壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法

专利名称：：壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法
技术领域：
：本发明属于酶固定化
技术领域：
，特别涉及壳聚糖衍生物固定化酶的方法。
背景技术：
：研究表明胰凝乳蛋白酶在医药上具有消化脓汁和坏死组织，消净创面，局部消炎，促进血肿吸收，创面愈合等功效；在食品、轻工等行业具有分解蛋白质、皮革脱毛等功能。目前，使用的游离酶，主要有成本高，利用率低，排放的废酶还污染环境等缺点。因此，研制使用半衰期较长的新型固定化胰凝乳蛋白酶，具有重要的经济、社会价值。壳聚糖是自然界含量丰富、价廉易得的天然高分子材料，因其具有良好的成膜、保湿、吸附、抗菌等特性，广泛用于医药、食品、轻工等行业中。又因壳聚糖具有易生物降解，安全无毒，生物相容性好，容易进行化学修饰，特别是壳聚糖衍生物具有亲水性好、刚性大、机械性良好等特点，是优异的固定化酶的载体。现有固定化酶的方法包括包埋法、吸附法、共价结合法及交联法等。包埋法是指将酶包埋在高分子凝胶细微网格或半透膜中，其制备工艺简便且反应条件较为温和，可获得较高的酶活力回收，由于只有小分子可通过高分子凝胶网格，且扩散阻力会导致酶活力降低，因此包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶。吸附法则是指酶被吸附于不溶性载体的固定化方法，该法操作简便，条件温和，酶的活力损失很少，载体价廉易得，可反复使用，但是，酶与载体的相互作用力弱，易脱落。共价结合法是指酶与载体以共价键结合的固定化方法，该法固定化的酶，不易脱落，可连续使用相当长的时间，但载体的活化比较复杂，且结合法有较激烈的反应而使酶活力损失较大。交联法指用双功能或多功能试剂使酶与载体之间交联的固定化方法，交联法固定化酶稳定性好，如宁波大学学报1999年3月第1期的"壳聚糖固定化胰蛋白酶的制备及理化性质研究"一文，公开了从甲克质粗品中获得的壳聚糖，再在交联剂戊二醛的作用下将胰蛋白酶固定到该壳聚糖上的方法；该法的不足之处在于从甲克质粗品中难以获得纯净的壳聚糖，而且直接以壳聚糖作为载体，胰蛋白酶大分子靠近时位阻大，直接交联固定化酶效率低，容易引起胰蛋白酶分子自交联。又如公开号CN1904043A的"一种纳米磁性壳聚糖固定化酶的制备方法"专利，公开了使用表面含有酰氯基团的纳米磁性壳聚糖与酶蛋白分子在磁场作用下反应制备固定化酶的方法；该法的不足之处在于制备一定粒径的纳米磁性壳聚糖载体比较困难，同时纳米磁性壳聚糖在使用过程中容易被氧化而发生沉聚，导致酶活力的降低。
发明内容本发明的目的是针对现有壳聚糖树脂固定化酶方法的不足之处，提供一种壳聚糖一精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法。该方法具有操作简单、酶活回收率高、反应条件温和、制备成本低等特点，同时固定化胰凝乳蛋白酶较游离胰凝乳蛋白酶酶热稳定性增加，适用pH值降低，半衰期延长，而且可反复利用，减少污染，充分利用资源。本发明的机理由于壳聚糖分子链中含有大量的游离氨基，这些氨基有一孤对电子，具有很强的亲核性，而戊二醛是一种常用的双官能团试剂，可与壳聚糖的氨基发生交联反应生成席夫碱结构，交联主要是在分子间发生；二环己基碳二亚胺(DCC)是一种常用的接肽縮合剂，它可以活化羧基，即加强羧基碳原子的亲电性，使得亲核的非离子化氨基很容易对它进行攻击，从而发生縮合反应生成肽键。再次以戊二醛作为交联剂，使胰凝乳蛋白酶表面游离氨基与精氨酸残余氨基发生shiff反应，即得壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶。本发明的目的是这样实现的一种壳聚糖一精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法，以市售壳聚糖为原料，先制备交联壳聚糖微球，再制备壳聚糖-精氨酸阴离子树脂，最后进行希夫反应固定化胰凝乳蛋白酶而得成品。具体的方法步骤如下(1)制备交联壳聚糖树脂以市售壳聚糖为原料，先将壳聚糖加入盐酸质量百分数为1~5%稀盐酸中，搅拌溶解后，就制备出壳聚糖质量百分数为1~4%的壳聚糖酸性溶胶。后按壳聚糖酸性溶胶液体石蜡的体积比为1:1~4的比例，将壳聚糖酸性溶胶缓慢加入液体石蜡中，搅拌2030min，并加热升温至35~45°C制得到壳聚糖石蜡溶液后，再加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.05~0.25%的吐温80，进行乳化2030min，然后加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.050.3%戊二醛交联剂，使壳聚糖分子的部分氨基参与交联反应，从而使线性壳聚糖分子转变成壳聚糖微球。再加入占壳聚糖石蜡溶液质量分数为0.01~0.1%碳酸钙致孔剂，进行制孔反应50~70min制得壳聚糖微球的悬浮液。最后用氢氧化钠溶液调节壳聚糖微球悬浮液的pH值为910，并加热至5575。C，搅拌固化2~4h，再过滤，弃滤液，收集滤渣。对滤渣先用乙醇洗涤36次，后用质量分数为1~5%稀盐酸溶解滤渣中的碳酸钙，再用蒸馏水洗涤至中性，就制备出交联壳聚糖树脂。(2)壳聚糖一精氨酸阴离子树脂的制备第(1)步完成后，将第(1)步制备出的交联壳聚糖树脂，加入精氨酸质量分数为0.52.0%精氨酸溶液中，振荡2030min，使壳聚糖树脂悬浮于精氨酸溶液中，制备出壳聚糖质量分数为0.5~2.5%的壳聚糖_精氨酸溶液。然后按壳聚糖一精氨酸溶液中的精氨酸二环己基碳二亚胺(DCC)的摩尔比为1:0.52.5的比例，在壳聚糖一精氨酸溶液中，加入DCC接肽縮合剂，进行縮合反应2040min,使壳聚糖树脂中另一部分氨基与精氨酸的羧基发生縮合反应，就制备出壳聚糖-精氨酸树脂。最后经过滤，弃滤液，收集滤渣。对滤渣先用乙醇洗涤36次，后用蒸馏水透析812h后，再过滤，再弃滤液，再收集滤渣，就制备出壳聚糖一精氨酸阴离树脂。(3)胰凝乳蛋白酶的固定第(2)步完成后，先将胰凝乳蛋白酶加入pH值为4.5-6.0磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，就制备出胰凝乳蛋白酶的摩尔浓度为0.050.08mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液。后按第(2)步制备出的壳聚糖一精氨酸阴离子树脂胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中胰凝乳蛋白酶的质量比为1:1525的比例，将壳聚糖一精氨酸阴离子树脂加入胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中，在3060。C的恒温水浴条件下，振荡2040min，使壳聚糖一精氨酸阴离子树脂悬浮于胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中。再按戊二醛壳聚糖一精氨酸阴离子树脂的质量比为1:614的比例，将戊二醛加入到悬浮壳聚糖一精氨酸阴离子树脂的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中，并置于振荡器中振荡，进行希夫反应5070min后，进行抽滤，弃滤液，收集树脂滤渣，对树脂滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤47次，除去游离胰凝乳蛋白酶，再抽滤，再弃滤液，再收集壳聚糖一精氨酸阴离子固定化胰凝乳蛋白酶滤渣而得成品。本发明采用上述技术方案后，主要有以下特点(1)固定化效果好。由于精氨酸分子中胍基和羧基之间具有一个长脂肪链结构一(CH2)4，当壳聚糖树脂与精氨酸反应后，相当于给壳聚糖树脂接上许多"悬臂"，以其作为固定化酶的载体，避免了酶蛋白大分子靠近载体时位阻大，直接交联固定化酶效率低，且易引起酶分子自交联等缺点，所以固定化酶效果更好；以该固定化酶进行酶促反应，更利于固定化酶与反应介质接触，提高反应效率。(2)固定化酶的稳定性高。本发明方法是采用戊二醛交联法固定胰凝乳蛋白酶，增加酶与载体之间的结合力，提高固定化酶的机械强度，避免使用过程中酶分子从载体上脱落的缺陷，使得酶的稳定性得到了进一步的增强。(3)适用pH值降低。游离胰凝乳蛋白酶的最适pH值为8.0，而固定化胰凝乳蛋白酶的最适pH值仅为5.92，进一步扩大了胰凝乳蛋白酶的使用范围。(4)生产成本低。本发明方法采用壳聚糖一精氨酸阴离子树脂固定化的胰凝乳蛋白酶更容易与有机溶剂分离，更有利于酶的回收利用，提高酶的使用效率，降低生产成本。(5)酶活回收率高、半衰期长。固定化的胰凝乳蛋白酶热稳定性增加，酶活回收率高达89.95%，半衰期延长，即75。C半衰期长达18小时，4。C半衰期长达56天。(6)本发明方法简单，操作简便，生产过程中反应条件温和，便于推广应用。采用本发明方法制备出的壳聚糖一精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶，可广法应用于医药、食品、轻工等行业的各种水相及非水相的酶促反应。具体实施例方式下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。实施例一一种壳聚糖一精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法的具体步骤如下(1)制备交联壳聚糖树脂以市售壳聚糖为原料，先将壳聚糖加入盐酸质量百分数为2%稀盐酸中，搅拌溶解后，就制备出壳聚糖质量百分数为2%的壳聚糖酸性溶胶。后按壳聚糖酸性溶胶液体石蜡的体积比为1:1的比例，将壳聚糖酸性溶胶缓慢加入液体石蜡中，搅拌25min，并加热升温至40°C制得到壳聚糖石蜡溶液后，再加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.1%的吐温80，进行乳化25min，然后加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.15%戊二醛交联剂，使壳聚糖分子的部分氨基参与交联反应，从而使线性壳聚糖分子转变成壳聚糖微球。再加入占壳聚糖石蜡溶液质量分数为0.05%碳酸钙致孔剂，进行制孔反应60min制得壳聚糖微球的悬浮液。最后用氢氧化钠溶液调节壳聚糖微球悬浮液的pH值为9.5，并加热至60。C，搅拌固化3h，再过滤，弃滤液，收集滤渣。对滤渣先用乙醇洗涤5次，后用质量分数为3%稀盐酸溶解滤渣中的碳酸钙，再用蒸馏水洗涤至中性，就制备出交联壳聚糖树脂。(2)壳聚糖一精氨酸阴离子树脂的制备第(1)步完成后，将第(1)步制备出的交联壳聚糖树脂，加入精氨酸质量分数为l%精氨酸溶液中，振荡25min，使壳聚糖树脂悬浮于精氨酸溶液中，制备出壳聚糖质量分数为1.5%的壳聚糖一精氨酸溶液。然后按壳聚糖一精氨酸溶液中的精氨酸二环己基碳二亚胺(DCC)的摩尔比为1:1的比例，在壳聚糖一精氨酸溶液中，加入DCC接肽縮合剂，进行縮合反应30min，使壳聚糖树脂中另一部分氨基与精氨酸的羧基发生縮合反应，就制备出壳聚糖-精氨酸树脂。最后经过滤，弃滤液，收集滤渣。对滤渣先用乙醇洗涤4次，后用蒸馏水透析10h后，再过滤，再弃滤液，再收集滤渣，就制备出壳聚糖一精氨酸阴离树脂。(3)胰凝乳蛋白酶的固定第(2)步完成后，先将胰凝乳蛋白酶加入pH值为5.9磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，就制备出胰凝乳蛋白酶的摩尔浓度为0.06mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液。后按第(2)步制备出的壳聚糖一精氨酸阴离子树脂胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中胰凝乳蛋白酶的质量比为1:20的比例，将壳聚糖一精氨酸阴离子树脂加入胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中，在45。C的恒温水浴条件下，振荡30min，使壳聚糖一精氨酸阴离子树脂悬浮于胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中。再按戊二醛壳聚糖一精氨酸阴离子树脂的质量比为i:8的比例，将戊二醛加入到悬浮壳聚糖一精氨酸阴离子树脂的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中，并置于振荡器中振荡，进行希夫反应60min后，进行抽滤，弃滤液，收集树脂滤渣，对树脂滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤6次，除去游离胰凝乳蛋白酶，再抽滤，再弃滤液，再收集壳聚糖一精氨酸阴离子固定化胰凝乳蛋白酶滤渣而得成品。实施例二一种壳聚糖一精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法的具体步骤如下(1)制备交联壳聚糖树脂同实施例一，特征是将壳聚糖加入盐酸质量百分数为1%稀盐酸中，制备出壳聚糖质量百分数为1%的壳聚糖酸性溶胶。壳聚糖酸性溶胶液体石蜡的体积比为i:2，搅拌20min，并加热升温至35。C，再加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.05%的吐温80，进行乳化20min，然后加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.05%戊二醛交联剂，再加入占壳聚糖石蜡溶液质量分数为0.01%碳酸钙致孔剂，进行制孔反应50min。用氢氧化钠溶液调节壳聚糖微球悬浮液的pH值为9，并加热至55。C，搅拌固化2h，对滤渣先用乙醇洗涤3次，后用质量分数为1%稀盐酸溶解滤渣中的碳酸钙。(2)壳聚糖一精氨酸阴离子树脂的制备同实施例一，特征是精氨酸溶液中精氨酸质量分数为0.5%，振荡20min，制备出壳聚糖质量分数为0.5%的壳聚糖_精氨酸溶液。壳聚糖_精氨酸溶液中精氨酸二环己基碳二亚胺(DCC)的摩尔比为1:0.5，进行縮合反应20min，对滤渣先用乙醇洗涤3次，后用蒸馏水透析8h。(3)胰凝乳蛋白酶的固定同实施例一，特征是先将胰凝乳蛋白酶加入pH值为4.5磷酸盐缓冲液中，制备出胰凝乳蛋白酶的摩尔浓度为0.05mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液。第(2)步制备出的壳聚糖一精氨酸阴离子树脂胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中胰凝乳蛋白酶的质量比为1:15,在30°C的恒温水浴条件下，振荡20min，戊二醛壳聚糖一精氨酸阴离子树脂的质量比为1:6，进行希夫反应50min，对树脂滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤4次。实施例三一种壳聚糖一精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法的具体步骤如下(1)制备交联壳聚糖树脂同实施例一，特征是将壳聚糖加入盐酸质量百分数为5%稀盐酸中，制备出壳聚糖质量百分数为4%的壳聚糖酸性溶胶。壳聚糖酸性溶胶液体石蜡的体积比为i:4，搅拌30min,并加热升温至45。C，再加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.25%的吐温80,进行乳化30min，然后加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.3%戊二醛交联剂，再加入占壳聚糖石蜡溶液质量分数为0.1%碳酸钙致孔剂，进行制孔反应70min。用氢氧化钠溶液调节壳聚糖微球悬浮液的pH值为10，并加热至75。C，搅拌固化4h，对滤渣先用乙醇洗涤6次，后用质量分数为5%稀盐酸溶解滤渣中的碳酸钙。(2)壳聚糖一精氨酸阴离子树脂的制备同实施例一，特征是精氨酸溶液中精氨酸质量分数为2.0%，振荡30min，制备出壳聚糖质量分数为2.5%的壳聚糖一精氨酸溶液。壳聚糖一精氨酸溶液中精氨酸二环己基碳二亚胺(DCC)的摩尔比为1:2.5,进行缩合反应40min，对滤渣先用乙醇洗涤6次，后用蒸馏水透析12h。(3)胰凝乳蛋白酶的固定同实施例一，特征是先将胰凝乳蛋白酶加入pH值为6.0磷酸盐缓冲液中，制备出胰凝乳蛋白酶的摩尔浓度为0.08mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液。第(2)步制备出的壳聚糖一精氨酸阴离子树脂胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中胰凝乳蛋白酶的质量比为1:25，在60。C的恒温水浴条件下，振荡40min，戊二醛壳聚糖一精氨酸阴离子树脂的质量比为1:14的比例，进行希夫反应70min后，对树脂滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤7次。实验结果将实施例13制备出的产品，进行了壳聚糖一精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶最适催化温度、最适催化pH值、酶活回收率、半衰期试验。试验结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从上表可知，壳聚糖一精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的热稳定性较游离胰凝乳蛋白酶高，固定化胰凝乳蛋白酶最适催化温度为70°C，较游离胰凝乳蛋白酶提高10°C;固定化胰凝乳蛋白酶的最适催化pH值为5.92，较游离胰凝乳蛋白酶降低了2.08，扩大了固定化胰凝乳蛋白酶的使用范围；固定化胰凝乳蛋白酶的活回收率高达到89.95%，75°C的半衰期长达18小时，4。C的半衰期长达56天，提高了固定化胰凝乳蛋白酶的利用效率，降低污染，充分利用资源。权利要求1.一种壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法，其特征在于具体的方法步骤如下(1)制备交联壳聚糖树脂以市售壳聚糖为原料，先将壳聚糖加入盐酸质量百分数为1～5％稀盐酸中，就制备出壳聚糖质量百分数为1～4％的壳聚糖酸性溶胶，后按壳聚糖酸性溶胶∶液体石蜡的体积比为1∶1～4的比例，将壳聚糖酸性溶胶缓慢加入液体石蜡中，搅拌20～30min，并加热升温至35～45℃制得到壳聚糖石蜡溶液后，再加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.05～0.25％的吐温80，进行乳化20～30min，然后加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.05～0.3％戊二醛交联剂，再加入占壳聚糖石蜡溶液质量分数为0.01～0.1％碳酸钙致孔剂，进行制孔反应50～70min制得壳聚糖微球的悬浮液，最后用氢氧化钠溶液调节壳聚糖微球悬浮液的pH值为9～10，并加热至55～75℃，搅拌固化2～4h，再过滤，弃滤液，收集滤渣，对滤渣先用乙醇洗涤3～6次，后用质量分数为1～5％稀盐酸溶解滤渣中的碳酸钙，再用蒸馏水洗涤至中性；(2)壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的制备第(1)步完成后，将第(1)步制备出的交联壳聚糖树脂，加入精氨酸质量分数为0.5～2.0％精氨酸溶液中，振荡20～30min，制备出壳聚糖质量分数为0.5～2.5％的壳聚糖-精氨酸溶液，然后按壳聚糖-精氨酸溶液中精氨酸∶二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶0.5～2.5的比例，在壳聚糖-精氨酸溶液中，加入DCC接肽缩合剂，进行缩合反应20～40min，最后经过滤，弃滤液，收集滤渣，对滤渣先用乙醇洗涤3～6次，后用蒸馏水透析8～12h后，再过滤，再弃滤液，再收集滤渣；(3)胰凝乳蛋白酶的固定第(2)步完成后，先将胰凝乳蛋白酶加入pH值为4.5～6.0磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，就制备出胰凝乳蛋白酶的摩尔浓度为0.05～0.08mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液，后按第(2)步制备出的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂∶胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中胰凝乳蛋白酶的质量比为1∶15～25的比例，将壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中，在30～60℃的恒温水浴条件下，振荡20～40min，再按戊二醛∶壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的质量比为1∶6～14的比例，将戊二醛加入到悬浮壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中，并置于振荡器中振荡，进行希夫反应50～70min后，进行抽滤，弃滤液，收集树脂滤渣，对树脂滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤4～7次，再抽滤，再弃滤液，再收集壳聚糖-精氨酸阴离子固定化胰凝乳蛋白酶滤渣。全文摘要一种壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法，涉及壳聚糖衍生物固定化酶的方法。本发明以市售壳聚糖为原料，先制备交联壳聚糖树脂。再制备壳聚糖-精氨酸阴离子树脂，最后进行希夫反应固定化胰凝乳蛋白酶而得成品。本发明具有方法简单，操作简便，反应条件温和，生产成本低，固定化酶的稳定性高，酶活回收率高达89.95％，半衰期长，即75℃的半衰期长达18小时，4℃的半衰期长达56天，最适pH值仅为5.92。采用本发明制备出的产品，可广泛应用于医药、食品、轻工业等行业的各种水相及非水相的酶促反应。文档编号C12N11/10GK101285060SQ20081006979公开日2008年10月15日申请日期2008年6月3日优先权日2008年6月3日发明者周小华,柳小平,东王,娟王申请人:重庆大学