CeDGAT1突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种CeDGAT1突变体及其在提高细胞脂肪酸含量方面的用途，所述编码CeDGAT1突变体的基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。利用本发明的编码CeDGAT1突变体的基因转化酵母细胞、植物细胞和微藻细胞能大幅提高细胞的总脂肪酸含量。
【专利说明】CeDGATI突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种二酰基甘油酰基转移酶突变体及其应用。具体地，涉及编码该突 变体的基因序列的获得和酵母表达载体的构建，以及其大幅度提高酵母脂肪酸含量的用 途。
【背景技术】
[0002] 生物柴油生产的最大瓶颈是原料问题，因此寻找新的资源，开发潜在的生物柴油 生产新原料成为生物柴油产业发展的重要途径。微藻是遍布全球水体的浮游植物，具有产 能大、无污染、可再生、易培养、含有较多的脂类物质等优点，在能量转化和碳元素循环中具 有重要的作用。有些微藻把光合作用产物转化为脂肪酸，进一步合成三酰甘油（TAG)，在细 胞中以油滴的形式贮藏起来。微藻细胞中的三酰甘油可达到干重的20% -50% [1]，提取后 通过转酯化后可转变为脂肪酸甲酯，即生物柴油[2]。大规模培养微藻是开发生物柴油，建立 可再生能源基地的重要途径。微藻中的小球藻可以进行光自养培养、也可以进行无光照的 异养培养，生长周期短，生长速度快，短时间可获得较高的生物产量和油脂产量，而且是少 数几个可用于大规模培养的微藻。所以，小球藻是进行能源微藻研究的一个潜在的理想材 料 [3_4]。
[0003] 三酰甘油（TAG)在大部分生物体中都是最主要的储藏脂类，包括脊椎动物、油料 作物、真菌以及微藻。TAG不仅在生物体生长、发育和繁衍过程中扮演着重要的角色，而且作 为一种可再生的生物能源产品，可用于生物柴油的生产，具有非常广泛的应用。在微藻中， TAG-般在逆境条件下积累于油体[5]。TAG的生物合成有依赖乙酰辅酶A和不依赖乙酰辅 酶A的途径。依赖乙酰辅酶A的合成途径，被称作Kennedy途径，也是合成TAG的主要途 径。该途径TAG组装是在内质网上进行的。首先，在质体中，乙酰-CoA在乙酰-CoA羧化酶 (ACCase)的作用下形成丙二酸单酰-CoA;丙二酸单酰-CoA进行逐步的缩合反应，从二碳 单酰基载体蛋白（ACP)开始，依次把二碳单位带入脂酰链，经过数次循环聚合以及去饱和 反应后形成不同碳链长度的酰基-ACP，然后在酰基辅酶A合成酶（ACS)的作用下合成酰基 辅酶A，并从质体转移到内质网或胞质中，成为真核生物内质网三酰甘油合成的底物。游离 脂肪酸被酯化生成酯酰辅酶A(CoA)后，在膜结合的甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT)，溶血 磷脂酸酰基转移酶（LPAT)，二酰甘油酰基转移酶（DGAT) 3种酰基转移酶以及磷脂酸磷酸水 解酶（PAPase)作用下，依次把甘油骨架第一至三位经酰基化合成三酰甘油，该生物合成过 程就是通常所说的起主导作用的Kennedy途径 [6<。
[0004] 二酰甘油酰基转移酶（DGAT)催化TAG合成途径即Kennedy途径的最后一步，也是 该途径唯一的限速酶。DGAT被认为是在TAG合成过程中起主要作用的酶，普遍存在于所有 已研究的真核生物中。目前为止，共发现3类DGAT基因家族，包括DGATl、DGAT2和DGAT3 基因家族 [&9]。Cases等[1°]在小鼠中克隆了第一个DGATl基因后，Hobbs等 [11]在拟南芥中 克隆了 DGATl基因，该基因在拟南芥中仅有一个拷贝。AtDGATl基因在野生型拟南芥中过量 表达研究发现，DGATl转录水平和活性明显提高（10% -70% )，油脂积累增加，种子平均重 量增加[12]。随后，油菜、蓖麻、烟草、大豆、玉米、橄榄、红花、向日葵、火焰卫矛和百脉根等植 物中DGATl基因也相继被克隆[13_16]。近年来，Lock[17]等通过将一个BnDGATl反义基因转化 到油菜DH12075中发现，DGATl基因的表达量、总体DGAT蛋白的酶活性和种子的含油量都有 明显的下降，同时，种子的产量以及萌发率也比转化前降低，而且种子发育严重畸形。这些 结果表明，DGAT除了在总油脂形成中有重要作用以外，它还影响种子的正常发育，但是具体 的调控机制目前还不清楚。目前，在一些微藻中也克隆到了 DGATl基因，Boyle等人[18]和 Guiheneuf等人[5]分别在衣藻和三角褐指藻中克隆到DGATl基因。莱茵衣藻和三角褐指藻 中DGATl基因的功能已被验证和具体阐述。DGAT2基因家族的成员在动物，植物和酵母中 都存在，并且与DGATl基因家族没有明显的同源性。目前对DGAT2的研究较少，仅在拟南芥 (GenBank收录号匪115011)、油菜（GenBank收录号AY 916129)、蓖麻少数植物中克隆出 来。近两年在莱茵衣藻[19<°]和Ostreococcus tauri[21]中也有报道。Saha[8]等人从发育 中的花生子叶细胞质中克隆得到了 DGAT3基因，该基因与DGATl和DGAT2基因家族的相似 性不足10%，但是其编码的蛋白具有类似DGAT蛋白功能基序，而且与TAG合成密切相关。
[0005] 近年来，对植物油脂的广泛需求极大的促进了 DGAT相关基因的研究，尤其是在利 用基因工程方法改良优质品质方面获得了较大的发展。2008年，Zheng等[22]通过对高油 玉米DGATl的研究发现，在DGAT1-2蛋白的F469位点处的一个苯丙氨酸的插入是提高油含 量和油酸含量的重要决定因素，阐明了油含量以及组成差异的分子基础。2008年，Xu等人 发现将旱金莲DGATl蛋白SnRKl作用区S197位点处的Ser突变为Ala，可将DGATl酶活性 提高38% -80%，在拟南芥中表达该突变体可使种子含油量提高20% -50% [23]。
【发明内容】
[0006] 本发明发现将来源于捕圆小球藻（Chlorella ellipsoidea)的CeDGATl蛋白Y553 位点处的Tyr突变为Ala后，把编码该CeDGATl突变体的基因转入酿酒酵母INVSCl后，相比 转入野生型CeDGATl基因的酵母INVSC1，可显著提高其主要脂肪酸组分的含量，包括棕榈 酸（(：16:0)提高了17.24%，棕榈油酸（(：16 :1)提高2.85%，硬脂酸（(：18:0)提高22.76%， 油酸（C18:l)提高0.43%。酵母细胞总脂肪酸的含量也提高了约6. 75%。相比转入空载 的酿酒酵母INVSC1，可大幅度提高其主要脂肪酸组分的含量，包括棕榈酸（C16:0)提高了 约282%，棕榈油酸（C16:l)提高204%，硬脂酸（C18:0)提高220%，油酸（C18:l)提高 187%。酵母细胞总脂肪酸的含量也提高了约217%。总脂肪酸及各主要脂肪酸组分的含量 这种幅度的提高还未见报道。前期工作表明野生型CeDGATl就是能大幅度提高转基因酿酒 酵母INVSCl脂肪酸含量的高活性DGAT。CeDGATl突变体的活性比野生型CeDGATl更高，具 有重要的应用价值。
[0007] 本发明提供了一个编码CeDGATl突变体的基因，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，该基因 cDNA全长为2142bp。
[0008] 本发明还提供了含本发明所述基因（CeDGATl突变体基因）的酵母表达载体。
[0009] 本发明在一个方面提供了包含本发明所述基因的酵母、植物或藻类，所述植物包 括拟南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、蓖麻、棉花、橄榄、和红花等。优选地，所述藻类选自小 球藻，更优选地选自椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea)。所述酵母优选地选自酿酒酵 母，更具体地是酿酒酵母INVSCl。
[0010] 本发明提供一个编码椭圆小球藻CeDGATl突变体的基因，其可用于利用基因工程 方法提高酵母、植物或藻类油脂等方面。
[0011] 更具体地，本发明提供以下各项：
[0012] I. CeDGATl蛋白突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0013] 2.编码根据1所述的CeDGATl蛋白突变体的基因。
[0014] 3.根据2所述的基因，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0015] 4.载体，其包含根据2或3所述的基因，所述载体可以通过将根据2或3所述的基 因转入到 PYES2. 0(可购自 Invitrogen 公司），pBIN19、pBI121、pBI221 (可购自 Clontech)， pCambia 1300(可购自 Cambia 公司）或 pGreen(可购自 the John Innes Centre)中制备。
[0016] 5.宿主细胞，其包含根据1所述的CeDGATl蛋白突变体、根据2或3所述的基因或 根据4所述的载体。
[0017] 6. -种制备具有高棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和/或油酸含量，或具有高总脂肪 酸含量的酵母、植物或藻类的细胞的方法，所述方法包括将根据2或3所述的基因或根据 4所述的载体转入所述酵母、植物或藻类的细胞中，所述酵母优选是酿酒酵母，更优选是尿 嘧啶缺陷型酿酒酵母INVSCl ;所述藻类优选是小球藻，更优选是椭圆小球藻（Chlorella el I ipsoidea);所述植物优选选自拟南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、番爺、菌麻、棉花、芝麻 或花生。
[0018] 7.根据1所述的CeDGATl蛋白突变体、根据2或3所述的基因或根据4所述的载 体在制备具有高总脂肪酸含量的酵母、植物或藻类的细胞中的用途，所述酵母优选是酿酒 酵母，更优选是尿嘧啶缺陷型酿酒酵母INVSCl ;所述藻类优选是小球藻，更优选是椭圆小 球藻（Chlorella ellipsoidea);所述植物优选选自拟南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、番 茄、蓖麻、棉花、芝麻或花生，所述具有高总脂肪酸含量的酵母、植物或藻类的细胞优选是具 有高棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和/或油酸含量的酵母、植物或藻类的细胞。
[0019] 8.根据1所述的CeDGATl蛋白突变体、根据2或3所述的基因或根据4所述的载 体在提高酵母、植物或藻类的细胞中棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和/或油酸含量，或总脂肪 酸含量中的用途，所述酵母优选是酿酒酵母，更优选是尿嘧啶缺陷型酿酒酵母INVSCl ;所 述藻类优选是小球藻，更优选是椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea);所述植物优选选自 拟南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻或花生。
[0020] 9.利用根据6所述的方法制备的具有高棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和/或油酸含 量，或具有高总脂肪酸含量的酵母、植物或藻类的细胞。
[0021] 10.根据9所述的酵母、植物或藻类的细胞在生产生物柴油中的用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1.含本发明的椭圆小球藻CeDGATl突变体基因的酵母表达载体 pYES-CeDGATlY553A〇
[0023] 图2. GC-MS法测定的酵母各脂肪酸组分含量以及总脂肪酸含量（CK为转空载酵 母，PYES-CeDGATl为转入野生型CeDGATl基因的酵母，pYES-CeDGATlY553A为转入本发明的 CeDGATl突变体基因的酵母）。
【具体实施方式】
[0024] 下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是， 下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护 范围由后附的所限定。
[0025] 实施例1.含有编码CeDGATl突变体基因的酵母表达载体的获得
[0026] 前期实验室已将来源于椭圆小球藻的野生型CeDGATl基因构建到酵母表达载体 PYES2. 0(购自Invitrogen公司）上，并将其命名为pYES-CeDGATl (具体构建过程请参见发 明专利申请201310316565. 6)。现提取pYES-CeDGATl重组质粒，以其为模板进行定点突变 PCR扩增。
[0027] 上下游引物（见SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)分别是：
[0028] 5' -CGTTCCTACTTTGGCCGGCTGGCTCATCA-3'
[0029] 5, -TGATGAGCCAGCCGGCCAAAGTAGGAACG-3，。
[0030] 其中下划线为引入的突变位点。具体操作参照Site-directed Gene Mutagenesis Kit(购自碧云天）说明书进行。
[0031] 基因定点突变反应体系如下：
[0032]
【权利要求】
1. CeDGATl蛋白突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2. 编码根据权利要求1所述的CeDGATl蛋白突变体的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
4. 载体，其包含根据权利要求2或3所述的基因。
5. 宿主细胞，其包含根据权利要求1所述的CeDGATl蛋白突变体、根据权利要求2或3 所述的基因或根据权利要求4所述的载体。
6. -种制备具有高棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和/或油酸含量，或具有高总脂肪酸含量 的酵母、植物或藻类的细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求2或3所述的基因或根 据权利要求4所述的载体转入所述酵母、植物或藻类的细胞中，所述酵母优选是酿酒酵母， 更优选是尿嘧啶缺陷型酿酒酵母INVSCl ;所述藻类优选是小球藻，更优选是椭圆小球藻 (Chlorella ellipsoidea);所述植物优选选自拟南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、番爺、菌 麻、棉花、芝麻或花生。
7. 根据权利要求1所述的CeDGATl蛋白突变体、根据权利要求2或3所述的基因或 根据权利要求4所述的载体在制备具有高总脂肪酸含量的酵母、植物或藻类的细胞中的用 途，所述酵母优选是酿酒酵母，更优选是尿嘧啶缺陷型酿酒酵母INVSCl ;所述藻类优选是 小球藻，更优选是椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea);所述植物优选选自拟南芥、烟草、 油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻或花生，所述具有高总脂肪酸含量的酵母、植物 或藻类的细胞优选是具有高棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和/或油酸含量的酵母、植物或藻类 的细胞。
8. 根据权利要求1所述的CeDGATl蛋白突变体、根据权利要求2或3所述的基因或根据 权利要求4所述的载体在提高酵母、植物或藻类的细胞中棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和/或 油酸含量，或总脂肪酸含量中的用途，所述酵母优选是酿酒酵母，更优选是尿嘧啶缺陷型酿 酒酵母INVSCl ;所述藻类优选是小球藻，更优选是椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea); 所述植物优选选自拟南芥、烟草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻或花生。
9. 利用根据权利要求6所述的方法制备的具有高棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和/或油酸 含量，或具有高总脂肪酸含量的酵母、植物或藻类的细胞。
10. 根据权利要求9所述的酵母、植物或藻类的细胞在生产生物柴油中的用途。
【文档编号】C12N15/81GK104312991SQ201410548711
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】胡赞民, 郭雪洁, 陈宇红, 范成明 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所