专利名称：一种利用轮虫检测水中全氟辛酸毒性的方法
技术领域：
本发明涉及ー种利用萼花臂尾轮虫检测水中全氟辛酸毒性，属于环境检测技术领域。
背景技术：
全氟辛酸(PFOA)是ー种全氟有机酸，具有疏水和疏油的特性，在碳氧化合物表面能使氟化物具有极高的表面活性，且耐高温和耐强氧化剂，化学结构远较其他表面活性剂稳定，因此被广泛用于数百种化学エ业、机械エ业和日用全氟化工产品中。20世纪50年代以来，大量用于生产皮棉品和地毯防污剂、机械润滑剂、涂料、制冷剂、表 面处理剂、泡沫灭火剂、医药品和化妆品，以及电子产品的生产和化学镀膜领域。其大量生产和使用已在全球生态系统中造成了严重的环境累积和持久性污染，成为严重威胁生态环境和人群健康的安全隐患。2005年，美国环境保护署(EPA)将PFOA列为可疑致癌物质。由于该类物质的极性和迁移性使其可以在不被降解的情况下进入海洋或地下水中，对水体中的生物体构成威胁。急性毒性数据显示，PFOA类物质半致死浓度远高于环境中的实际含量。因此，关于PFOA的低剂量、长期慢性毒性研究更具有现实意义。目前，人类对PFOA等全氟有机化合物对水体中的生物体的毒性影响主要集中在大型植物、两栖动物、鱼类、蛘类和大型蚤类。这些模式和非模式的生物生长周期均在两周以上，试验周期长，不易观察其对后代性征的影响，且由于各个实验条件的差异而缺乏可比性，浪费资源。轮虫是广泛分布于各类水体中的ー类浮游动物，分布广泛、繁殖迅速、世代时间短，其存活、繁殖和行为等对环境理化因子的变化敏感，以轮虫为受试生物进行的毒理实验过程的标准化等使其成为水生态毒理学研究的模式生物之一，并被广泛用于水环境的监测。1999年，美国环保局正式把萼花臂尾轮虫和褶皱臂尾轮虫分别作为淡水和海水污染的指示动物列入国家测试标准(ASTM，1999)，利用轮虫研究PFOA的长期慢性毒性影响，有实验周期短、可重复性强、易操作、低成本等优点本发明提供了一种可以通过轮虫的生命表变化来判断PFOA毒性的方法，材料易得、实验周期短、便于观察PFOA对后代以及整个种群的影响、测试用量少、成本低。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种利用萼花臂尾轮虫检测水中全氟辛酸(PFOA)毒性的方法，即通过检测轮虫在PFOA存在的情况下其无性生殖策略、有性生殖策略及个体大小的变化来检测PFOA毒性的目的。此方法用很少的测试液、在较短的时间内、以简单的实验过程体现了轮虫的各发育阶段和轮虫生活史的全过程。除此之外，还能估计到子一代轮虫的生殖能力。本发明所采用的技术方案如下所述ー种利用利用萼花臂尾轮虫检测水中全氟辛酸(PFOA)毒性的方法，包括步骤如下
I.轮虫的来源和培养轮虫由轮虫培养液“克隆”培养，饵料以绿藻培养液培养的、处于指数增长期的淡水緑藻，培养时间为六个月以上，实验前用轮虫培养液对轮虫进行两周以上的预培养，培养在20± Iで、持续光照条件下进行；2.急性毒性试验，将全氟辛烷磺酸(PFOA)设为5个浓度梯度，分别为100. 0、50. 0、25. 0、12. 5和6. 25mg/L,每个梯度设置4个重复，另设I个空白对照，在每个塑料杯中放入龄长小于2h的轮虫幼体10个，并向每个塑料杯中加入15. Oml特定浓度的PFOA溶液，试验在20±1°C、无光照的恒温培养箱中进行，采用机率単位法分别求得其LC50值；3.不同浓度PFOA对轮虫种群增长率的影响·利用两天种群增长率实验评价不同浓度PFOA对轮虫种群增长率的影响，48h后，计算每个处理下轮虫个体总数，种群增长率计算公式r = (InNt-InN0) /1Nt和NO分别为实验结束和实验开始时的种群密度，t = 2d。本发明的方法中，所述的轮虫培养液为MBL培养液。本发明的方法中，步骤3中所述的PFOA浓度为O. 25,0. 5、I. O和2. Omg/L。本发明的方法中，所述轮虫优选为萼花臂尾轮虫。
图I.不同浓度的PFOA对萼花臂尾轮虫种群密度的影响；
具体实施例方式下面将结合实施例參照附图进行详细说明，以对本发明方法的目的、特征和优点有更深入的了解。以下的实施例具体解释本发明，本发明的范围不受实施例的限制。实施例I本实施例涉及到利用轮虫检测水中PFOA毒性的方法，包括如下步骤。I.轮虫的来源和培养受试轮虫采于北京市后海，经理化指标和分子生物学指标确定为萼花臂尾轮虫，在20± Iで、持续光照条件下(30001x)培养六个月，轮虫培养液采用改良的轮虫培养液配方(USEPA，1985)，所用饵料是由緑藻培养基培养的、处于指数增长期的淡水緑藻(C. pyrenoidosa),离心浓缩后使用，姆天投喂密度为I. OX IO6Cells · mL_1的绿藻并更换培养液。2.急性毒性试验研究用全氟辛酸(PFOA)购自Sigma-Aldrich，急性毒性实验共设置五个浓度，分别为100. 0、50. 0、25. 0、12. 5和6. 25mg/L mg/L 5个浓度梯度，每个梯度设置4个重复，选EPA培养基为空白対照。测试液的配制采用母液稀释的方法，先用蒸馏水配制I. Og/L的母液，然后用EPA培养基(不含藻)稀释得到不同浓度的PFOA测试液，实验时，在每个塑料杯中放入龄长小于2h的轮虫幼体10个，并向每个玻璃杯中加入15. Oml特定浓度的PFOA溶液；24h后，对每个玻璃杯里存活的轮虫进行计数，根据轮虫的死亡情况用机率単位法计算半致死浓度LC50值。3.不同浓度PFOA对轮虫种群增长率的影响由急性致死实验筛选合适的处理剂量，结果得知PF0A半致死浓度LC50 =80. Omg/L，最小致死剂量为MLD = 25. Omg/L，选择PFOA亚致死剂量以下考察不同PFOA浓度对轮虫生殖策略的影响。通过两天种群增长率实验评价不同浓度PFOA对轮虫种群增长率的影响，该实验在50mL塑料烧杯中进行。在每个烧杯中放入龄长小于2h的轮虫幼体10个，并添加配制好的PFOA溶液至15ml，PFOA处理浓度为O. 25mg/L，共设置6个重复。实验在温度为(20±1)°C的恒温培养箱中进行；实验过程中，每12h悬浮沉积于试管底部的藻类食物，每24h更换内含1.0X106cellS/L緑藻的测试液；48h后，对每个试管中轮虫进行计数，种群增长率计算公式r = (InNt-InNO) /1Nt和NO分别为实验结束和实验开始时的种群密度，t = 2d ；实施例2以浓度为O. 5mg/L的PFOA溶液来代替实施例I中的步骤3中O. 25mg/L的PFOA溶液，其他条件同实施例I ;实验表明，与对照相比，O. 25mg/L的PFOA稍降低了轮虫种群密度。实施例3以浓度为I. Omg/L的PFOA溶液来代替实施例I中的步骤3中O. 25mg/L的PFOA溶液，其他条件同实施例I ;实验表明，I. Omg/L的PFOA显著降低了轮虫种群密度，对整个水体生态系统构成威胁。实施例4 以浓度为2. Omg/L的PFOA溶液来代替实施例I中的步骤3中O. 25mg/L的PFOA溶液，其他条件同实施例I ;实验表明，I. Omg/L的PFOA显著降低了轮虫种群密度，对整个水体生态系统构成威胁。
权利要求
1.ー种利用轮虫检测水中全氟辛酸(PFOA)毒性的方法，包括步骤如下 1)轮虫的培养 轮虫由轮虫培养液“克隆”培养，饵料以绿藻培养液培养的、处于指数增长期的淡水绿藻，培养时间为六个月以上，实验前用轮虫培养液对轮虫进行两周以上的预培养，培养在20± Iで、持续光照条件下进行； 2)急性毒性试验 将全氟辛烷磺酸(PFOA)设为5个浓度梯度，分别为100. 0、50. 0、25. 0、12. 5和6. 25mg/し每个梯度设置4个重复，另设I个空白对照，在每个塑料杯中放入龄长小于2h的轮虫幼体10个，并向每个塑料杯中加入15. Oml特定浓度的PFOA溶液，试验在20±1°C、无光照的恒温培养箱中进行，采用机率単位法分别求得其LC50值； 3)不同浓度PFOS对轮虫种群增长率的影响 利用两天种群增长率实验评价不同浓度PFOA对轮虫种群增长率的影响，48h后，计算每个处理下轮虫个体总数，种群增长率计算公式r = (InNt-InNO) /1 Nt和NO分别为实验结束和实验开始时的种群密度，t = 2d。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤3中所述的PFOS浓度为0.25,0. 5、I. 0 和 2. Omg/Lo
全文摘要
本发明涉及一种利用轮虫检测水中全氟辛酸(PFOA)生物毒性的方法，属于环境检测技术领域。具体是选用轮虫作为模式生物，此种生物分布广泛、繁殖迅速、世代时间短，存活、繁殖和行为等对环境理化因子的变化敏感；通过不同浓度的PFOA水溶液对轮虫种群密度的改变评价其对生态系统的影响。本发明克服了目前测定水中PFOA生物毒性中周期长、操作复杂的困难，提供了一个简便、灵敏、系统的检测水中PFOA毒性的方法，该方法方便、快速、成本低廉。
文档编号G01N33/00GK102662035SQ20121017362
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者张利兰, 沈珍瑶, 牛军峰 申请人:北京师范大学