专利名称：提高人胰岛素前体融合蛋白酶切转换成b30缺苏氨酸人胰岛素产率的方法
技术领域：
本发明涉及胰岛素前体的酶切转换方法，尤其涉及一种提高重组人胰岛素前体融合蛋白酶切转换成B链第30位缺苏氨酸人胰岛素(desB30)产物产率的方法，属于重组胰岛素或胰岛素类似物的制备领域。
背景技术：
糖尿病是一种常见的由遗传和环境因素相互作用而引起的代谢内分泌疾病，严重危害着人类健康。胰岛素是最有效的糖尿病治疗药物之一，胰岛素制品现已占到了整个糖尿病用药30%以上的市场份额。胰岛素是最早发现和研究的蛋白质，作为药用蛋白已有90多年的历史，其性质和 结构已十分清楚。胰岛素是促进合成代谢、调节血糖稳定的主要激素，它对代谢作用的总趋向是促进营养物质以不同形式保存起来，因此人们常将其称为“贮存激素”。胰岛素就像一把钥匙，开启葡萄糖进入细胞的大门，促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原的分解和糖原异生，因此，胰岛素具有明显的降低血糖的作用，是最为有效的糖尿病治疗药物。地特胰岛素是一种中性的、可溶的、长效胰岛素。它是原型胰岛素去除了 B链第30位苏基酸，通过在B29位赖氨酸侧链氨基酰化结合一个14碳的直链脂肪酸而生成。酰化结合的脂肪酸可稳定胰岛素分子的六聚体形式，使得地特胰岛素从皮下注射部位的扩散和解聚吸收速度十分缓慢，可明显延长作用时间。当地特胰岛素进入血液循环后，约98%的组分又与血浆白蛋白可逆性结合，可在循环系统中稳定存在，在控制血糖的同时能较大程度避免血糖波动而减少低血糖的风险。另外，患者长时间使用体重增加的几率也大为降低。胰岛素分子在高于生理浓度(I(T8-I(TltW)VL)时具有强烈的自身聚合能力，所以胰岛素在溶液多以二聚体或六聚体的形式存在。在形成胰岛素二聚体时，B链第28位的脯氨酸与另一胰岛素分子的B20至B23的U形转角正好具有互补的相互作用，使得胰岛素分子与分子之间以反平行式的方式形成稳定的、非共价键结合的β_折叠的二聚体。在溶液中有二价金属离子和苯酚等试剂的情况下，依靠静电、氢键和范德华力的相互作用，二聚体可进一步形成相对稳定的六聚体或多聚体。因为胰岛素前体融合蛋白具有与胰岛素十分相近的二级结构和高级结构，所以溶液中的胰岛素前体融合蛋白绝大部分是以二聚体或六聚体的形式存在。现在上市的基因工程重组人胰岛素主要有2种生产方法，分别为礼来公司的大肠杆菌表达工艺与诺和诺德公司的酿酒酵母表达工艺。前一种方法得到的胰岛素前体需要经过收率较低的复性操作和价格较贵的胰蛋白酶及羧肽酶的双酶切工艺；后一种方法需要将表达的前体进行成本很高的酶切转肽反应，酶切及转肽的效率直接决定生产的成本。另外，两种方法都需要高效液相色谱进行精细纯化，生产成本和复杂程度远高于像干扰素等普通的基因工程产品。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。该表达系统同时兼有原核表达系统和真核表达系统的优点，培养操作容易，生长快速，表达量高，能对外源真核基因进行正确翻译和翻译后的加工与修饰，可对多种外源蛋白进行分泌表达，产物易于提纯。另外，毕赤酵母又具有分泌效率高，产物不会过度糖基化，蛋白抗原性低，表达菌株因重组质粒融合到菌体基因组中不易丢失等优点，因此近十年来受到广大研究者的青睐。利用毕赤酵母进行胰岛素前体的表达一直是近年来生物制药一个热点。毕赤酵母分泌表达外源蛋白时，通常将目的蛋白融合在α-交配因子信号肽的后面。为提高目的蛋白的表达量并增加信号肽酶的酶切活性，在胰岛素前体的N-末端融合了一段ΕΕΑΕΑΕΑΕΡΚ的间隔肽序列。如图I所示，间隔肽后是人的单链胰岛素前体，包括人胰岛素的B链(Β1-Β29)前29个氨基酸，及人胰岛素A链(Α1-Α21) 21个氨基酸，两者间通过小C肽AAK将B链的第29位LysineB29与A链的第一位GlycineA1相连。在α -交配因子信号引导肽的作用下，胰岛素前体能有效分泌、折叠和二硫键的正确配对，表达量达到3. Og/L以上。毕赤酵母表达的胰岛素前体是一个单链的融合蛋白，经胰蛋白酶三次酶切后方可 得到最终的产物一B链缺少第30位苏氨酸的人胰岛素(desB30)，然后经进一步转化生成人胰岛素或地特胰岛素。酶切过程分别发生在图I胰蛋白酶酶切所示的三个位点上。实验发现，酶切过程始终有部分的酶切中间体不能有效的全部转换成目的产物desB30。胰岛素前体融合蛋白直接酶切转肽时因需要多位点酶切，总体酶切效率不高。因此，改善胰岛素前体融合蛋白酶切效率，提高重组人胰岛素前体融合蛋白转换为胰岛素前体(desB30)的产物产率，直接涉及到以desB30为原料的重组人胰岛素或地特胰岛素的生产效率及成本的高低，是亟待需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高人胰岛素前体融合蛋白酶切转换成B链第30位缺少苏氨酸人胰岛素产物产率的方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种提高人胰岛素前体融合蛋白酶切转换成B链第30位缺少苏氨酸的人胰岛素前体desB30产物产率的方法，包括以下步骤(I)将基因工程制备的人胰岛素前体融合蛋白表达产物依次采用离子交换和反相层析的方法进行纯化；(2)收集反相层析的洗脱液，向洗脱液中直接加入Tris或NH4HCO3得到混合溶液；向混合溶液中加入胰蛋白酶在室温条件下进行酶切。其中，所述的“人胰岛素前体融合蛋白表达产物”可以是采用酵母表达的人胰岛素前体融合蛋白表达产物，更优选为采用毕赤酵母菌株分泌表达的人胰岛素前体。采用毕赤酵母菌株分泌表达胰岛素前体为本领域的常规技术，已为多种文献所报道(Xie T,LiuQj Xie F，Liu H，Zhang Y. Secretory expression of insulin precursor in Pichiapastoris and simple procedure for producing recombinant human insulin.PrepBiochem Biotechnolj 2008, 38 (3) : 308-317 ;李军等，表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建.北京化工大学学报.2004，第31卷第2期.21-23 ;郝贺龙等，人胰岛素B27K-DTr I前体在毕赤酵母中表达条件的优化.食品与药品.2011年第13卷第09期.305-308)。其中，所述的离子交换方法优选为CM-Sepharose FF离子交换层析；所述的反相层析优选为层析柱的填料为018-10μιη -100 Α，反相层析柱规格250mmX21. 2mm ;所述反相层析的方法优选为A相为O. 1%TFA ddH20, B相为100%CH3CN ；流速20ml/min，20%B相平衡反相柱至基线稳定，将离子交换层析的收集液经微孔滤膜过滤后上样，20%B相再平衡，洗脱梯度为30min内B相由20%上升至40%，梯度约为30%B相时，收集胰岛素前体融合蛋白洗脱峰。为了达到更好的技术效果，步骤(2)中向洗脱液中加入Tris或NH4HCO3至其在混合溶液中的终浓度为30-100mmol/L，优选为50mmol/L ;调混合溶液的pH值为7. 5-8. 5，优选为8. O。步骤(2)中为了达到更好的酶切效果，按w/w计，按照胰蛋白酶与胰岛素前体融合 蛋白I :200的比例加入胰蛋白酶；所述的室温优选为20_30°C，更优选为25°C ；步骤(2)中所述的酶切时间优选为2-4小时，更优选为3小时。本发明首先对不同酶切时间的产物进行质谱鉴定确定了胰岛素前体融合蛋白三个酶切位点的酶切顺序，在确定胰岛素前体融合蛋白三个酶切位点的酶切顺序的同时，发现胰岛素前体融合蛋白在酶切生成desB30时不能完全转化，总有约20%左右的双链胰岛素前体不能有效切除连接肽生成目的产物。为了提高胰岛素前体融合蛋白的酶切效率，本发明分别在4°C、25°C和37°C对酶切温度进行了优化，在胰蛋白酶与胰岛素前体融合蛋白(w/w)的比例分别为I :25、1 :50,1 :100,1 :200和I :400的条件下进行了酶量优化，但酶切转化率仍接近于80%，未发现酶切转换率有明显的提高。毕赤酵母表达胰岛素前体时，在分泌途径中通过形成二聚体或多聚体的方式降低分子浓度来增加表达量。在聚体中Site 2酶切位点处于聚体的内部，因空间位阻的影响造成了胰蛋白酶不能完全去除连接肽。胰岛素二聚体的生成是两分子的B链末端形成了具有互补相互作用的反向β折叠，主要依靠静电、疏水相互作用、氢键和范德华力来维持相对稳定的构象。在改变溶液的pH、疏水性等条件后，胰岛素前体融合蛋白在溶液中将难以形成二聚体，酶切转化率应有明显的提高。若将胰岛素前体融合蛋白溶液PH值调到低于2或超过9，胰岛素前体融合蛋白分子会因自身电荷的相互排斥作用，很难形成聚体，但这样的环境却不是胰蛋白酶酶切的最佳条件，也不利于胰岛素前体融合蛋白的稳定。本发明发现，通过在酶切的溶液中添加适当浓度的有机溶剂来降低溶液的极性，增加溶液的疏水性，能有效抑制胰岛素前体融合蛋白生成二聚体或多聚体。为了提高人胰岛素前体融合蛋白转换B链第30位缺少苏氨酸的人胰岛素产物产率，本发明结合对胰岛素前体融合蛋白的纯化工艺，利用反相层析对胰岛素前体融合蛋白的离子交换层析(CM)收集液进行再次纯化。本发明发现，反相纯化不仅达到了去除部分色素提高胰岛素前体融合蛋白纯度的目的，还将胰岛素前体融合蛋白置换到适宜的有机溶剂的环境中，显著降低了胰岛素前体融合蛋白在溶液中聚体的产生，使得胰岛素前体融合蛋白酶切生成desB30的酶切效率能够出乎意料的提高15%以上(酶切的效率由81. 2%提高到96. 8%)，这对于以desB30为原料转肽生成原型胰岛素或者地特胰岛素，能较大幅度的降低生产成本。
图I胰岛素前体融合蛋白一级结构示意图及存在的三个胰蛋白酶酶切位点。图2胰岛素前体融合蛋白酶切过程中各产物的变化规律图。图3胰岛素前体融合蛋白在水相中和低浓度有机相中酶切完成后的HPLC对比图。图4胰岛素前体融合蛋白和双链胰岛素前体在两种不同溶液中的圆二色谱对比图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围之内。试验材料及仪器表达重组人胰岛素前体融合蛋白(EEAEAEAEPK-B1-29-AAK-A1-21)的毕赤酵母基因工程菌及人胰岛素前体融合蛋白的发酵上清按照文献进行构建、筛选和发酵表达(XieTj Liu Qj Xie F，Liu H，Zhang Y. Secretory expression of insulin precursor in Pichiapastoris and simple procedure for producing recombinant human insulin. PrepBiochem Biotechnolj2008,38(3):308-317)。胰蛋白酶(Trypsin)购自Sigma ;三轻甲基氨基甲焼(Tris)、二硫苏糖醇(DTT)购自 Amresco ;乙臆(CH3CN, HPLC 级)、三氟乙酸(TFA)购自 J&K Chemical ；CM-SepharoseFF. Sephadex G-25购自GE ;其它为国产分析纯试剂。分析型色谱柱(250mmX4. 6mm)为C I8-5pm-100A和半制备型色谱柱(250mmX21. 2mm)填料为(18-10μ η-100Α,购自Kromasil。分析型高效液相仪为安捷伦1100，制备型高效液相仪为大连伊利特Ρ270。试验例I重组人胰岛素前体融合蛋白的水相酶切试验I、试验方法人胰岛素前体融合蛋白的发酵上清采用CM-S印harose FF离子交换层析纯化得到胰岛素前体融合蛋白溶液，再将其用Sephadex G25凝胶过滤的方法进行纯化。经过Sephadex G 25纯化后的样品，用50mmol/L、pH 8. O的Tris缓冲液配制成2. Omg/ml的溶液。按胰蛋白酶胰岛素前体融合蛋白为I :200(w/w)的比例，加入胰蛋白酶，混匀。分别在酶切 O. Oh (加酶混匀后立即取样)、0. 25h、0. 5h、l. Oh,2. Oh,3. Oh,4. Oh,8. Oh 及 24. Oh 取样。不同酶切时间样品取样后立刻加入2倍体积的I. OmoI/L乙酸终止酶反应，并标记酶切时间。样品进行高效液相色谱(HPLC)检测。酶切转化率为HPLC图谱中各酶切产物峰面积/ (未酶切胰岛素前体融合蛋白峰面积+各酶切产物峰面积之和)。胰岛素前体融合蛋白的浓度测定采用HPLC方法，用纯度超过98%的胰岛素前体融合蛋白制作标准曲线。2、试验结果根据酶切样品HPLC图谱可以计算各产物的酶切转化率。从图2可以看出，胰岛素前体融合蛋白的三个酶切位点的酶切速率有明显的区别。酶切的第一步(图I中Site I位置)速率很快，不到30min大部分融合蛋白被酶切，得到单链胰岛素前体；酶切的第二步(图I中Site 3位置)速度相对于第一步要慢，大部分的单链胰岛素切成双链酶切时间超过2. Oh。酶切第三步(图I中Site 2位置)相对要更慢一些，至酶切反应进行到4. Oh时，仍有近20%的双链胰岛素前体未能切除连接肽生成最终产物desB30。即使酶切时间的进一步延长至24h，desB30的效率也未见明显增加，目的产物desB30的酶切转换率约为80%。在确定胰岛素前体融合蛋白三个酶切位点的酶切顺序的同时，发现胰岛素前体融合蛋白在水相酶切生成desB30时不能完全转化，总有约20%左右的双链胰岛素前体不能有效切除连接肽生成目的产物(图2)。
试验例2胰岛素前体融合蛋白的反相纯化和酶切试验I、试验方法将人胰岛素前体融合蛋白的发酵上清经CM-Sepharose FF离子交换纯化(同试验例I)得到的胰岛素前体融合蛋白溶液，再将其经反相柱250mmX21. 2mm(C 8-1 Ομιτι-100 A )进行反相层析；反相层析的条件如下A相为O. 1%TFA ddH20, B相为100%CH3CN。流速20ml/min，20%B相平衡反相柱至基线稳定；将经CM-S印harose FF离子交换纯化得到的胰岛素前体融合蛋白溶液经O. 45 μ m的微孔滤膜过滤后上样，20%B相再平衡，洗脱梯度为0_30min内B相由20%上升至40% ;梯度约30%B相时，收集反相收集液。经反相层析后的目的蛋白溶液澄清透明，纯度提高到98%以上。反相收集液中加入Tris或NH4HCO3至其终浓度为30-100mmol/L (优选为50mmol/L)，调pH为7. 5-8. 5 (优选的，调pH为8.0)，按胰蛋白酶与胰岛素前体融合蛋白l:200(w/w)的比例，加入胰蛋白酶，25°C酶切。不同酶切时间取样，HPLC检测酶切转化率。2、试验结果通过对不同酶切时间的产物分析，发现酶切顺序与在50mmol/LTris水相溶液中进行的酶切相一致，但酶切至3. Oh时，胰岛素前体融合蛋白的酶切转化率即达到96. 8%，比在试验例I中的水相溶液中的酶切高出15%以上(图3)。酶切后的样品ESI-MS检测分子量为5707. 8，与desB30的理论分子量相一致，说明在含有低浓度乙腈的溶液中进行酶切，并未发生一些未知的酶切反应。图4为胰岛素前体融合蛋白和双链胰岛素前体各自分别用50mmol/L Tris (pH8. O)和50mmol/L Tris (pH 8. O)+30%CH3CN配制成O. lmg/ml的溶液进行圆二色谱检测的对比图。从图4中可以看出，同一种胰岛素前体融合蛋白在由水溶液到含有部分有机溶液的环境中，圆二色谱发生了较大变化。特别是双链胰岛素前体CD谱更为明显，在含有低浓度的乙腈的溶液中，经计算双链胰岛素前体反向折叠所占的比例从8. 7%下降到2.6%。胰岛素及其类似物只有在生成聚体后才会形成反相β_折叠，所以反向β_折叠含量的下降表明在低有机相的溶液中聚体的含量有了明显的降低，从而减轻了在Site 3位置酶切时空间位阻造成的影响，因此提高了胰岛素前体融合蛋白酶切转换成desB30的转换效率。
权利要求
1.一种提高人胰岛素前体融合蛋白酶切转换成B链第30位缺苏氨酸人胰岛素产物产率的方法，包括以下步骤 (1)将人胰岛素前体融合蛋白表达产物依次采用离子交换和反相层析的方法进行纯化； (2)收集反相层析的洗脱液，直接向洗脱液中加入Tris或NH4HCO3得到混合溶液；向混合溶液中加入胰蛋白酶在室温条件下进行酶切。
2.按照权利要求I所述的方法，其特征在于所述的离子交换方法为CM-SepharoseFF离子交换层析。
3.按照权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的反相层析为层析柱的填料为Cl 8-1 O μπ _1 00 Α,反相层析柱的规格为 250mmX21. 2mm。
4.按照权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的收集反相层析的方法为A相为O.1%TFA ddH20, B相为100%CH3CN ；20%B相平衡反相柱至基线稳定；将离子交换层析的收集液经微孔滤膜过滤后上样，20%B相再平衡，洗脱梯度为30min内B相由20%上升至40%，梯度为30%B相时，收集反相层析的洗脱液。
5.按照权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)中向反相收集液中加入Tris或NH4HCO3至其在混合溶液中的终浓度为30-100mmol/L ;调混合溶液的pH值为7. 5-8. 5后向混合溶液中加入胰蛋白酶在室温条件下进行酶切。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)中向反相收集液中加入Tris或NH4HCO3至其在混合溶液中的终浓度为50mmol/L ;调混合溶液的pH值为8. O后向混合溶液中加入胰蛋白酶在室温条件下进行酶切。
7.按照权利要求I所述的方法，其特征在于按w/w计，步骤(2)中胰蛋白酶与胰岛素前体融合蛋白的比例为I :200。
8.按照权利要求I所述的方法，其特征在于所述的室温为20-30°C;优选为25°C。
9.按照权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的酶切时间为2-4小时。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的酶切时间为3小时。
全文摘要
本发明公开了一种提高人胰岛素前体融合蛋白酶切转换成B30缺苏氨酸人胰岛素(desB30)产率的方法，包括(1)将人胰岛素前体融合蛋白表达产物依次采用离子交换和反相层析的方法进行纯化；(2)收集反相层析的洗脱液，加入Tris或NH4HCO3，再加入胰蛋白酶进行酶切转换。本发明利用反相层析对胰岛素前体融合蛋白的离子交换收集液进行再次纯化，达到了去除色素提高胰岛素前体融合蛋白纯度的目的，又将胰岛素前体融合蛋白置换到适宜的有机溶剂的环境中，显著降低了其在水相中产生聚体的现象，酶切转换效率相应的提高了15%以上，这对于以desB30为原料转肽生成原型胰岛素或者地特胰岛素，可以较大幅度的降低生产成本。
文档编号C12P21/06GK102816819SQ20121028742
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月13日 优先权日2012年8月13日
发明者周祥山, 张元兴, 尤金花, 秦玉峰, 刘海峰, 解福生, 庞甲佩, 郝向慧, 史兆松 申请人:山东阿华生物药业有限公司, 华东理工大学, 山东东阿阿胶股份有限公司