一种介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺，通过对单环刺螠体腔液冷冻离心、抽滤、真空冷冻干燥制得粗制品，进一步经过DEAE(二乙氨基乙醇)-Sepahcel(纤维素葡聚糖凝胶)阴离子交换层析和Sephadex(羟丙基葡聚糖凝胶)G-75层析、Benzamidine(苯甲脒)-Sepharose(琼脂糖凝胶)层析、冷冻干燥后经进一步测定证实为纤溶酶，后在大鼠脑颈内动脉栓塞模型上通过介入溶栓实验证实，单环刺螠纤溶酶具备完全溶解血栓的能力、无过敏等副作用。
【专利说明】一种介入溶血栓生物制品单环刺媪纤溶酶的制备工艺
【技术领域】
:
[0001]本发明涉及一种介入溶血栓生物制品单环刺縊纤溶酶的制备工艺，该生物制品，可以用于血栓性疾病的基础研究以及临床应用。
【背景技术】
:
[0002]血栓性疾病是因为血栓形成后直接或脱落后完全或部分阻塞血管、造成器官组织缺血坏死，是严重危害人类健康的一种循环系统疾病，已经占据全球疾病总死亡率的第一位，常表现急性心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓、肺动脉栓塞。目前，临床上血栓性疾病的主要治疗药物有抗血小板类药物、抗凝血药、溶血栓药物，后者是目前临床应用最广泛的治疗手段。溶血栓药又称为纤维蛋白溶解药，可激活纤溶酶而促进溶解血栓。第一代溶血栓药链激酶(SK)和尿激酶为代表。但其对纤维蛋白特异性差，主要不良反应是引起机体广泛出血，尤其是发生颅内出血的危险性很大，并发生再栓塞，它常常引起发热反应和其它如过敏反应等问题，抗原性强会产生大量的链激酶抗体。尿激酶也具有这些问题。第二代溶血栓药主要指组织型纤溶酶原激活物Gnt-PA)等，t-PA又称为阿替普酶，与纤维蛋白有较好的亲和性而具有较强的血栓选择性，全身纤溶作用小，副作用小，然而其半衰期短(3分钟)，需短时间内大量给药,价格昂贵,而且有弓I起颅内出血的危险性。Sak在溶血栓速率和对纤溶酶原的保护方面均优于t-PA，但它有显著的免疫原性，不能重复使用。目前国际研发力量正在致力于应用蛋白质工程手段开发第三代溶血栓剂(如蚓激酶)等。蚓激酶是从特种蚯蚓中提取或分子重组的一类物质，兼有激酶和纤溶酶两种作用，对多种血栓疾病有较好的疗效，如治疗冠心病心绞痛、急性脑梗死、突发性耳聋、肾病综合征等多种疾病，但大多蚓激酶产品是非单一组分，并存在过敏等副作用。其他的第三代溶血栓药(瑞替普酶、降纤酶等)仍然存在着体内半衰期短、稳定性差、特异性和安全性有待进一步提高等问题。另外，这三代药物的共同问题是不能完全溶解新鲜和陈旧性血栓，即使介入溶栓也无法完全溶解血栓。因此，研发出血栓靶向性强而不易引起颅内出血等全身出血并发症、能够完全溶解血栓、免疫原性低的溶血栓药物和治疗措施是当务之急。本发明所研发的单环刺縊纤溶酶通过介入溶栓方法证实具备完全溶解血栓的能力、无过敏等副作用。
【发明内容】
:
[0003]本发明提供了介入溶血栓生物制品单环刺縊纤溶酶的制备工艺，包括以下步骤:
[0004](I)取鲜活单环刺縊，收集其体腔液，将温度控制在-20°C -4°C之间、离心力控制在2000g-10000g之间进行冷冻离心30-35分钟，抽滤30-40分钟去除8KD(道尔顿)以上脂类不溶物，用PBS磷酸盐缓冲液透析8-10小时，真空冷冻干燥得到粗制品；
[0005](2)将粗制品溶解在50mM、pH 7.8的碳酸氢铵缓冲液中，将温度控制在_20°C -4°C之间、离心力控制在2000g-10000g之间进行冷冻离心30-35分钟，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的1.7cmX 15cm的DEAE-Sepahcel阴离子交换柱、并用50_800mM NaCl进行梯度洗脱、经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A5、A6，合并为A56备用；
[0006](3)将上述备用样品A56溶解在50mM、pH7.8的碳酸氢铵缓冲液，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的S^hadex G-75凝胶过滤层析柱，利用注射用水洗脱，经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A56-3备用；
[0007](4)将上述备用样品A56-3溶解在50mM Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸)、400mM NaCl、ρΗ7.4 的缓冲液中，注入经 50mM Tris-HCl、400mM NaCl, ρΗ7.4 缓冲液平衡的Benzamidine-SepharoseTM 4Fast Flow(苯甲脒琼脂糖凝胶)层析柱中，利用10mMglycine-HCl (甘氨酸-盐酸)、pH3.0缓冲液进行洗脱，3ml/管的洗脱液含有0.5mL0.5MTris-HCl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸)、pH9.0的缓冲液，经过纤维蛋白平板法测定的活性得到活性最高的部分就是单环刺縊纤溶酶A56-3-2。
【专利附图】
【附图说明】
:
[0008]图1为DEAE-S印hacel阴离子交换层析纯化单环刺縊纤溶酶粗制品A5、A6活性最闻。
[0009]图2为S印hadex G_75凝胶过滤层析纯化单环刺縊纤溶酶流份A56-3活性最高。
[0010]图3为Benzamidine-Sepharose亲和层析纯化单环刺婦纤溶酶流份A56-3-2活性最闻。
[0011]图4为RP-HPLC测定单环刺縊纤溶酶纯度纯化后的单环刺縊纤溶酶样品在99%以上。
[0012]图5为单环刺縊纤溶酶(UFE)对大鼠颈内动脉血栓模型的溶解效果在脑梗塞模型建立2小时之后施入同剂量的UFE、阿替普酶(tPA)、尿激酶、相同体积的生理盐水，于22小时进行TTC染色。
【具体实施方式】
:
[0013]以下所列实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明。
[0014](I)本发明中粗制品制备过程为，鲜活单环刺縊经无菌海水过夜培养以排净体内杂物，解剖收集体腔液，4°C下2000g冷冻离心30分钟，上清液经过400目絹布、3层滤纸抽滤去除脂类不溶物，装透析袋4°C过夜除盐，检验除盐效果，真空冷冻干燥得粗制品。
[0015](2) DEAE-Sepahcel阴离子交换层析:粗制品溶解在50mM碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)，4°C下1000g冷冻离心10分钟，上清液注入经50mM碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)平衡的DEAE-Sepahcel阴离子交换柱(1.7cmX 15cm),并用溶解在相同缓冲液的50-800mM NaCl进行梯度洗脱，利用在线紫外分光光度计(280nm)检测和收集(3ml/管)，UV280吸收峰处收集的样品进行真空冷冻干燥(命名为Α1...η)，将经过纤维蛋白平板法测定的活性最高的Α5、Α6样品进行合并(命名Α56)，继续下游纯化。[图1]
[0016](3) Sephadex G-75凝胶过滤层析:将Α56样品溶解在50mM碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)，注入经50mM碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)平衡的S印hadex G-75凝胶过滤层析柱，利用注射用水洗脱，利用在线紫外分光光度计(280nm)检测和收集(3ml/管)，280nm吸收峰处收集的样品进行真空冷冻干燥(命名为Α56-1...η)，将经过纤维蛋白平板法测定的活性最高的A56-3样品继续下游纯化。[图2]
[0017](4)Benzamidine-Sepharose 亲和层析:A56-3 样品溶解在 5OmM Tris-HCl,400mM NaCl (pH7.4)缓冲液中，注入经 50mM Tris-HCl,400mM NaCl (pH 7.4)缓冲液平衡的Benzamidine-SepharoseTM 4Fast Flow 层析柱中，利用 10mM glycine-HCl (pH 3.0)缓冲液进行洗脱，洗脱液(3ml/管)含有0.5mL 0.5M Tris缓冲液(pH9.0)，将经过纤维蛋白平板法测定的活性最高的部分就是单环刺縊纤溶酶A56-3-2。[图3]
[0018](5)利用SDS-PAGE对单环刺縊纤溶酶A56_3_2的分子量、纯度、纤维蛋白进行靶点测定:非变性和变性SDS-PAGE(4%浓缩胶，12%分离胶)电泳方法参照Laemmli方法(Laemmli UK,Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacter1phage T4, Nature 227,680-685(1970))进行，电泳缓冲液为 25mM 三羟甲基氨基甲烷，192mM甘氨酸，0.1%十二烷基硫酸钠(pH8.3)。电泳结束后，考马斯亮蓝R-250染色[0.2% (W/V)，在乙酸:甲醇:水=1:5:5，V/V)]，美国 B1-Rad 公司 ChemoDoc MP 凝胶图像处理系统分析结果。经测定，分子量43kD，A56-3-2的纯度在99%以上，为Y型纤溶酶。
[0019](6)利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对单环刺縊纤溶酶A56_3_2进行测定纯度:将A56-3-2样品注入经0.1%三氟乙酸溶液平衡的C2/C18RP-HPLC柱(1.7cmX15cm)中，利用洗脱剂(0-100%乙腈，0.1%三氟乙酸)进行洗脱，流速为lml/min，监测在280nm处的吸光度，唯一峰在70%乙腈处，可以看出A56-3-2的纯度在99%以上。[图4]
[0020](7)活体溶栓和急性毒理学研究:大鼠颈内动脉(ICA)栓塞模型；①模型建立:参考文献[Eduardo Romanos 等.Uric acid reduces brain damage and improves thebenefits of rt_PA in a rat model of thromboembolic stroke.Journal of CerebralBlood Flow&Metabolism(2007) 27，14-20)]。简单地说，350_400g 的雄性大鼠在利用 1.5%氟烷(自主呼吸)麻醉，利用加热垫维持动物体温(37.4±0.40C )，动物仰卧，头偏左侧，在体视显微镜下在左侧股动脉置入24号弹性针头，连接ImL注射器抽取采集血样300 μ L血液，和75 μ L凝血酶的(30U/ml)快速混合后注入到I米长的PE-50管，15分钟后切成5cm段，利用注射器推出，生理盐水反复冲洗血栓，再利用PE-1O管反复通过5次，冲洗去除红细胞保留纤维蛋白结构而不易自行溶解，再切成长度为1.5mm的栓子，随后吸取5个栓子，通过近端ECA (颈外动脉)、CCA (颈总动脉)、ICA、MCA (大脑中动脉)置入21软针头并与PE-50聚乙烯管连接后结扎固定在近端ECA外围，开放CCA、ICA，于10秒钟内向MCA注入5个栓子，之后与PE-50聚乙烯管连接后结扎固定，通过观查动物的表现判断MCA梗塞模型是否建立成功:左侧肢体活动明显减少等。②单环刺縊纤溶酶施入:在2h之后，经PE-50聚乙烯管30分钟内连续泵入2.5 μ g(溶解在100 μ L生理盐水中)单环刺縊纤溶酶(UFE)(相同剂量的阿替普酶(tPA)、尿激酶(UK)、相同体积的生理盐水(NS)作为空白对照，每组6只动物)，于30分钟(之后停止麻醉)采血100 μ L以监测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原含量(FIB)。由于是局部用药，以上这些指标都未发生明显的改变。发现，生理盐水注射组的动物左侧肢体活动未见改善，尿激酶注射组的动物有2只左侧肢体活动明显改善，其余4只改善程度低；而单环刺縊纤溶酶注射组全部动物的左侧肢体活动明显改善。③急性毒理学研究:在注射药物之后22小时以内，观察动物无皮下出血和过敏、发热等改变。④脑梗塞和出血评估:在注射药物22小时之后，腹腔注射高剂量戍巴比妥钠(100mg/kg)处死动物,大脑迅速取出，自额极至小脑边缘每间隔2mm进行冠状位切片，所有切片在体视显微镜下观察有无出血改变。在2% 2，3，5_三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中浸泡30分钟，利用图像分析系统分析梗塞和出血面积。生理盐水注射组脑梗塞面积最大，无明显出血灶；尿激酶注射组的动物有2只梗塞面积小，其余4只梗塞面积大，3只动物的梗塞区有出血灶；而单环刺縊纤溶酶注射组全部动物的梗塞面积最小，并且梗塞区无出血灶。[图5]
【权利要求】
1.一种介入溶血栓生物制品单环刺縊纤溶酶的制备工艺，其特征在于: (1)取鲜活单环刺縊，收集其体腔液，将温度控制在-20°C-4°c之间、离心力控制在2000g-10000g之间进行冷冻离心30-35分钟，抽滤30-40分钟去除8KD (道尔顿)以上脂类不溶物，用PBS磷酸盐缓冲液透析8-10小时，真空冷冻干燥得到粗制品； (2)将粗制品溶解在50mM、pH7.8的碳酸氢铵缓冲液中，将温度控制在_20°C _4°C之间、离心力控制在2000g-10000g之间进行冷冻离心30-35分钟，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的1.7cmX 15cm的DEAE-S^ahcel阴离子交换柱、并用50_800mM NaCl进行梯度洗脱、经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A5、A6，合并为A56备用； (3)将上述备用样品A56溶解在50mM、pH7.8的碳酸氢铵缓冲液，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的Sephadex G_75凝胶过滤层析柱，利用注射用水洗脱，经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A56-3备用； (4)将上述备用样品A56-3溶解在50mMTris-HCl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸)、400mM NaCl、pH = 7.4 的缓冲液中，注入经 50mM Tris-HCl、400mM NaCl、pH 7.4 缓冲液平衡的Benzami dine-SepharoseTM 4Fast Flow(苯甲脒琼脂糖凝胶)层析柱中，利用10mMglycine-HCl (甘氨酸-盐酸)、pH3.0缓冲液进行洗脱，3ml/管的洗脱液含有0.5mL 0.5MTris-HCl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸)、pH9.0的缓冲液，经过纤维蛋白平板法测定的活性得到活性最高的部分就是单环刺縊纤溶酶A56-3-2。
【文档编号】C12N9/68GK104404019SQ201410628153
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】陈良海 申请人:陈良海