体(例如，患者)的PBMC作为效应细胞，意味 着此处提供的方法可用于确定特定的治疗性抗体是否适合治疗特定的 患有和乾细胞相关的疾病或紊乱的患者。相应的，在一些实施方案中， 效应细胞可以是获自于患有和靶细胞相关的疾病的患者的PBMC，并且 抗体可以是用于治疗患者的候选的治疗性抗体。因此，本文提供了确 定患有靶细胞相关疾病的接受者适合接受候选抗体治疗的方法。该方 法可以包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上 的电极之间的阻抗；和(b)向靶细胞中加入分离自患者的PBMC和候选 抗体；和(c)测定加入PBMC和抗体后基质上的电极之间的阻抗是否出 现变化，其中电极之间的阻抗下降，表明出现ADCC，因此患者适合接 受该抗体的治疗。
在一些实施方案中，靶细胞可以是和B恶性淋巴增生相关的细胞， 并且候选抗体可以是RUuxai^。才艮据这个实施方案，此处提供的方法 可用于测定B恶性淋巴增生患者是否适合接受R i tuxan"台疗。当然， 该方法可以使用来自于特定患者的PBMC和此处描述的其它任意抗体
与靶细胞，来确定用于治疗患者的最适抗体。此外，当已经确定PBMC 和特定抗体能诱导ADCC时，可以测定PBMC的基因型，并使用标准基 因分型方法检测其他个体的PBMC，来确定他们是否适合接受该抗体的 治疗。
当使用来自于个体的PBMC作为效应细胞时，乾细胞也可以是来自 于个体的细胞(例如，从活组织检查样本中获得的癌细胞)，因此该 方法是一种测定特定候选抗体与接受者的PBMC联用是否能够通过 ADCC杀伤患者中的靶细胞的个体化方法。因为可以使用更多的抗体产 品了 ，所以此处提供的方法能够选择最佳的抗体产品来优化在特定患 者中的临床结果。
此处提供的方法还适合于筛选化合物增强或减弱不同效应细胞和 抗体的组合诱导的ADCC的能力。相应的，本文提供了筛选化合物调节 ADCC能力的方法。该方法可以包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基 中生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；(b)向检测培养基中加入化 合物、效应细胞和结合乾细胞的抗体；和(c)通过比较存在化合物时加 入效应细胞和抗体后基质上的电极之间的阻抗的任何变化和不存在化
来测定该化合物是否调节ADC(C ' 57 、
如此处讨论的，加入效应细胞和抗体后阻抗的下降表明在检测培 养基中ADCC受到了影响。在存在被筛选化合物时观察到阻抗出现进一 步下降表明该化合物增强ADCC。相反的，在存在被筛选化合物时观察 到阻抗出现增长表明该化合物减弱ADCC。在一些情况下，有可能希望 鉴定出增强ADCC的化合物。例如，可使用该方法鉴定能增强治疗性抗 体和针对癌细胞的PBMC所诱导的ADCC反应的化合物。在其它情况下， 有可能希望鉴定出减弱ADCC的化合物。例如，可使用该方法鉴定能减 弱抗体和来自于自身免疫性疾病患者的PBMC所诱导的针对健康靶细 胞的ADCC反应的化合物。在一些情况下，发现化合物没有调节ADCC 的作用也可能是有用的，因为这表明该化合物(其有可能具有其它的 治疗目的)不会干扰特定的效应细胞-抗体组合诱导ADCC的能力。
该方法可以使用此处描述的任何靶细胞、效应细胞和抗体。在一 些实施方案中，使用的效应细胞-抗体组合可以是已经被确认能够诱导
出针对所谈论靶细胞的ADCC反应的组合。待筛选化合物可以和效应细 胞与抗体一起加入到靶细胞中。此外，待筛选化合物可以在效应细胞
和抗体之前加入到乾细胞中，或在效应细胞和乾细胞之后。
在此处提供的方法中，可以根据调节ADCC的能力进行筛选的化合 物包括，但不限于，肽、类肽、蛋白质、脂质、金属、有机小分子、 RNA适体、抗生素和其它已知的药物制剂、多胺及其组合或衍生物。 有机小分子典型的分子量为大约50道尔顿到大约2， 500道尔顿(例如， 从大约300到大约800道尔顿)。
候选化合物可以来自巨大的合成或天然化合物库。例如，可以从 MayBridge Chemical公司 (Revillet， Cornwall，英国)或Aldrich公 司(Milwaukee, WI)购买合成化合物库。选择性的，可以使用以细菌、 真菌、植物和动物提取物形式存在的天然化合物库。此外，候选化合 物可以是使用组合化学合成生产的，作为单独的化合物或作为混合物。
在一些实施方案中，待筛选的化合物可以是已经用于治疗与靶细 胞相关的疾病的化合物，并且抗体可以是被开发用于治疗该疾病的抗 体。例如，当靶细胞是癌细胞时，待筛选的化合物可以是化疗试剂， 而抗体可以是被开发用于治疗癌症的治疗性抗体。因此此处提供的方 法可用于测定化疗试剂是否增强或减弱抗体通过ADCC对靶细胞的杀 伤作用。相似的，待筛选的化合物可以是在自身免疫性疾病患者中调 节ADCC的化合物。在这种情况下，加入的抗体可以是在患有自身免疫 性疾病的个体中通过ADCC引起自身免疫活性的抗体。
在一些实施方案中，此处描述的方法可以是高通量方法，同时评 价抗体、效应细胞和把细胞的多种组合产生ADCC反应的能力，可选的， 在存在有可能调节ADCC反应的化合物时进行上述评价。在这种实施方 案中，把细胞可以铺板于含有两个或两个以上孔的非导电基质上，每 个孔至少包含两个电极，并且该方法可以包括监测每个单个孔中的电 极之间的阻抗的任何变化。此处描述的RT-CES'系统以及相关软件适合
用于高通量检测。
在一些实施方案中，加入到每个孔中的靶细胞、抗体和效应细胞 可以是相同的或不同的，依赖于检测的目的。在一些实施方案中，例 如，该方法可用于同时检测多种候选治疗性抗体在存在来自于一名患
者的PBMC或来自于多名患者的PBMC的情况下诱导针对多种把细胞的 ADCC的能力。这种高通量方法还可用于同时检测单个候选抗体在存在 相同效应细胞时在不同抗体浓度下诱导针对相同把细胞、或多种不同 靶细胞的ADCC的能力。此外，这种高通量方法可用于同时比较多种不 同的抗体的ADCC动力学。高通量检测还可用于根据调节ADCC反应的 能力筛选化合物，如上面讨论的。
此外，使用此处所述的方法作为高通量方法的一部分能够并行进 行对照实验和上述检测ADCC的方法。例如，合适的对照检测可包括铺 板并生长耙细胞，以及在没有效应细胞和抗体的情况下检测阻抗。进 一步的对照实验可包括向铺板的靶细胞中单独加入效应细胞或单独加 入抗体。
在下面的实施例中将进一步描述发明，这些实施例不限制在权利 要求中描述的发明的范围。 实施例 1.前言
ACEA Biosciences (San Diego， CA) RT-CES* (实时细胞电子传 感器)系统使用了 一种阻抗的电子读出器，以实时的方式非侵入地定量 细胞状态。细胞接种于E-Plate微孔板(ACEA Biosciences)中，和微
电极传感器阵列整合。细胞和微电极表面的相互作用导致细胞-电极阻 抗反应的产生，这指明了细胞在形态学、粘附质量和数量方面的状态。 ACEA被用于开发粘附细胞的实时ADCC检测。使用了两种细胞系 SKBR3 ( —种乳腺癌细胞系)；和MG63 ( —种成骨细胞细胞系)，SKBR3 是一种粘附细胞系，过量表达HER-2抗原。Herceptin"是一种针对 HER-2的人源化IgGl抗体，在存在效应细胞时介导通过ADCC的对SKB R3细胞的杀伤作用。MG63是一种粘附细胞系，过量表达M-SCF。 Chir-RXl是一种针对M-CSF的人源化抗体，在存在效应细胞时介导针 对MG63细胞的ADCC。
进行实验来测定ACEA系统是否能用于实时监测由PBMC效应细胞 和HercepUn'或RX-1介导的、通过ADCC对SKBR3和MG63乾细胞的 杀伤作用。
2. 靶细胞、抗体和PBMC制备
SKBR3细胞(ATCC， Manassas, VA;编号#HTB-30)在DME-15培 养基中培养。
在使用前用水重新溶解人源化抗体Herceptin8 ( Genentech Corporation, South San Francisco, CA; 商标名 Trastuzumab)来 配制成21 mg/ml的储备溶液。重新溶解后Herceptitf能稳定存在30 天。
从来自于健康志愿者的人血中新鲜制备人PBMC。在黄头柠檬酸铵 (ACD-A)管中收集人静脉血样品(8. 5ml)。将管倒转10-15次，并从黄 头管中移出全血到一个50 ml的圆锥形管中。按1: 3使血被2% FBS 的PBS稀释。将12 ml的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque， Amersham Biosciences, Piscataway， NJ; cat #17- 1440-02 )緩慢沉降于血 液/PBS混合物的下面。在室温下以2350 rpm离心样品30分钟，随后 吸去上层(血浆/PBS)。用无菌移液管收集血沉棕黄层并收集到50ml 圆锥形管中。如果在血沉棕黄层下残留有可见的WBC团块，收集所有 的WBC，小心不要移有过量的聚蔗糖-泛影葡胺。加入无菌的PBS-2% FBS 使体积达到30 ml,反转混合混合物。在室温下以250 x g (1046 rpm， Beckman GH3. 8转子)离心稀释的PBMC悬液17分钟，收集细胞沉淀。 将PBMC沉淀悬于2.5 ml R-2培养基(含294热灭活FBS的RPMI-1640 培养基)中，完全混合，并移到15 ml圆锥形管中。
用R-2培养基清洗PBMC —次，并用台盼蓝(Invitrogen cat. #15250-061或类似产品)排斥法检查活细胞的数量。
3. 检测利用Herceptin'和PBMC的SKBR3的ADCC杀伤作用 在进行ADCC检测之前，进行一些试验来检测单独SKBR3细胞，和
Herceptirf抗体或和PBMC效应细胞对RT-CES"系统中的细胞指数读数 的效果。
以每孔40K、 20K、 10K或5K个SKBR3细胞的密度铺板并置于 RT-CES"读出器中。20小时后加入新鲜的培养基，并监测100小时的细 胞指数。如图1所示，当SKBR3细胞增殖时细胞指数增加。细胞指数 的最大检测限为60K到160K细胞每孔。
在后续实验中，以40K每孔铺板SKBR3细胞。20小时后，在一组 孔中加入新鲜培养基，并在第二组孔中加入含Triton X-100的PBS， 并将板放回到读出器中。如图2所示，在加入Triton X-l00后细胞指 数出现下降，表明了细胞死亡。
在进一步的实验中，以20K每孔铺板SKBR3细胞，并在20小时后 加入单独的培养基、Herceptin"、或IgG对照抗体。和未加抗体的细 胞指数相比，单独加入Hercepti『或IgG没有显著改变细胞指数(图 3)。
以20K每孔铺板SKBR3细胞所得到的细胞指数和以最终数量为5 X 105细胞每孔向单独培养基中加入PBMC所得到的细胞指数进行比较。 令人惊讶的是，PBMC对细胞指数没有显著影响(图4)，表明在ADCC 检测中使用PBMC作为效应细胞不会干扰SKBR3细胞死亡的精确检测。 当向含有以20K每孔铺板的SKBR3细胞的孔中加入PBMC时，细胞指数 下降(图5 )，表明单独的PBMC效应物具有针对SKBR3靶细胞的NK 杀伤效果。
随后进行一个检测来测定在存在PBMC效应物时通过靶抗体 Herceptin的SKBR3细胞ADCC杀伤作用。以20K每孔铺板靶细胞，20 小时后开始进行ADCC检测。在开始进行ADCC检测时，从ACEA系统中 暂时取出板，来加入抗体和效应细胞。
以25:1 (效应物靶)的比例向SKBR3靶细胞中加入PBMC效应 细胞，以及终浓度为5 jig/ml的Herceptii^抗体。随后将细胞板放 回到ACEA系统中继续监测后续48小时的细胞指数。图6显示了单独 SKBR3细胞、SKBR3细胞和PBMC以及SKBR3细胞和Herceptir^抗体和
PBMC的细胞指数。在加入PBMC和Herceptir^后记录到细胞指数的剧 烈下降，反映了 SKBR3细胞被ADCC杀伤。
重复进行实验，使用50: 1或12. 5 : 1 E: T比例的SKBR3细胞和 PBMC效应物，带有或不带有浓度为5 ng/ml的HerceptiiT。图7显 示了在这些实验中的ADCC杀伤时间曲线，以细胞裂解百分比进行测 量，根据下面的方程式进行计算
%裂解=100 X (未用抗体处理的细胞指数-用抗体处理的细 胞指数)/未用抗体处理的细胞指数
图7的结果表明在存在Herceptina和PBMC时，作为ADCC的结果， 细胞裂解出现剧烈增加。
4.实时ADCC检测和Calcein AM释放ADCC检测的比较
进行实验来比较使用实时ADCC检测测量到的％裂解和使用标准的 Calcein AM释放ADCC检测测量到的％裂解。
采用下面的流程进行Calcein-AM检测。融化一瓶在干燥DMSO中 的1 mg/ml Calcein AM溶液(Molecular Probes, Eugene, OR; 编 号# C-3099 )，并用移液器温和混匀。
为了标记SKBR3细胞，去除培养基并用10 ml单独的PBS (不含 胎牛血清(FBS))清洗单层细胞。加入5 ml EDTA/PBS并在37E中 赙育10分钟，使单层细胞脱离。加入IO ml新鲜的R10 (含有10%热 灭活FBS、 Pen/Strep (最终100 n g/ml)和L-谷氨醜胺(最终2 mM) 的RPMI-1640培养基)。收集细胞，离心，并计数，将2. 5 X 106个 细胞转移到新的15 ml管中。在15 ml圆锥形管中使细胞悬浮于2. 5 ml R-10中，并在每管中加入12. 5 nl的Calcein AM (最终5pM)。将 管在37t;潮湿的5%0)2中孵育30分钟，确保盖是松的。每10分钟温 和混合细胞来避免沉降。用10 ml R-2(含有2%热灭活FBS的RPMI-1640 培养基)清洗标记的细胞两次。细胞悬于R-10培养基中得到5X105细 胞/ml。
以20K每孔铺板耙SKBR3细胞用于ADCC检测。在开始ADCC检测 时，以25 : 1的比例将PBMC效应细胞加入到靶细胞中，并加入如图
8所示浓度的对照抗体IgG或Herceptin*。乾细胞、效应细胞和抗体 的混合物在3"7X:中孵育4小时。孵育结束时沉淀细胞并检测上清中 Calcein AM的释放。
在分析前对于每种个别的靶细胞系都减去每种乾的平均背景培养 基对照，并使用下面的方程式计算最小(min)比最大(max)百分比
%最小最大=100 X平均自发释放cpm/平均最大释放cpm
如果最小释放比最大释放的百分比超过了 37%，该检测被认为是 无效的。使用下面的方程式根据三点平均值计算出特异性裂解百分比
%裂解=100 X (平均试验cpm -平均自发释放cpm ) / (平 均最大释放cpm -平均自发释放cpm)
使用Calcein- AM assay检测测量到的裂解百分比显示于图8B。 图8 A显示了使用RT-CES"系统进行的平行检测所测量到的裂解百分 比。SKBR3耙细胞铺板18-20小时，随后加入和Calcein-AM检测相同 比例和浓度的PMBC效应细胞和IgG或Herceptin"抗体。使用RT-CES 系统检测到的裂解百分比是Calcein-AM标记所检测到的裂解百分比 的2倍。这有可能是因为如下事实Calcein-AM检测需要细胞悬浮起 来，而在RT-CES检测中细胞是粘附的。
5.通过RX-1单克隆抗体和PBMC的MG63细胞的ADCC杀伤的检
测
以20K细胞每孔铺板MG63和SKBR3细胞，并监测24小时的细胞 指数。SKBR3细胞的生长和细胞指数具有线性关系，而MG63细胞的生 长通常没有这种关系(图9)。但是，在大约7小时和大约17小时之 间，MG63细胞的生长和细胞指数之间存在近似的线性关系，表明对于 MG63细胞应该在该时间段内进行ADCC检测。
在以20K每孔铺板的MG63靼细胞中进行了 ADCC检测。将单独的 MG63细胞的细胞指数和在18-20小时后加入PBMC、 PBMC和IgG对照 抗体、或PBMC和RX1抗体的MG63细胞的细胞指数进行了比较。在每 个实验中PBMC效应物比MG63乾细胞的比例为50:1,加入的抗体的浓 度为5 jig/ml。如图IOA所示，在加入PBMC和RX1后，因为MG63细
胞的ADCC，细胞指数下降。但是，ADCC的动力学和使用SKBR3细胞、 存在PBMC、 PBMC和IgG、或PBMC和Herceptina的情况下重复相同的 实验所观察到的动力学不同(图10B)。这些结果证明了实时ADCC检 测在提供ADCC动力学详细信息中的效果。 6.结论
此处描述的ADCC检测比目前的检测ADCC方法有所改进。和标准 检测不同，基于RT-CES。的检测可用于实时跟踪ADCC杀伤，并能详细 跟踪ADCC的动力学。和目前已有的其它ADCC检测相比该检测更加灵 敏、更快速，并且具有为高通量筛选进行优化的潜力。此外，该检测 是无标记的和无放射性的，或者需要降低水平的标记，使其比涉及放 射性标记的检测更加安全，例如。因为该检测可以在粘附细胞上进行， 不需要从基板上脱离，因此它们在体内能更精确的测定细胞的ADCC。 因此，此处描述的ADCC检测将增强检测候选治疗性抗体ADCC活性的 能力。
此外，此处提供的ADCC检测可用于鉴定适合接受特定抗体治疗的 患者群体。如上面讨论的，可使用PBMC作为效应细胞进行该检测。在 PBMC效应细胞上的Fc受体中存在多态性，能够影响效应细胞结合靶 特异性抗体的能力，并因此介导ADCC。此处提供的ADCC是快速并且 容易的检测，可用于测定来自于特定患者的PBMC和治疗性抗体联用是 否能够介导靶细胞的ADCC。
总之，在药物开发工业中和在用于研究抗体介导的免疫反应的基 础研究中，此处提供的ADCC检测方法都具有改变ADCC检测方式的潜 力。
其它的实施方案
可以理解的是，虽然结合对发明的详细描述而对发明进行了描述， 但是上面的描述是对发明的范围的说明而不是限制，发明的范围被附 加的权利要求的范围所定义。其它方面、优点和变更都在下面的权利 要求的范围之内。
权利要求
1. 一种检测抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效应细胞和结合靶细胞的一种抗体；其中加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗下降，表明在检测培养基中ADCC功能已经生效；其中加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗增高或未改变，能够表明在检测培养基中未发挥ADCC功能。
2. 根据权利要求l的方法，包括在有规则的间隔中测量阻抗。
3. 根据权利要求2的方法，包括包括从每次阻抗测量中导出细胞指数(67)并确定细胞指数是否 发生变化，其中使用下面的公式从每次阻抗测量中导出细胞指数，其中^C和A^C分别是在细胞存在或不存在情况下的频率依 赖性电极电阻，N是阻抗检测处的频点数。
4. 根据权利要求1到3中任一项的方法，其中使用RT-CES"系统 进4亍i亥方法。
5. 根据权利要求1到4中任一项的方法，其中每15分钟进行阻 抗测量。
6. 根据权利要求1到4中任一项的方法，其中该方法进一步包括 铺板靼细胞。
7. 根据权利要求6的方法，其中靶细胞被铺板18到24小时后加 入抗体和效应细胞。
8. 根据权利要求1到4中任一项的方法，其中乾细胞在基质上是 单层的。
9. 根据权利要求1到8中任一项的方法，其中把细胞以2K和100K 每孔之间的密度铺板。 11中任一项的方法, 11中任一项的方法: 11中任一项的方法, 15中任一项的方法:
10. 根据权利要求1到8中任一项的方法，其中靶细胞以15K和 25K每孔之间的密度铺板。
11. 根据权利要求1到8中任一项的方法，其中靶细胞以大约20K 每孔的密度铺板。
12. 根据权利要求1到11中任一项的方法，其中效应细胞比靶细 胞(E:T)的比例为25: 1。
13. 根据权利要求l到
14. 根据权利要求l到
15. 根据权利要求l到
16. 根据权利要求l到 100pg/ml之间的浓度加入抗体。
17. 根据权利要求1到15中任一项的方法， 50pg/ml之间的浓度加入抗体。
18. 根据权利要求1到15中任一项的方法， 8 ji g/ml之间的浓度加入抗体。
19. 根据权利要求1到18中任一项的方法， 加入2种或2种以上的结合靶细胞的抗体。
20. 根据权利要求1到18中任一项的方法 加入3种或3种以上的结合耙细胞的抗体。
21. 根据权利要求1到18中任一项的方法， 加入4种或4种以上的结合乾细胞的抗体。
22. 根据权利要求1到21中任一项的方法， 抗原。
23. 根据权利要求22的方法，包括筛选表达顶端抗原的乾细胞的 预先步骤。
24. 根据权利要求1到23中任一项的方法，其中靶细胞是癌细胞 或病毒感染的细胞。
25. 根据权利要求24的方法，其中靶细胞是癌细胞。
26. 根据权利要求25的方法，其中癌细胞来自于细胞系。其中E:T大于10:1。 其中E:T大于50: 1。 其中E:T大于100: 1。 其中以大约1和大约其中以大约1和大约其中以大约2和大约包括向检测培养基中包括向检测培养基中包括向检测培养基中其中靶细胞表达顶端
27. 根据权利要求26的方法，其中癌细胞是SKBR3细胞或MG63细胞。
28. 根据权利要求1到27中任一项的方法，其中效应细胞包括外 周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T淋巴细胞或中性粒细胞。
29. 根据权利要求28的方法，其中效应细胞是PBMC。
30. 根据权利要求1到27中任一项的方法，其中步骤(b)包括向 靼细胞中加入已经部分富集效应细胞的全血。
31. 根据权利要求1到27中任一项的方法，其中步骤(b)包括向 效应细胞中加入全血，并且其中全血包含效应细胞。
32. —种才艮据诱导针对靼细胞的ADCC的能力筛选候选抗体的方 法，包括(a) 监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极 之间的阻抗；和(b) 向检测培养基中加入效应细胞和结合靶细胞的候选抗体； 其中加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗下降，表明了候选抗体具有影响针对靶细胞的ADCC功能的能力，而其中在加入 效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗增高或未改变，表明了候 选抗体不具有影响针对靶细胞的ADCC功能的能力。
33. —种鉴定患有和靶细胞相关疾病的病人的方法，其中所述靶 细胞适合接受候选抗体治疗，该方法包括(a) 监测支持和疾病相关的靶细胞在检测培养基中生长的非导电 基质上的电极之间的阻抗；(b) 向乾细胞中加入分离自患者的PBMC和候选抗体；和(c) 测定在加入PBMC和抗体后，基质上的电极之间的阻抗是否存 在变化，其中基质上的电极之间的阻抗下降，表明病人适合接受该抗体 治疗，而在加入PBMC和抗体后，基质上的电极之间的阻抗增加或没有 变化，表明病人缺乏接受该抗体治疗的适合性。
34. —种根据调节ADCC的能力筛选候选化合物的方法，包括 (a) 监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极 之间的阻抗；(b) 在存在或不存在候选化合物的情况下，向检测培养基中加入效 应细胞和一种抗体，其中所述抗体和靶细胞结合；和(c) 比较存在候选化合物时加入效应细胞和抗体后基质上的电极体后基质上的电极之间的阻抗出现的任何变化，其中存在候选化合物时 阻抗的变化大于不存在候选化合物时阻抗的任何变化，表明该候选化合 物具有调节ADCC的能力。
35. 权利要求34的篩选方法，其中待筛选的化合物调节自身免疫 相关的ADCC,
36. 根据以前任意权利要求的高通量检测方法，并且其中非导电 基质包含2个或2个以上的微量滴定孔，每个孔包含至少2个电极，并 且监测每个孔中的电极之间的阻抗。
37. 权利要求l的方法，其中抗体来自于自身免疫性疾病患者。
38. —种抗体质量控制检测，包括(a) 监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极 之间的阻抗；和(b) 向检测培养基中加入效应细胞和抗体，其中所述抗体和把细胞结合；其中在加入效应细胞和抗体后基质上的电极之间的阻抗下降，表 明该抗体适合被释放用于ADCC诱导，而其中在加入效应细胞和抗体后 基质上的电极之间的阻抗上升或不变，表明抗体不适合被释放用于ADCC 诱导。
39. —种抗体质量控制检测，包括(a) 监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极 之间的阻抗；(b) 向检测培养基中加入效应细胞和抗体，其中所述抗体和乾细胞 结合；和 (C)比较加入效应细胞和抗体后基质上的电极之间的阻抗出现的 任何变化和加入效应细胞和对照抗体后对照样品的阻抗出现的任何变化；其中加入效应细胞和抗体后阻抗的下降大于加入效应细胞和对照 抗体后对照样品的阻抗的任何下降，表明该抗体适合被释放用于ADCC 诱导，而其中加入效应细胞和抗体后阻抗的下降不大于加入效应细胞和 对照抗体后对照样品的阻抗的任何下降，表明该抗体不适合被释放用于 ADCC诱导。
40. 根据权利要求39的质量控制检测，其中加入效应细胞和抗体 后阻抗的下降至少比加入效应细胞和对照抗体后对照样品的阻抗的下 降大25%,表明该抗体适合被释放用于ADCC诱导。
41. 一种筛选用于治疗自身免疫性疾病的候选化合物的方法，包括(a) 监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极 之间的阻抗，其中所述靶细胞是健康的细胞；(b) 在存在或不存在候选化合物的情况下向检测培养基中加入效 应细胞和抗体，其中所述抗体和靶细胞结合，并且其中效应细胞是来自 于被诊断有自身免疫性疾病的受试者的PBMC;和(c) 比较存在候选化合物时阻抗的任何变化与不存在候选化合物 时阻抗的任何变化，其中不存在候选化合物时阻抗的下降大于存在候选 化合物时阻抗的任何下降，表明该候选化合物适合作为治疗自身免疫疾 病的试剂，而其中不存在候选化合物时阻抗的下降不大于存在候选化合 物时阻抗的任何下降，表明该候选化合物不适合作为治疗自身免疫疾病 的试剂。
42. —种确定候选抗体是否适合治疗患有自身免疫疾病的接受者 的方法，包括(a) 监测在支持自身免疫疾病相关靶细胞生长的非导电基质上的 电极之间的阻抗；和(b) 向靶细胞中加入候选抗体和分离自接受者的PBMC;和(c)测定在加入PBMC和候选抗体后基质上的电极之间的阻抗是否 改变，其中电极间的阻抗下降，表明抗体适合用于治疗接受者，而其中 电极间的阻抗不下降，表明抗体不适合用于治疗接受者。
43. —种确定诱导ADCC响应的抗体的最适浓度的方法，包括(a) 监测支持靶细胞的两种或两种以上样品在检测培养基中生长 的非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b) 向乾细胞的两种或两种以上样品中加入效应细胞和抗体，其中 所述抗体和靶细胞结合，并且其中向靶细胞的两种或两种以上样品中加 入不同浓度的抗体；其中在加入效应细胞和抗体后基质上的电极间的阻抗下降，表明 在检测培养基中ADCC功能受到影响，并测定导致阻抗最大下降的抗体 浓度，作为最适浓度。
44. 一种测定抗体是否结合靶细胞上的顶端抗原的方法，包括(a) 监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极 之间的阻抗；和(b) 向靼细胞中加入效应细胞和抗体；其中加入效应细胞和抗体后基质上的电极间的阻抗下降，表明抗 体结合耙细胞上的顶端抗原。
全文摘要
本发明涉及用于检测抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，该方法不需要标记，并可以实时地对粘附的细胞进行。该方法包括例如，(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效应的细胞和结合靶细胞的一种抗体；其中加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗下降表明在检测培养基中ADCC功能已经生效。
文档编号G01N33/50GK101395471SQ200780006549
公开日2009年3月25日 申请日期2007年1月4日 优先权日2006年1月4日
发明者J·库尼奇, 诚 刘 申请人:诺华公司