一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其重组蛋白的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种来源于单环刺螠的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其重组蛋白的应用，属于生物医学领域。该胰凝乳蛋白酶抑制剂的蛋白质具有氨基酸序列SEQ ID No.1，编码的单环刺螠胰凝乳蛋白酶抑制剂UCI01是单链多肽，含67个氨基酸残基，分子量约为7516Da，等电点为4.38，不含二硫键，没有明显的信号肽区域。该基因具有序列表SEQ ID No.2中的碱基序列，cDNA序列全长度为697bp，其中含有80bp的5`非翻译区，413bp的3`非翻译区和polyA尾巴，开放编码框为201bp。利用原核表达技术对该基因进行重组表达，获得的重组蛋白具有胰凝乳蛋白酶抑制剂的活性，其IC50为53nM。该重组蛋白具有较好的pH稳定性和一定的温度稳定性，对金黄色葡萄球菌具有抑菌效果。
【专利说明】-种来源于单环刺螆的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其 重组蛋白的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其重组蛋白 的应用，属于生物医学领域。
【背景技术】
[0002] 生物体中的蛋白酶系是维系生命的关键物质之一，但蛋白酶的不正常表达或释放 也会导致机体产生严重的病变。有机体调节这些酶活的主要途径之一便是积累一定的特异 性蛋白酶抑制剂，胰凝乳蛋白酶抑制剂就是其中一种。
[0003] 胰凝乳蛋白酶抑制剂（Chymotrypsin Inhibitor, Cl)广泛存在于微生物、豆科植 物、禾本科植物、节肢动物和哺乳动物等的体内，主要作用是停止、阻止或降低胰凝乳蛋白 酶活性。胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin)又叫糜蛋白酶，是一种典型的丝氨酸蛋白酶，在生 物体的多种组织和器官中发挥着非常重要的作用，也是一些病原生物或肿瘤细胞的重要病 原因子。
[0004] 根据结构、分子量等的不同，丝氨酸蛋白酶抑制剂分为不同类型，其中马铃薯蛋白 酶抑制剂I (PI-I)家族是其中一亚种。马铃薯蛋白酶抑制剂I家族的来源不局限于马铃薯， 在其他生物体（如：大麦、番茄）、动物（如：水蛭）中也有发现。这类蛋白质一般具有抑制 胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶的活性，结构上，这类蛋白酶的分子量较小（60?90个氨基酸 残基），结构中不含-硫键。
[0005] 单环刺婦（Urechis uniconctus)俗称海肠，是我国北方沿海特有的一种海洋婦虫 类动物，是无管縊目在我国沿海分布的唯一种类。主要分布于我国渤海、黄海、俄罗斯、朝鲜 半岛、日本北海道等地，山东胶州地区是我国海肠的最大产地。其个体粗大，肉嫩味美，体壁 蛋白质含量高达22. 84%，且富含多种人体必需氨基酸，具有极高的食用价值，又称"裸体海 参"。同时，单环刺縊栖息于沿海沙岸潮间带下区及潮下带浅水区"U型"隧道内，能够在其 他动物不能生存的富硫环境中生存，在作为提取海洋药用活性物质、保健品的原料方面也 具有极大潜力。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是基于上述理论和现有技术基础，提供一种利用重组表达技术制备 的、来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂及其基因和其重组蛋白的应用。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008] -种来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂，该胰凝乳蛋白酶抑制剂的蛋白质具 有氣基酸序列SEQ ID No. 1 :
[0009] MATKEQWPELVGKSGEEAKAAIIAERPELEKVEICNELSPMTMDYRTDRVRIFVNNDGNVVNPPQTGo
[0010] 所述的来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂，编码的单环刺縊胰凝乳蛋白酶抑 制剂UCI01是单链多肽，含67个氨基酸残基，分子量约为7516Da，等电点为4. 38,不含二硫 键，没有明显的信号肽区域。
[0011] 一种来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因，该基因具有序列表SEQ IDNo. 2 中的碱基序列。
[0012] 所述的来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因，该基因CDNA序列全长度为 697bp，其中含有80bp的5'非翻译区，413bp的3'非翻译区和polyA尾巴，开放编码框为 201bp〇
[0013] 一种来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，该胰凝乳蛋白 酶抑制剂基因的重组表达工程菌株EUCIOl，实现所述基因的可溶性表达。
[0014] 所述的来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，EUCIOl表达 的重组蛋白，具有较强的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性，其IC50为53nM。
[0015] 所述的来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，胰凝乳蛋白 酶抑制剂活性，重组蛋白对PH稳定，同时具有温度稳定性。
[0016] 所述的来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，EUCIOl表达 的重组蛋白，能够对金黄色葡萄球菌产生抑制。
[0017] 本发明的优点及有益效果在于：
[0018] 1、本发明克隆得到一个单环刺縊胰凝乳蛋白酶抑制剂的CDNA序列，并利用重组 方法纯化制备了具有胰凝乳蛋白酶抑制活性的蛋白质。从而，为后续应用奠定了基础。
[0019] 2、本发明利用原核表达技术对该基因进行重组表达，获得的重组蛋白具有胰凝乳 蛋白酶抑制剂的活性，其IC50为53nM。该重组蛋白具有较好的pH稳定性和一定的温度稳 定性，对金黄色葡萄球菌具有抑菌效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1 :重组蛋白的SDS-PAGE分析图。其中，1蛋白marker ;2未诱导的EUCIOl ;3诱 导后的EUCOl ;4纯化后的UCIOl。
[0021] 图2 :UCI01对蛋白酶的抑制效果分析。其中，Trypsin为胰蛋白酶，Chymotrypsin 为胰凝乳蛋白酶，横坐标Inhibition Concentration代表UCIOl的浓度，纵坐标Residual enzyme activity代表蛋白酶的活性。
[0022] 图3 :温度、pH对UCIOl活性的影响。其中，a图为pH对UCIOl活性的影响；b为 温度对UCIOl活性的影响，纵坐标Residual enzyme activity代表所测试蛋白酶的活性。
【具体实施方式】
[0023] 以下为本
【发明内容】
的【具体实施方式】，但本发明的内容并不限于此，具体
【发明内容】
包括：
[0024] 1、单环刺縊胰凝乳蛋白酶抑制剂UCIOl基因
[0025] 本发明利用海水养殖病原菌刺激后的单环刺縊组织构建cDNA文库，通过大量的 测序，获得一个类似蛋白酶抑制剂的基因片段，通过RACE技术获得其全长基因。将本发明 的单环刺縊胰凝乳蛋白酶抑制剂编码基因经NCBI基因数据库进行搜寻比对，没有发现存 在任何相同基因或基因片段或基因表达产物的报道。通过对其可能的编码产物的比对分析 发现，其与一种水輕（Helobdella robusta)、紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus)以 及一些细菌中的推测可能具有蛋白酶抑制剂功能的蛋白质的相似性为42?59%。通过蛋 白质结果分析发现其可能属于马铃薯蛋白酶抑制剂I家族，命名为UCI01。
[0026] 单环刺縊胰凝乳蛋白酶抑制剂UCIOl的cDNA序列具有80bp 5'非翻译区，413bp 3'非翻译区和polyA尾巴，201bp的开放编码框，该基因具有序列表SEQ ID No. 2中的碱基 序列。
[0027] 编码的单环刺縊胰凝乳蛋白酶抑制剂UCIOl是单链多肽，含67个氨基酸残基，分 子量约为7516Da，等电点为4. 38,不含二硫键，该胰凝乳蛋白酶抑制剂的蛋白质具有氨基 酸序列 SEQ ID No. 1。
[0028] 2、UCIOl的重组表达菌株
[0029] 本发明根据获得的UCIOl基因设计引物，PCR扩增后亚克隆至原核表达质粒 pET25 (a)中，转化至相应的宿主菌中，成功构建基因工程菌株EUCIOl。
[0030] 根据pET系统的使用说明，通过优化诱导条件，进行重组蛋白的诱导表达。将诱导 后的EUCOl冰浴后超声破碎，基于表达载体所带的6个组氨酸标签，利用Ni亲和层析柱进 行重组蛋白的纯化。经SDS-PAGE分析，纯化后的重组UCIOl只有一条带，大小约为7. 6kDa， 与预期大小一致。经考马斯亮蓝R-250比色法测定的重组蛋白浓度为4mg/ml。
[0031] 3、重组UCIOl的应用
[0032] UCIOl的蛋白酶抑制剂活性测定采用比色法，利用牛胰凝乳蛋白酶和人胰蛋白酶， 其中膜凝乳蛋白酶底物为 Nsuccinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide (Sigma, USA)，膜 蛋白酶的底物采用BAPNA((Sigma，USA)。经测试，UCIOl显示了较弱的胰蛋白酶抑制能力。 但UCIOl具有较强的胰凝乳蛋白酶的抑制活性，其IC50为53nM。随后发现pH对UCIOl的 活性没有太大影响，同时UCIOl具有一定的温度稳定性，80°C下保存3. 5h仍可保持约20% 的活性。
[0033] 下面通过附图和实施例对本发明进一步详细说明。
[0034] 实施例1 :单环刺縊胰凝乳蛋白酶抑制剂基因UCIOl的获取
[0035] (1)组织总RNA提取：取市售单环刺縊在实验室条件下暂养2天，选择无任何病 症的健康个体，用约IX IO6个过夜培养至对数生长期的海水致病菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemdyticus)CGMCC 2164注射入单环刺婦体腔中。2h后，麻醉处死单环刺婦，取单环 刺縊的呼吸肠、体腔壁、体腔血液细胞等组织，称重，取200?300mg组织，加入8?IOml总 RNA提取缓冲液（Trizol溶液，TAKARA)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆。加入等体积苯酚/氯 仿溶液，剧烈混勻，室温放置10?15min，4?6°C于10000?12000rpm离心10?15min， 弃除沉淀。上清加入等体积的异丙醇，室温放置10?15min，4?6°C于10000?12000rpm 离心10?15min，沉淀用75wt%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为总RNA。
[0036] (2) mRNA 的纯化：采用美国 PR0MEGA 公司的 PoIyATtractw mRNA Isolation Systems试剂盒进行mRNA分离纯化。具体操作为：取总RNA 300?500 ii g溶于300? 500 ill的DEPC水中，放入65 °C水浴8?10min，加入3?5 ill的Oligo (dT)探针和 13?15 ill的20X SSC溶液（柠檬酸钠缓冲液），混匀，放置室温冷却，称为A液；将磁 珠（SA-PMP)轻弹混匀，至磁力架吸附时间30?40s，弃上清，加0. 5XSSC(柠檬酸钠缓冲 液）0? 3?0? 5ml，至磁力架吸附时间30?40s，最后加0? 1?0? 2ml的0? 5 X SSC悬浮，称之 为B液；将A液加入B液中，室温放置10?15min，至磁力架吸附30s，弃上清，用0. IXSSC 洗涤4次，最后弃上清，加0. 1?0. 2ml的DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30s，将上清移至 新的试管，再加入0. 15ml的DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30s，移上清至上述试管，加入 1/10体积3M(mol/L)乙酸钠和等体积的异丙醇，室温放置30?60min，4°C，12000rpm离心 10?15分钟，弃上清，沉淀溶解于10?20 ill的DEPC水中。
[0037] (3)单环刺縊 cDNA 文库的构建：采用 CL0NTECH 公司 Creator? SMART? cDNA Library Construction Kit。具体如下：
[0038] a、cDNA第一链合成（mRNA反转录）：在DEPC处理的离心管中加入I ill单环刺縊 mRNA、Iiil的SMART IV寡聚核苷酸、Iiil的CDS 111/3'PCR引物，加2 ill的DEPC处理的 水使总体积达到5iU。混匀离心管中的试剂并短暂离心，72°C保温2分钟。将离心管在冰 上孵育2分钟，在离心管中加入2. 0 ill的试剂盒中的第一链缓冲液、I. 0 ill的20mM(mmol/ U二硫苏糖醇、1. 〇 y 1的IOmM dNTP混合物、I. 0 y 1的PowerScript反转录酶。混合离心 管中试剂并短暂离心，在42°C保温1小时。将离心管置于冰上中止第一链的合成，从离心管 取2 ill所合成的cDNA第一链备用。
[0039] b、第二链的扩增：采用长末端聚合酶链式反应（LD-PCR)方法：将2 ill的cDNA 第一链（mRNA反转录）、80 ii 1去离子水、10 ii 1的IOXAdvantage 2 PCR缓冲液、2 ii 1的 50XdNTP混合物、2iil的5' PCR引物、2iil的CDS 111/3' PCR引物以及2iil的大肠杆菌 聚合酶离心管进行反应。95°C预变性20秒钟，95°C、5秒，68°C、6分钟，循环20次，将合成 的cDNA双链置于-20°C保存。
[0040] c、基因片段的筛选：将构建好的cDNA文库连接到pMDK'18-T Vertor (TAKARA)， 转化 DH5a，蓝白斑筛选阳性克隆，使用 Applied Biosystems DNA sequencer, model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。
[0041] d、完整cDNA序列的获取：对测序获得的UCIOl基因的部分片段两端设计引物，利 用RACE技术获取基因的完整cDNA序列。获得UCIOl的cDNA序列具有80bp 5'非翻译区， 413bp 3'非翻译区和polyA尾巴，201bp的开放编码框。其DNA序列为SEQ ID No. 2:
【权利要求】
1. 一种来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂，其特征在于，该胰凝乳蛋白酶抑制剂 的蛋白质具有氨基酸序列SEQ ID No. 1 : MATKEQWPELVGKSGEEAKAAIIAERPELEKVEICNELSPMTMDYRTDRVRIFVNNDGNVVNPPQTGo
2. 按照权利要求1所述的来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂，其特征在于，编 码的单环刺縊胰凝乳蛋白酶抑制剂UCI01是单链多肽，含67个氨基酸残基，分子量约为 7516Da，等电点为4. 38,不含二硫键，没有明显的信号肽区域。
3. -种来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因，其特征在于，该基因具有序列表 SEQ ID No. 2中的喊基序列。
4. 按照权利要求1所述的来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因，其特征在于， 该基因 cDNA序列全长度为697bp，其中含有80bp的5'非翻译区，413bp的3'非翻译区和 polyA尾巴，开放编码框为201bp。
5. -种来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应用，其特征在于，该 胰凝乳蛋白酶抑制剂基因的重组表达工程菌株EUCI01，实现所述基因的可溶性表达。
6. 按照权利要求5所述的来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应 用，其特征在于，所述的EUCI01表达的重组蛋白，具有较强的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性，其 IC50 为 53nM。
7. 按照权利要求6所述的来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应 用，其特征在于，所述的胰凝乳蛋白酶抑制剂活性，重组蛋白对pH稳定，同时具有温度稳定 性。
8. 按照权利要求5所述的来源于单环刺縊的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因重组蛋白的应 用，其特征在于，所述的EUCI01表达的重组蛋白，能够对金黄色葡萄球菌产生抑制。
【文档编号】C12N15/15GK104292328SQ201410549248
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】焦绪栋, 杨少丽 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所