肥胖基因检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了肥胖基因检测试剂盒，该试剂盒包括盒体及盒体内单独存放的试剂，试剂包括：(1)针对8个基因SNP多态位点的PCR反应引物组；(2)PCR扩增试剂；(3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂。本发明通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应可在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到导致其肥胖的遗传因素，根据基因分型结果得到基因对体重BMI值的影响，计算目标体重区间，从而为受测者获得一个合适的减肥方案，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。
【专利说明】肥胖基因检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测，具体涉及肥胖基因检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 超重和肥胖是全球引起死亡的第五大风险，肥胖与许多疾病相关联，典型的如糖 尿病，冠心病，动脉硬化等等。同时肥胖还带来了种种心理问题和社会歧视。全球有11亿超 重人群，中国的肥胖人群也在不断激增，统计表明现今中国有至少3亿肥胖患者。人类肥胖 是基因与环境共同作用的结果。缺乏运动和过度饮食是导致肥胖的主要外在因素。然而内 在的基因因素也在很大程度上决定了一个人的肥胖程度，以及饮食和运动对肥胖的影响。
[0003] 目前大部分减肥方案的制定未考虑并重视基因信息的作用，无法分析得到导致其 肥胖的遗传因素，从而难以得到合适的减肥方案，可能对肥胖者无效甚至有害健康，目前对 检测肥胖基因试剂盒的研宄，由于引物设计的不足，难以达到检测的高效性、特异性。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明提供了一种肥胖基因检测试剂盒，该试剂盒对受测者的相关基 因进行检测，分析得到导致其肥胖的遗传因素，且PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行 并具备检测的高效性、特异性。
[0005] 一种肥胖基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包 括：
[0006] (1)针对8个基因 SNP多态位点的PCR反应引物组：
[0007] 针对FAM2基因 SNP rs7138803的引物组：
[0008] 5, -GAATTCCACAAGA-3'
[0009] 5, -ACAGCAGGGTGAC-3，
[0010] 5, -TGTGCGTGCACGC-3，
[0011] 5 ' -CTGGGCAACAAG-3 '
[0012] 针对FTO基因 SNP rs9939609的引物组：
[0013] 5' -GCTGTGAATTTA-3'
[0014] 5' -CAAGTGCATCACA-3'
[0015] 5' -TGTTGGAATATGAG-3'
[0016] 5, -ATAGTTTCGATC-3'
[0017] 针对FTO基因 SNP rs3751812的引物组：
[0018] 5' -GTGAGCTGTCAAG-3'
[0019] 5' -CTCCCTGCCAACTA-3'
[0020] 5' -TCCTTAAAGATTC-3'
[0021] 5' -ACATTGAAACAGC-3'
[0022] 针对MC4R基因 SNP rsl0871777的引物组：
[0023] 5' -GTGTTTTACACAA-3'
[0024] 5' -CACACATGACAC-3'
[0025] 5' -GTGTTTTACACA-3'
[0026] 5' -TGTATATTGAAA-3'
[0027] 针对 GNPDA2 基因 SNP rsl3130484 的引物组：5' -CCCAGTCATGGCA-3'
[0028] 5' -GCATTGCCTCTA-3'
[0029] 5' -CCTCCGATTGCAG-3'
[0030] 5, -AGATGGTTTCC-3，
[0031] 针对SH2B1基因 SNP rs4788102的引物组：
[0032] 5' -GAGGACTTTTCAA-3'
[0033] 5' -CCCAAGTAATC-3'
[0034] 5' -GATTTATCCGTC-3'
[0035] 5, -ATCTCAAAAAT-3，
[0036] 针对 MTCH2 基因 SNP rs 10838738 的引物组：
[0037] 5, -CATTCCTAGGCACA-3'
[0038] 5, -ACCTCATGCAGC-3，
[0039] 5, -ATCTAGCCCCAAA-3'
[0040] 5' -TCAGATTTCGG-3'
[0041] 针对NEGRI基因 SNP rs3101336的引物组：
[0042] 5' -CAGACATCTATACA-3'
[0043] 5, -ACTGAACTTAGC-3'
[0044] 5, -CGAATTTAAGTCTC-3，
[0045] 5, -TCTAGTACAAGC-3' ；
[0046] (2) PCR 扩增试剂；
[0047] (3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
[0048] 本发明提供的肥胖基因检测试剂盒的有益效果是：通过PCR引物的设计使多个 PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高 效性、特异性，分析得到导致其肥胖的遗传因素，计算得到目标体重区间，从而为受测者获 得一个合适的减肥方案，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 图1是反应产物琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0050] 肥胖基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包括：
[0051] (1)针对8个基因 SNP多态位点的PCR反应引物组：
[0052] 针对FAIM2基因 SNP rs7138803的引物组：
[0053] 5, -GAATTCCACAAGA-3'
[0054] 5' -ACAGCAGGGTGAC-3'
[0055] 5, -TGTGCGTGCACGC-3'
[0056] 5' -CTGGGCAACAAG-3'
[0057] 针对FTO基因 SNP rs9939609的引物组：
[0058] 5' -GCTGTGAATTTA-3'
[0059] 5, -CAAGTGCATCACA-3'
[0060] 5' -TGTTGGAATATGAG-3'
[0061] 5' -ATAGTTTCGATC-3'
[0062] 针对FTO基因 SNP rs3751812的引物组：
[0063] 5' -GTGAGCTGTCAAG-3'
[0064] 5' -CTCCCTGCCAACTA-3'
[0065] 5' -TCCTTAAAGATTC-3'
[0066] 5, -ACATTGAAACAGC-3，
[0067] 针对MC4R基因 SNP rsl0871777的引物组：
[0068] 5' -GTGTTTTACACAA-3'
[0069] 5, -CACACATGACAC-3，
[0070] 5, -GTGTTTTACACA-3'
[0071] 5' -TGTATATTGAAA-3'
[0072] 针对 GNPDA2 基因 SNP rsl3130484 的引物组：
[0073] 5' -CCCAGTCATGGCA-3'
[0074] 5, -GCATTGCCTCTA-3，
[0075] 5, -CCTCCGATTGCAG-3'
[0076] 5' -AGATGGTTTCC-3'
[0077] 针对SH2B1基因 SNP rs4788102的引物组：
[0078] 5, -GAGGACTTTTCAA-3'
[0079] 5' -CCCAAGTAATC-3'
[0080] 5' -GATTTATCCGTC-3'
[0081] 5' -ATCTCAAAAAT-3'
[0082] 针对 MTCH2 基因 SNP rs 10838738 的引物组：
[0083] 5, -CATTCCTAGGCACA-3'
[0084] 5, -ACCTCATGCAGC-3，
[0085] 5, -ATCTAGCCCCAAA-3'
[0086] 5' -TCAGATTTCGG-3'
[0087] 针对NEGRI基因 SNP rs3101336的引物组：
[0088] 5' -CAGACATCTATACA-3'
[0089] 5, -ACTGAACTTAGC-3'
[0090] 5' -CGAATTTAAGTCTC-3'
[0091] 5, -TCTAGTACAAGC-3' ；
[0092] (2) PCR 扩增试剂；
[0093] (3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
[0094] 下面将结合实施例对本发明提供的方法予以进一步的说明。
[0095] 本实施例对肥胖者采用肥胖基因检测试剂盒同时检测8个基因的SNP多态位点， 并根据基因分型结果得到基因对体重BMI值的影响，计算目标体重区间，从而更加科学合 理的制定减肥目标，采取更加合适的减肥方案。
[0096] 该肥胖者信息如下：性别男，身高180,体重97公斤，计算得BMI =体重/身高2 = 30,属于肥胖人群。
[0097] 使用到的肥胖基因检测试剂盒内试剂由以下组成：
[0098] (1)针对8个基因 SNP多态位点的PCR反应引物组：
[0099] 针对FAIM2基因 SNP rs7138803的引物组：
[0100] 5' -GAATTCCACAAGA-3'
[0101] 5' -ACAGCAGGGTGAC-3'
[0102] 5' -TGTGCGTGCACGC-3'
[0103] 5, -CTGGGCAACAAG-3'
[0104] 针对FTO基因 SNP rs9939609的引物组：
[0105] 5' -GCTGTGAATTTA-3'
[0106] 5, -CAAGTGCATCACA-3'
[0107] 5' -TGTTGGAATATGAG-3'
[0108] 5' -ATAGTTTCGATC-3'
[0109] 针对FTO基因 SNP rs3751812的引物组：
[0110] 5，-GTGAGCTGTCAAG-3 '
[0111] 5 ' -CTCCCTGCCAACTA-3 '
[0112] 5 ' -TCCTTAAAGATTC-3 '
[0113] 5 ' -ACATTGAAACAGC-3 '
[0114] 针对MC4R基因 SNP rsl0871777的引物组：
[0115] 5 ' -GTGTTTTACACAA-3 '
[0116] 5 ' -CACACATGACAC-3 '
[0117] 5 ' -GTGTTTTACACA-3 '
[0118] 5 ' -TGTATATTGAAA-3 '
[0119] 针对 GNPDA2 基因 SNP rsl3130484 的引物组：
[0120] 5' -CCCAGTCATGGCA-3'
[0121] 5' -GCATTGCCTCTA-3'
[0122] 5' -CCTCCGATTGCAG-3'
[0123] 5' -AGATGGTTTCC-3'
[0124] 针对SH2B1基因 SNP rs4788102的引物组：
[0125] 5' -GAGGACTTTTCAA-3'
[0126] 5' -CCCAAGTAATC-3'
[0127] 5' -GATTTATCCGTC-3'
[0128] 5' -ATCTCAAAAAT-3'
[0129] 针对 MTCH2 基因 SNP rs 10838738 的引物组：
[0130] 5' -CATTCCTAGGCACA-3'
[0131] 5' -ACCTCATGCAGC-3'
[0132] 5, -ATCTAGCCCCAAA-3'
[0133] 5' -TCAGATTTCGG-3'
[0134] 针对NEGRI基因 SNP rs3101336的引物组：
[0135] 5' -CAGACATCTATACA-3'
[0136] 5' -ACTGAACTTAGC-3'
[0137] 5' -CGAATTTAAGTCTC-3'
[0138] 5，-TCTAGTACAAGC-3，。
[0139] (2)?0?扩增试剂：10\?0?缓冲液，该？0?缓冲液为10〇11111'1^8-!1(：4!18.3,50〇1111 KC1，15mM MgCl2;dNTPs混合物，该dNTPs混合物为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，三磷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP，三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP 四种核苷酸，各组分浓度为2. 5mM ;5U/ μ 1热启动Taq酶。
[0140] (3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、Goldview染 色液和DNA上样缓冲液，该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至IX后使用。
[0141] 使用上述肥胖基因检测试剂盒按如下步骤进行检测：
[0142] (1)提取样本基因组DNA。
[0143] 采集该肥胖者唾液，向l_2ml唾液样品中加入500ul提取缓冲溶液，该DNA提取缓 冲溶液溶剂为50mM的Tris-HCl pH7. 4、0. 5mM的EDTA和50mM的NaCl，反复吹打混匀后， 8000 Xg离心5分钟，弃去上清，此步骤重复一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液，该裂解 液溶剂为 50mM Tris-HClpH7.4,50mM Tris-HCl ρΗ7· 4,150mM NaCl，ImM EDTA，1% Triton x_100，l% Sodium deoxycholate，0. 1% SDS，蛋白酶 K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混勾 后，室温放置30分钟，期间来回颠倒离心管数次；得到的混合液中，加入浓度为lOmg/mLRNA 酶的水溶液10uL，37°C下静置IOmin ;得到的上清液中，加入等体积苯酚-氯仿混合溶 液，苯酚和氯仿体积比为I : 1，充分混匀，混合液4°C，12000 X g离心5分钟，上清液移入 干净离心管内；加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇体积比为 25 : 24 : 1，充分混匀后，4°C，12000Xg离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入等体 积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4°C，12000 X g离心5分钟，上清液移入干净离心管 内；加入0. 6倍体积的冰浴异丙醇溶液及0. 1倍的3mol/L醋酸钠溶液，-20°C静置60分钟 后，4°C，12000 Xg离心10分钟，弃上清液；得到的沉淀物中加入0. 5mL 70 %乙醇清洗沉淀 物，4°C，12000Xg离心5分钟，弃上清液，此步骤重复一次；得到的沉淀物自然风干，加入 20 μ L无菌超纯水回溶，电泳检测，-20°c保存。
[0144] (2) PCR 扩增。
[0145] 本实施例同时检测？4頂2基因5咿^7138803、？1'0基因5咿^9939609、？1'0基因 SNP rs3751812、MC4R 基因 SNP rsl0871777、GNPDA2 基因 SNPrsl3130484、SH2B1 基因 SNP rs4788102、MTCH2 基因 SNP rsl0838738、NEGRl 基因 SNP rs3101336,每个 SNP 的检测需要 一对上下游引物、两条多态引物共4条PCR引物，共需要32条引物。每个SNP的检测需要 做两管PCR扩增，为防止出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功，加设一管阴性对照组， 共做17管PCR，所述阴性对照组基因组模板及反应体系是一样的，但没有引物存在。
[0146] 根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系： 2. 5yllOXPCR缓冲液，2μ1 dNTPs，0. 5μ1引物组，热启动Taq酶0. 15μ1，基因组模板 80mg，添加超纯水至总体积为25 μ 1。
[0147] 将装有反应溶液的Eppendorf试管放入ABI 9700 PCR仪中，设置反应条件如下： 预变性95°0 31^11;热循环94°0 3〇8,60°0 3〇8,72°0 3〇8,35个循环；延伸72°0 31^11。反应 结束后，取出试管。
[0148] 由于17管PCR扩增反应是在同一台PCR仪上同步进行的，为了实现检测的高效 性、特异性，要求32条PCR引物的Tm值相近，为此需要先进行大量的DNA序列软件分析来 设计PCR引物，并通过大量的实验来进行Tm值的优化并确定设计的合理性，本试剂盒各基 因 SNP多态性的检测是既相对独立又相互联系的，不可分割。
[0149] (3)琼脂糖凝胶电泳检测
[0150] 将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下3g琼脂糖，加入IOOmL去离子水， 微波炉加热lmin，冷却到60°C时加入5 μ L Goldview染色液，制成3%的琼脂糖凝胶。PCR 产物10 μ L与6ΧΤΒΕ缓冲液0. 8 μ L混合上样，电压100V电泳15min。紫外灯下读取结果 并拍照，所得琼脂糖电泳检测图如图1所示。
[0151] 检测得到8个基因分型分析结果如下：FAM2基因 SNP rs7138803分型结果为AA， FTO基因 SNP rs9939609分型结果为AA，FT0基因 SNPrs3751812分型结果为TT，MC4R基因 SNP rsl0871777 分型结果为 GG，GNPDA2 基因 SNP rsl3130484 分型结果为 TT，SH2B1 基因 SNP rs4788102 分型结果为 AA，MTCH2 基因 SNP rs 10838738 分型结果为 AG，NEGRl 基因 SNP rs3101336分型结果为CC。
[0152] 根据基因分型测试结果，计算该男子目标体重区间，基因对体重BMI的影响因子 如下表：
[0153]
【权利要求】
1.肥胖基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，其特征在于：存放的试 剂包括： (1)针对8个基因 SNP多态位点的PCR反应引物组： 针对FAM2基因 SNP rs7138803的引物组： 5' -GAATTCCACAAGA-3， 5' -ACAGCAGGGTGAC-3' 5' -TGTGCGTGCACGC-3' 5' -CTGGGCAACAAG-3， 针对FTO基因 SNP rs9939609的引物组： 5' -GCTGTGAATTTA-3' 5' -CAAGTGCATCACA-3' 5' -TGTTGGAATATGAG-3' 5' -ATAGTTTCGATC-3' 针对FTO基因 SNP rs3751812的引物组： 5' -GTGAGCTGTCAAG-3' 5' -CTCCCTGCCAACTA-3' 5' -TCCTTAAAGATTC-3' 5' -ACATTGAAACAGC-3' 针对MC4R基因 SNP rsl0871777的引物组： 5' -GTGTTTTACACAA-3' 5' -CACACATGACAC-3' 5' -GTGTTTTACACA-3' 5' -TGTATATTGAAA-3' 针对GNPDA2基因 SNP rsl3130484的引物组： 5' -CCCAGTCATGGCA-3' 5' -GCATTGCCTCTA-3' 5' -CCTCCGATTGCAG-3' 5' -AGATGGTTTCC-3' 针对SH2B1基因 SNP rs4788102的引物组： 5' -GAGGACTTTTCAA-3， 5' -CCCAAGTAATC-3' 5' -GATTTATCCGTC-3' 5' -ATCTCAAAAAT-3' 针对MTCH2基因 SNP rs 10838738的引物组： 5' -CATTCCTAGGCACA-3' 5' -ACCTCATGCAGC-3' 5' -ATCTAGCCCCAAA-3' 5' -TCAGATTTCGG-3' 针对NEGR1基因 SNP rs3101336的引物组： 5' -CAGACATCTATACA-3' 5' -ACTGAACTTAGC-3' 5' -CGAATTTAAGTCTC-3' 5' -TCTAGTACAAGC-3' ； (2) PCR扩增试剂； (3) 琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
2. 根据权利要求1所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述引物用量均为 0. 5~1, 0 u 1 〇
3. 根据权利要求1所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂包括： 10XPCR缓冲液，dNTPs，热启动Taq酶，基因组模板。
4. 根据权利要求3所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包含： 100mM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl，15mM MgCl2。
5. 根据权利要求3所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂用量 为：10XPCR 缓冲液 2. 5y 1，dNTPs2y 1，热启动 Taq 酶 0? 1-0. 2y 1，基因组模板 50-100ng。
6. 根据权利要求1所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳分 析试剂包括：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、DNA无毒染料和DNA上样缓冲液。
7. 根据权利要求6所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述DNA无毒染料优选 Biotium Gelred 无毒染料。
【文档编号】C12Q1/68GK104480195SQ201410549229
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】李则轩, 朱轶凡, 张舒, 邱嘉铭, 别茜, 张静静 申请人:武汉白原科技有限公司