专利名称：一种重组人胰岛素原的生产方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域。更具体地，本发明提供一种新型N-端前导序列的人胰岛素原分子(INS)，及一种利用该分子生产人胰岛素原的方法，以及有关的表达载体与工程细胞的构建、人胰岛素原的表达和纯化工艺。
背景技术：
胰岛素是胰脏分泌的一种能降低血糖的蛋白质类激素。胰岛素在正常生理状态下的分泌时相为餐后追加分泌和基础分泌。
胰岛素由胰岛B细胞分泌。胰岛B细胞先合成一个大分子的前胰岛素原，然后加工成86肽的胰岛素原，再经水解而成为胰岛素。
成熟胰岛素由A、B两条多肽链构成，共含有51个氨基酸，分子量约6000道尔顿，较小的A链由21个氨基酸组成，较大的B链由30个氨基酸组成，两链间由两个二硫键相连接，破坏二硫键即能使胰岛素的生物学作用丧失。人体内胰岛素的血清半衰期约5min。
正常人胰岛素由肝、肾降解，主要降解酶是肝谷胱甘肽胰岛素脱氢酶，该酶通过将胰岛素降解为单一的A链和B链而失活。
胰岛素是治疗I型糖尿病的常用特效药物，有很大的市场需求，以前主要是从猪、牛胰脏中提取，近年来以大肠杆菌(E.coli)生产为主的重组人胰岛素已占领了大部分市场份额。
1921年，Banting和Best成功地从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。70年代末，以猪胰岛素为原料，采用氨基酸置换技术得到人胰岛素。1982年，采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。90年代至今，重组人胰岛素类似物成功研发上市(对人胰岛素的氨基酸序列进行修饰)，包括超短效和长效人胰岛素类似物。重组人胰岛素(Recombinant Human Insulin)——是应用基因重组技术生产的生物工程药物，具有与人内源性胰岛素相同的结构和生物学活性。
胰岛素原及其类似物基因已在很多表达系统如大肠杆菌，枯草杆菌，酵母和哺乳动物细胞中都得到了表达，有的表达量还比较高，但是存在各种问题，比如大肠杆菌，表达量还可以，但是表达产物往往形成包涵体，这虽然有利于产物的高效表达与稳定，但这些产物需经过变复性以恢复其天然结构及活性的加工，增加了后处理的复杂性，并且到最后有活性的产物得率低。
本发明综合现在胰岛素表达生产遇到的问题，结合现代基因重组技术的最新研究，提供了一种新型N-端前导序列的人胰岛素原分子，并提供了一种利用该胰岛素原分子，采用新型毕赤酵母表达体系生产人胰岛素原的方法，即将酵母α因子前导肽序列与本发明提供的新型人胰岛素原分子融合，导入一种酵母组成型表达载体，再转入毕赤酵母，实现重组人胰岛素原的高效分泌表达，可以大大简化纯化工艺，并通过优化发酵工艺，获得快速、简便、稳定、活性高的一种人胰岛素原的生产方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新型N-端前导序列的人胰岛素原分子(INS)。
本发明的另一目的就是提供一种利用该新型人胰岛素原分子高效简便的生产人胰岛素原的方法。
本发明的另一目的就是提供用于该方法的表达载体及工程细胞。
在本发明的第一方面，就是提供了一种新型N-端前导序列的人胰岛素原分子，其特征在于，所述的新型N-端前导序列的人胰岛素原分子核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述新型N-端前导序列的人胰岛素原分子核苷酸序列编码区与SEQID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一优选例中，所述的新型N-端前导序列的人胰岛素原分子核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求2所述的融合蛋白序列。
在另一优选例中，所述的表达载体是pGAPZA/α-INS。
在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，它整合有权利要求4所述的表达载体。
在另一优选例中，所述的工程细胞是毕赤酵母。
在本发明的第四方面，提供了一种生产重组人胰岛素原的方法，该方法包括步骤a)在适合的表达条件下，培养如权利要求6所述的宿主细胞，从而分泌表达出重组人胰岛素原；b)分离纯化分泌的重组人胰岛素原。
图1是融合基因α-INS的构建示意图。
图2是重组质粒pGAPZA/α-INS构建示意图。
具体实施例方式
本发明人通过深入而广泛的研究，提供了一种新型N-端前导序列的人胰岛素原分子，通过在胞外构建了含有酿酒酵母α-因子前导肽序列的新型N-端前导序列的人胰岛素原分子融合蛋白基因，构建入含有GAP启动子的酵母表达载体，再转入毕赤酵母，使其在毕赤酵母细胞内中组成型高效分泌表达。在此基础上完成了本发明。
根据人胰岛素的天然成熟肽序列，考虑到后处理工艺，提出了一种新型N-端前导序列的人胰岛素原分子，其B链和A链之间以不会影响胰岛素天然结构的Ala-Ala-Asp连接，并在其N端引入一个6XHisTag标签和一个蛋白酶酶切位点，即形成F-B-Ala-Ala-Asp-A分子，其中F为HHHHHHDDDDK，其全序列见SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，其核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，与SEQID NO1所示的核苷酸序列有95％以上的同源性。
全基因合成新型N-端前导序列的人胰岛素原分子的基因序列，将该基因克隆到pUC19中测序验证后，用分子生物学方法，然后体外构建融合蛋白α-INS的融合序列，然后克隆入表达载体pGAPZA。转化、整合入P.pastoris宿主细胞染色体，通过施加不同浓度抗性，筛选抗性最强克隆，进而筛选出高表达工程细胞。摇瓶试验表明，生长48小时后，表达水平20mg/L以上。
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。在本发明中，工程菌表达的重组人胰岛素原发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。例如，合适的培养基包括(但不限于)以下组成(i)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，总浓度0.1-3％；无机氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等铵盐，浓度0-1.5％。
(ii)无机盐包括磷酸盐、枸盐酸盐、Mg2+盐等。较佳地，磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-8；Mg2+盐0-5mM。
(iii)在培养基中添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM。
(iv)根据M9培养基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(v)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是单一碳源，也可以是混合碳源。较佳地，碳源选自下组甘油浓度为0.1-3％；乳糖浓度为0.1-3％；葡萄糖浓度为0.1-1.5％。
为大规模获得重组人胰岛素原，需要在发酵罐中进行优化培养。本发明研究了中试发酵工艺，优化后的表达水平达到200mg/L。
在发酵表达重组人胰岛素原后，对表达的rINS进行分离。
通常，发酵样品先以离心、过滤等方式获得发酵液上清，去除菌体。发酵液上清可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。
适用于本发明的层析技术包括金属螯合层析，阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析等。
经过2-3步纯化，可得到rINS纯品，纯化得率40％以上，纯度95％以上，纯品得率约80mg/L发酵上清液。
纯化后rINS的量用放免活性测定用相关试剂盒测定，以猪胰岛素为标准品。
在本发明的一个实例中，提供了α-INS融合蛋白基因的获得及表达质粒的构建。
在本发明的另一个实例中，通过筛选获得了高表达重组人胰岛素原的菌株，提高了重组人胰岛素原的表达量。
在本发明的另一个实例中，通过不同启动子之间的比较，选择合适的表达载体表达重组人胰岛素原。
在本发明的另一个实例中，经过发酵工艺的优化，进一步提高了重组人胰岛素原的表达量。
在本发明的另一个实例中，经过纯化工艺优化，可得到纯品80mg/L。
中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液可获得重组人胰岛素原纯品80mg。适合产业化生产。
本发明的优点在于(1)一种新型N-端前导序列的人胰岛素原分子(INS)，并在该序列前导入了酿酒酵母α-因子前导肽序列，该融合蛋白基因非常适合在毕赤酵母中分泌表达，具有高表达、高稳定的特点。
(2)表达工艺简单，表达载体含有不需要甲醇诱导的启动子，能组成型的高效表达人胰岛素原，在发酵过程中无需更换培养基或添加诱导剂，简化了操作工艺，比甲醇作为诱导剂的表达菌具有更高的安全性，有利于规模化生产。
(3)通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平进一步提高。
(4)纯化工艺简便，回收率高。由于是分泌蛋白，而且带有HisTag标签，大大简化了纯化工序，使纯化回收率大大提高，使大规模低成本生产重组人胰岛素原成为可能。
(5)采用毕赤酵母为工程细胞，很好地保持了重组人胰岛素的活性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1融合基因的获得及表达质粒的构建全基因合成新型N-端前导序列的人胰岛素原分子(INS)的基因序列，将该基因克隆到pUC19中测序验证后，用分子生物学方法，然后体外构建融合蛋白α-INS的融合序列(见图1)，以含有rINS编码序列的质粒pUC19/rINS为模板，通过PCR扩增得到可与酿酒酵母α-因子前导肽序列以正确的框架进行融合的INS基因。同时，以含有酿酒酵母α-因子前导肽编码序列的质粒pPIC9K(购自Invitrogen公司)为模板，PCR扩增得到α-因子前导肽序列。把纯化后的上述两种PCR产物分别用限制酶XhoI进行消化，对两种酶切产物进行连接。以连接产物为模板进行PCR扩增，得到可用于分泌表达的融合基因α-INS。
重组质粒构建线路如图2所示，将人工合成的α-INS基因用EcoRI进行酶切处理后，琼脂糖凝胶电泳回收约0.5kb片段；同时将质粒pGAPZA(购自Invitrogen公司)用EcoRI进行酶切，回收大片段。将两个片段用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌DH5α(购自Promega公司)。小量制备质粒，通过酶切鉴定含α-INS的阳性克隆。pGAPZA接入外源基因后可以将其多拷贝整合到宿主菌的染色体上进行高效表达，同时本身携带有一个Zeocin抗性基因，可以用于转化子的筛选。载体pGAPZA多克隆位点前有组成性表达的GAP启动子，不需诱导剂即可在宿主菌GS115中高效表达外源基因。
实施例2高表达重组人胰岛素原工程菌株的筛选将构建好的重组质粒pGAPZA/α-INS大量制备，线性化，电穿孔转化宿主细胞P.pastoris GS115，涂布含有不同浓度抗生素Zeocin的YPDS平板筛选高抗的阳性克隆，并进行小摇表达实验筛选得到重组人胰岛素原高表达的工程酵母菌株(含α-INS)。
实施例3选择合适的表达载体在构建重组质粒pGAPZA/α-INS时，我们同时构建了重组质粒pPIC9K/rINS，通过与实施例2相似的过程，我们获得了重组人胰岛素原高表达的工程酵母菌株(含rINS)。将这两个工程酵母菌株在表达环境、表达时间等一致的前提下的表达量做了一个比较，发现含α-INS工程酵母菌株中人胰岛素原的表达量明显高于含rINS的工程酵母菌株。根据结果，我们选择GAP作为表达肠激酶的首选启动子。
实施例4添加不同蛋白保护剂对表达水平的影响取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1∶10的比例二级接种于250ml BMGY的1L三角烧瓶中，培养4~8hr左右，上罐发酵，pH5.0、温度20℃、D0＞35％，待溶氧上升后流加50％甘油内含10％CA，或10％Peptone或10％Tryptone的培养液，36hr后取样。样品检测SDS-PAGE和蛋白含量以确定诱导阶段的最佳蛋白保护剂。
实施例5重组人胰岛素原纯化将发酵菌体破碎，离心取上清，将样品置于4℃准备层析分离。
层析介质Ni-chelating Sepharose
层析洗涤缓冲液缓冲液A20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.4缓冲液B20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH7.4洗脱液含500mM Imidazole，5mM巯基乙醇的缓冲液B将样品依次用缓冲液A和缓冲液B洗涤，最后用洗脱液洗脱目的蛋白。
洗脱液用肠激酶处理，然后进行层析。
层析2(分子筛层析)层析介质Sephadex G75缓冲液20mM PB(pH7.0)上样层析1收集的样品组分。
经过以上纯化工艺，最后可得蛋白纯品80mg/L发酵上清液。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海新生源医药研究有限公司<120>一种重组人胰岛素原的生产方法<160>4<210>1<211>195<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)…(195)<223>新型N-端前导序列的人胰岛素原分子(INS)<400>1catcatcatc atcatcatga cgatgacgat aagtttgtga accaacacct gtgcggctca 60cacctggtgg aagctctcta cctagtgtgc ggggaacgag gcttcttcta cacacccaag120accgctgctg atggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct ctaccagctg180gagaactact gcaac 195<210>2<211>65<212>PRT<213>智人<400>2His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Phe Val Asn1 5 10Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu15 20 25Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala30 35 40
Ala Asp Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser45 50 55Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn60 65<210>3<211>255<212>DNA<213>人工序列<22l>misc_feature<222>(1)…(255)<223>酵母的α信号肽序列<400>3atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta240tctctcgaga aaaga 255<210>4<211>85<212>PRT<213>智人<400>4Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala1 5 10Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp15 20 25
Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser30 35 40Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser45 50 55Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile60 65 70Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys75 80Arg8权利要求
1.一种新型N-端前导序列的人胰岛素原分子(INS)的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.一种融合蛋白序列，其特征在于，它含有权利要求1所述的核苷酸序列，并且在该核苷酸序列前插有如SEQ ID NO3所示核苷酸序列(SEQ ID NO3序列编码SEQ ID NO4所示的氨基酸序列)。
3.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的融合蛋白序列。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，它含有GAP启动子。
5.一种工程细胞，其特征在于，它整合有权利要求4所述的表达载体。
6.如权利要求5所述的工程细胞，其特征在于，它是毕赤酵母。
7.一种人胰岛素原的生产方法，其特征在于，该方法包括步骤(a)在适合的表达条件下，培养如权利要求6所述的工程细胞，从而分泌表达出人胰岛素原蛋白；(b)分离纯化出表达的人胰岛素原蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)所示的表达条件为诱导时间为12-120小时，较佳的为24-100小时；诱导pH为3-9，较佳的为5-7。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(b)所示的表达条件为(1).发酵液通过简单离心或超滤获得含有目的蛋白的上清液；(2).通过简单的金属螯合层析、疏水层析等简单步骤，即可获得纯度在95％以上的纯品。
全文摘要
本发明提供了一种新型N－端前导序列的人胰岛素原分子(INS)，以及一种应用该胰岛素原分子高效生产人胰岛素原的生产方法，以及有关的表达载体与工程细胞构建、表达和纯化的工艺。将酵母α因子前导肽序列与本发明提供的新型人胰岛素原分子融合，导入一种酵母组成型表达载体，再转入毕赤酵母中实现组成型分泌表达，同时通过发酵与纯化工艺优化，提高了表达量和纯化得率，具有表达高、稳定性好、活性高、生产工艺简便的优点。本发明可高效、简便、低成本地获得人胰岛素原纯品。
文档编号C12P21/02GK1873006SQ200510026290
公开日2006年12月6日 申请日期2005年5月30日 优先权日2005年5月30日
发明者孙九如, 任军, 黄阳滨, 杜碧金, 祈晖 申请人:上海新生源医药研究有限公司