一种多糖多酚植物组织总rna提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种多糖多酚植物组织总RNA提取方法，其特征在于：配制100mlRNA提取液；往1.5ml RNase-free离心管中加入400μl-1ml的RNA提取液，加入终浓度为1％-10％的巯基乙醇，混匀；取约100mg植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速转移至上述离心管中，震荡混匀；10000-12000r/min，冷冻离心10-15min；取上清液，加入700μl-1ml TRIzol试剂，混匀，立即加入200μl氯仿或氯仿和异戊醇的混合物，剧烈混匀，室温放置几分钟；10000-12000r/min，冷冻离心10-15min；取上清，加入等体积的异丙醇或2-2.5倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后，室温静置10-20min；10000-12000r/min,冷冻离心10min；加入0.5-1ml70％-75％的乙醇溶液，上下颠倒，室温放置2-15分钟；7500-12000r/min，冷冻离心；重复清洗一次，弃上清后，短暂离心，吸出剩余乙醇；加入适量RNase-free水溶解，得到葡萄叶片总RNA。
【专利说明】一种多糖多酚植物组织总RNA提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，主要涉及一种总RNA提取方法，具体来说就是一种 应用改良的TRIzoI法提取多糖多酚植物总RNA的方法。
【背景技术】
[0002] RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，对其分离纯化是研究基因功能的重 要基础之一（Tong ZG et al.，2012)。高质量的RNA对于后续文库构建、RNA-seq以及其他的 分子生物学分析极其重要。而对于大多数植物组织来说，抽提高质量的RNA显得尤为重要， 因为绝大多数植物材料富含多糖、多酚、蛋白质以及次级代谢产物。多酚类物质在研磨过程 中很容易被氧化，并能结合蛋白质和核酸形成大分子物质；在提取过程中，多糖和多酚类物 质可能会导致RNA降解，干扰后续的实验应用（Salzman et al.，1999 ;Asif et al.，2000)。
[0003] 许多植物组织（如苹果、樱桃、李子和葡萄等）以及树木类植物中富含酚类化合 物。植物材料在经过前期的破碎处理后，酚类物质会释放出来，氧化后处理液会变为褐色， 呈现褐化效应，被氧化的酚类物质能与RNA不可逆的结合，导致RNA活性丧失，而在用苯酚、 氯仿抽提时RNA可能会丢失或者形成不溶性复合物，从而影响RNA的分离纯化。
[0004] 而多糖的干扰也是RNA提取过程中遇到的另一个常见问题，多糖的理化性质与 RNA很相似，很难将二者分开。如果去除多糖，RNA也会随机被带走，造成RNA得率降低；而 在沉淀RNA时，也往往会产生多糖的凝胶状沉淀，这种沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状 的溶液，很难将其与RNA分开，且多糖可以抑制许多酶的活性，影响后续的反应。在常规的 方法中，通过SDS-盐酸胍盐或高浓度的盐离子环境下、Licl沉淀可以去除部分多糖，但仍 不能去除干净，还需要更有效的方法来解决此问题
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了提供一种多糖多酚植物组织总RNA提取方法，以解决现有技 术的上述问题。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
[0007] -种多糖多酚植物组织总RNA提取方法，其步骤为：
[0008] 1)配制IOOmlRNA提取液：其中包含：50mM三羟甲基氨基甲烷（Tris) ;200mM氯化 钠（NaCl) ;10mM 乙二胺四乙酸（EDTA) ;1· 5% -2% (m/v)十二烷基硫酸钠（SDS) ;2% -4% (m/v)聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，溶液pH = 8. 0 ;再加入0· Iml焦碳酸二乙酯（DEPC)，磁力搅 拌器上搅拌过夜，高压灭菌；
[0009] 2)往I. 5ml RNase-free离心管中加入400 μ I-Iml的RNA提取液，加入终浓度为 1% -10%的巯基乙醇，混匀；
[0010] 3)取约IOOmg植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速转移至上述离心管中，震荡混 匀；
[0011] 4) 10000-12000r/min，冷冻离心 10-15min ;
[0012] 5)取上清液，加入700 μ 1-lml TRIzol试剂，混匀，立即加入200 μ 1氯仿或氯仿和 异戊醇的混合物，剧烈混匀，室温放置几分钟；
[0013] 6) 10000-12000r/min，冷冻离心 10-15min ;
[0014] 7)取上清，加入等体积的异丙醇或2-2. 5倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后，室 温静置10_20min ;
[0015] 8) 10000-12000r/min，冷冻离心 IOmin ;
[0016] 9)加入0. 5-lml 70% -75%的乙醇溶液，上下颠倒，室温放置2-15分钟；
[0017] 10) 7500-12000r/min，冷冻离心；
[0018] 11)重复清洗一次，弃上清后，短暂离心，吸出剩余乙醇；
[0019] 12)加入适量RNase-free水溶解，得到葡萄叶片总RNA。
[0020] 步骤5)中，氯仿和异戊醇的质量比为24:1。
[0021] 步骤7)中，无水乙醇沉淀可选择在_20°C冰箱中静置半小时。
[0022] 本发明技术方案与现有技术相比较，具有以下有益效果：
[0023] 1、省去了 Licl沉淀的步骤，在抽提过程中先去除多糖和多酚和部分蛋白质，随后 使用Trizol再去除蛋白质，整个流程在一个小时内即可完成，所得RNA质量较高，大大提高 了 RNA提取的时间和效率；
[0024] 2、使用Licl沉淀法沉淀核酸会去除5sRNA和小RNA，对于小RNA建库会造成干扰， 而本方法会抽提出5sRNA，降解较少，能满足小RNA建库的要求。
[0025] 3、现在市面上有许多抽提多糖多酚植物的RNA提取试剂盒，但价格相对较昂贵， 本方法价格低廉，大大降低了实验成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为葡萄叶片RNA琼脂糖电泳图；
[0027] 图中，上样量均为200-300ng，Marker(DL2000)上样量为3μ 1 ;1、2、3、4泳道为改 良的Trizol法提取；5、6泳道为Trizol法提取；7-8为试剂盒过柱法提取
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。
[0029] 实施例1 :制备RNA提取液
[0030] 配制100ml RNA提取液：提取液中包含：50mM三羟甲基氨基甲烷（Tris) ;200mM氯 化钠（NaCl) ;10mM乙二胺四乙酸（EDTA) ;1. 5% (m/v)十二烷基硫酸钠（SDS) ;2% (m/v)聚 乙烯吡咯烷酮（PVP)，溶液pH = 8. 0 ;再加入0. Iml焦碳酸二乙酯（DEPC)，磁力搅拌器上搅 拌过夜，高压灭菌；得到RNA提取液待用。
[0031] 实施例2 :制备RNA提取液
[0032] 配制100ml RNA提取液：提取液中包含：50mM三羟甲基氨基甲烷（Tris) ;200mM氯 化钠（NaCl) ;10mM乙二胺四乙酸（EDTA) ;2% (m/v)十二烷基硫酸钠（SDS) ;3% (m/v)聚 乙烯吡咯烷酮（PVP)，溶液pH = 8. 0 ;再加入0. Iml焦碳酸二乙酯（DEPC)，磁力搅拌器上搅 拌过夜，高压灭菌；得到RNA提取液待用。
[0033] 实施例3 :制备RNA提取液
[0034] 配制100ml RNA提取液：提取液中包含：50mM三羟甲基氨基甲烷（Tris) ;200mM氯 化钠（NaCl) ;10mM乙二胺四乙酸（EDTA) ;2% (m/v)十二烷基硫酸钠（SDS) ;4% (m/v)聚 乙烯吡咯烷酮（PVP)，溶液pH = 8. 0 ;再加入0. Iml焦碳酸二乙酯（DEPC)，磁力搅拌器上搅 拌过夜，高压灭菌；得到RNA提取液待用。
[0035] 实施例4 :提取葡萄叶片总RNA
[0036] 1)往I. 5ml RNase-free离心管中加入600 μ 1的实施例1制备的RNA提取液，力口 入30 μ 1疏基乙醇，混勾。
[0037] 2)取约IOOmg葡萄叶片于液氮中研磨成粉末，迅速转移至上述离心管中，震荡混 匀。
[0038] 3) 4°C，12000r/min，离心 15min
[0039] 4)取上清液（约500 μ I)，加入800 μ I TRIzol试剂，混匀，立即加入200 μ 1氯仿， 剧烈混匀，室温放置2-3min
[0040] 5) 4°C，12000r/min，离心 IOmin
[0041] 6)取上清，加入800 μ 1异丙醇，上下颠倒混匀后，室温静置IOmin
[0042] 7) 12000r/min，4?,离心 IOmin
[0043] 8)加入约Iml 75%乙醇，上下颠倒，室温放置2min
[0044] 9) 4°C, 12000r/min，离心 5min
[0045] 10) 75%乙醇再重复清洗一次，弃上清后，短暂离心，吸出剩余乙醇
[0046] 11)加入50 μ I RNase-free水溶解,得到葡萄叶片总RNA。
[0047] 实施例5 :提取葡萄叶片总RNA
[0048] 1)往I. 5ml RNase-free离心管中加入400 μ 1的实施例1制备的RNA提取液，力口 入30 μ 1疏基乙醇，混勾。
[0049] 2)取约IOOmg葡萄叶片于液氮中研磨成粉末，迅速转移至上述离心管中，震荡混 匀。
[0050] 3) 4°C，10000r/min，离心 12min
[0051] 4)取上清液（约500 μ I)，加入700 μ I TRIzol试剂，混匀，立即加入200 μ 1氯仿， 剧烈混匀，室温放置2-3min
[0052] 5) 4°C，12000r/min，离心 15min ;
[0053] 6)取上清，加入700 μ 1异丙醇，上下颠倒混匀后，室温静置8min ;
[0054] 7) 11000r/min，4°C,离心 IOmin ;
[0055] 8)加入约Iml 75%乙醇，上下颠倒，室温放置5min ;
[0056] 9) 4。。，12000r/min，离心 5min ;
[0057] 10) 75%乙醇再重复清洗一次，弃上清后，短暂离心，吸出剩余乙醇；
[0058] 11)加入50 μ I RNase-free水溶解,得到葡萄叶片总RNA。
[0059] 实施例6 :提取葡萄叶片总RNA
[0060] 1)往I. 5ml RNase-free离心管中加入800 μ 1的实施例1制备的RNA提取液，力口 入50 μ 1疏基乙醇，混勾。
[0061] 2)取约IOOmg葡萄叶片于液氮中研磨成粉末，迅速转移至上述离心管中，震荡混 匀。
[0062] 3) 4°C，12000r/min，离心 15min ;
[0063] 4)取上清液（约500 μ I)，加入700 μ I TRIzol试剂，混匀，立即加入200 μ I氯仿， 剧烈混匀，室温放置2-3min ;
[0064] 5) 4°C，12000r/min，离心 15min ;
[0065] 6)取上清，加入2倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后，室温静置8min ;
[0066] 7) 11000r/min，4。〇，离心 IOmin ;
[0067] 8)加入约Iml 75%乙醇，上下颠倒，室温放置5min ;
[0068] 9) 4°C，12000r/min，离心 5min ;
[0069] 10) 75%乙醇再重复清洗一次，弃上清后，短暂离心，吸出剩余乙醇；
[0070] 11)加入50 μ I RNase-free水溶解,得到葡萄叶片总RNA。
[0071] 将实施例4所得的产物利用紫外分光光度计检测浓度和纯度（表1)，然后取 200-300ng RNA进行1. 2%琼脂糖电泳检测其完整性（图1)
[0072] 表1紫外分光光度计检测结果
【权利要求】
1. 一种多糖多酚植物组织总RNA提取方法，其特征在于：其步骤为： 1) 配制IOOmlRNA提取液：其中包含：50mM三羟甲基氨基甲烷；200mM氯化钠；IOmM乙 二胺四乙酸；1.5%-2%十二烷基硫酸钠；2%-4%聚乙烯吡咯烷酮，溶液pH = 8.0 ;再加入 〇. Iml焦碳酸二乙酯，磁力搅拌器上搅拌过夜，高压灭菌； 2) 往I. 5mlRNase-free离心管中加入400ii I-Iml的RNA提取液，加入终浓度为 1% -10%的巯基乙醇，混匀； 3) 取约IOOmg植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速转移至上述离心管中，震荡混匀； 4) 10000-12000r/min，冷冻离心 10-15min ; 5) 取上清液，加入700 iil-lml TRIzol试剂，混匀，立即加入200 ill氯仿或氯仿和异戊 醇的混合物，剧烈混匀，室温放置几分钟； 6) 10000-12000r/min，冷冻离心 10-15min ; 7) 取上清，加入等体积的异丙醇或2-2. 5倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀后，室温静 置 10-20min ; 8) 10000-12000r/min,冷冻离心 IOmin ; 9) 加入0. 5-lml 70% -75%的乙醇溶液，上下颠倒，室温放置2-15分钟； 10) 7500-12000r/min，冷冻离心； 11) 重复清洗一次，弃上清后，短暂离心，吸出剩余乙醇； 12) 加入适量RNase-free水溶解，得到葡萄叶片总RNA。
2. 根据权利要求1所述的一种多糖多酚植物组织总RNA提取方法，其特征在于：步骤 5)中，氯仿和异戊醇的质量比为24:1。
3. 根据权利要求1所述的一种多糖多酚植物组织总RNA提取方法，其特征在于：步骤 7)中，无水乙醇沉淀选择在_20°C冰箱中静置半小时。
【文档编号】C12N15/10GK104313015SQ201410549077
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】孙子奎, 高文学, 丁方美, 王 锋, 刘艳艳 申请人:上海派森诺生物科技有限公司