专利名称：提高催化剂催化效能的微孔凝胶颗粒固定化细胞的方法
ft术领域 提高催化剂催化效能的微孔凝胶颗粒同定化细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高催化剂中传质效率和胞内酶活性等催化效能的微孔凝胶颗粒固定化 细胞的制备方法。
背景技术：
PVA能形成良好的凝胶，常用于细胞包埋固定化，其应用中常用的有PVA冷冻法，PVA 化学交联法，PVA辐射交联法，国内外在这些方面有大量报道。PVA化学交联法和PVA辐 射交联法或是容易开联，或是对细胞有毒性而在实际应用时受到一定限制。本发明是PVA应 用的物理方法，即PVA冷冻法，凝胶成型利用PVA在0。C -4(TC冷冻适当的时间PVA链间 的氢键和微晶区形成三维网络，从而形成物理交联的PVA水凝胶，且该凝胶具有一定的力学 强度，常温下在水中只会溶胀而不会溶解。
本发明中所用粘土有蒙脱石、凹凸棒等，其共同特征为具有纳米形态，比表面积较大， 吸附性能良好，化学反应活性良好，是优良的载体材料。
海藻酸钠固定化细胞因其操作简便、细胞毒性较小等优点而广泛应用。但其缺点是海藻 酸钙在磷酸缓冲液及中不稳定，脱钙使得结构松散而坍塌。本发明正是利用海藻酸钙凝胶对 磷酸盐溶液或其它钙离子络合剂化学侵蚀的敏感性，通过化学侵蚀将已固定化细胞的含海藻 酸钙凝胶中的海藻酸盐部分溶解，从而在原来的凝胶中形成空穴，达到致孔的目的，以提高 在用固定化细胞为催化剂进行生物催化反应时原料和产物的传输效率。
国内外凝胶固定化成型后的形状常为透镜状(传质较好，细胞载量低)及球状(粒径较 大，传质较差，细胞载量较低)。本发明最后成型的包埋了细胞的微孔凝胶为不规则细小颗粒。 制粒采用制药工艺中常用的湿法制粒，操作简单方便，易得。颗粒大小均匀，粒径可控，形 状为类圆形，干细胞载量可达50%，且传质性能有较大提高。
用CTAB对微生物细胞进行透性化处理是提高细胞用于生物催化反应时细胞催化能力的 有效方法。本发明在固定化了细胞后，又进行细胞的透性化，提高了胞内酶的活性。而常见 的细胞固定化是没有进行过透性化处理的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用PVA-粘土-海藻酸钠等材料制备微孔凝胶颗粒固定化细胞的方法，用以提高催化剂中传质效率和胞内酶活性等催化效能。广泛用于包埋各种细胞。 为了实现上述目的，本发明利用了PVA-粘土-海藻酸钠包埋细胞的方法，包括湿法制粒、
化学固化、物理固化、脱转致孔、CTAB透性化处理等五个主要步骤。即首先将一定量的湿 态细胞或干粉状细胞与适量的粘土混合，再加入适量的PVA水溶液和海藻酸钠溶液，制粒。 混合均匀后，将颗粒投入适当浓度的CaCl2溶液中。经过适当固化时间，取出颗粒洗涤后， 将表面吹干，立即冻融；解冻后的颗粒置于适当浓度的磷酸盐溶液或其它钙离子络合剂中脱 钙，再经洗涤即得包埋了细胞的微孔凝胶催化剂，最后通过透性化处理可进一步提高胞内酶 活性而增强催化效力。
利用本发明可获得不同粒径的微孔凝胶，且其颗粒及微孔分布较均匀，通透性、机械强 度、细胞载量均良好。经扫描电镜观察，利用本发明所得颗粒表面有PVA的网格状纤维。
利用本发明获得的微孔凝胶颗粒包埋的细胞在低温下能长期保存，在生物催化反应中能 长期反复使用。这将有利于生物催化技术在生物催化及生物转化工业领域中的广泛应用。 具体实施事例
实例一
将1g面包酵母与3g凹凸棒搅拌混合，再加入5%PVA水溶液2ml， 2%海藻酸钠溶液 2ml， 一边振荡一边搅拌，直至形成细小的颗粒，过筛，即得所要的颗粒。将颗粒投入20ml 4。/。Cacl2溶液中，轻轻搅拌，使其充分固化。5分钟后，过滤，并用纯化水洗涤两次。在温 和冷风条件下将颗粒表面吹干，随即放在-2(TC的冰柜中冷冻。18小时后，取出颗粒，在室 温下解冻1小时。如此反复2次即可。将解冻的颗粒投入15ml pH=7 1mol/L磷酸缓冲液中 在3CTC， 120rpm条件下振荡。4小时后，过滤，洗涤后即得包埋了细胞的微孔凝胶。最后 用0.5XCTAB 100ml进行透性化处理10min，以提高固定化细胞的酶活性,洗漆后，即得包 埋了透性4fc细胞的微孔凝胶颗粒，粒径500 700|jm。
实例二
将1g啤酒酵母与2.5g蒙脱石搅拌混合，再加入8%PVA水溶液2ml， 2%海藻酸钠溶液 2ml， 一边振荡一边搅拌，直至形成细小的颗粒，将颗粒投入20ml4y。Cacl2溶液中，轻轻搅 拌，使其充分固化。10分钟后，过滤，并用纯化水洗涤两次。在温和冷风条件下将颗粒表面 吹干，随即放在-2(TC的冰柜中冷冻。18小时后，取出颗粒，在室温下解冻1小时。如此反 复2次即可。将解冻的颗粒投入15ml 1mol/L磷酸缓冲液中在30°C， 120rpm条件下振荡。3小时后，过滤，洗涤后即得包埋了细胞的微孔凝胶。最后用O.1XCTAB100ml进行透性化处 理30min，以提高固定化细胞的酶活性，洗涤后，即得包埋了透性化细胞的微孔凝胶颗粒，粒 径700 900)jm。
权利要求
1、一种提高催化剂中传质效率和胞内酶活性等催化效能的微孔凝胶颗粒固定化细胞方法，其主要步骤为a)湿法制粒将一定量的细胞与适量的粘土混合，再加入适量的PVA水溶液和海藻酸钠溶液，搅拌，振荡，使之成为细小的颗粒。b)化学固化将颗粒投入适当浓度的CaCl2溶液中，经过适当的时间固化后，取出颗粒，洗涤；c)物理固化将洗涤后的颗粒表面吹干，随即冻融。再反复冻融；d)脱钙致孔将解冻后的颗粒置于适当浓度的磷酸缓冲液中，脱钙后经洗涤即得包埋了细胞的微孔凝胶颗粒。e)透性化将上述包埋了细胞的类球形颗粒，在十六烷基三甲基溴化胺溶液(CTAB)中，在4℃左右处理近10min，以使固定化细胞透性化。形成微孔凝胶颗粒固定化细胞的液体环境所述PVA水溶液在0.01％～15％(W/V)；所述海藻酸钠浓度在0.01％～6％(W/V)；所述CaCl2溶液浓度在0.1％～20％(W/V)；所述的磷酸缓冲液pH在4～10，浓度为0.1～1mol/L；透性化处理所用CTAB溶液为0.01％到5％；透性化时间为1～60分钟。
2、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a)中所述的细胞为酵母或其它真菌细 胞，或细菌和基因工程改造过的微生物细胞等，质量分数5% 50%;粘土为蒙托石和凹凸 棒等无机材料，其质量分数在1% 50%。
3、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b)中所述的颗粒粒径为50 3000|jm; 最佳状态为500 1000|jm，固化时间为10秒~60分钟。
4、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)中所述的冻融条件为-4(TC 0'C， 1 10次，每次1 24小时。
5、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d)中所述进行脱钙的作用时间为10分 钟 8小时。
6、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d)中利用海藻酸钙凝胶对磷酸盐溶液 或其它钙离子络合剂化学侵蚀的敏感性，通过化学侵蚀将已固定化细胞的含海藻酸钙凝胶中的海藻酸盐部分溶解，从而在原来的凝胶中形成空穴，以提高在用固定化细胞为催化剂进行 生物催化反应时原料和产物的传输效率。
7、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e)中，将已经用凝胶固定化后的细胞 用CTAB进行透性化处理，从而提高细胞内的酶活性、应用过程中原料和产物进出细胞的速 度。
8、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于经过要求1中所述的步骤从a)到d)后， 还可以用聚乙烯醇重新再包被所得到的颗粒，并再次冻融；最后再进行要求1中步骤e)所 述的用CTAB进行透性化处理。
全文摘要
一种采用PVA-粘土-海藻酸钠等材料制备微孔凝胶颗粒固定化细胞的方法，用以提高催化剂中传质效率和胞内酶活性等催化效能。制备凝胶的过程中，采用了制药工艺中常见的湿法制粒，可制得500μm～1000μm的颗粒；运用海藻酸钠-氯化钙法化学固定化细胞，PVA冻融法物理固定化细胞增加了颗粒的机械强度；在磷酸盐溶液或其它钙离子络合剂中化学侵蚀海藻酸钙从而脱钙致孔，提高了传质效率；再用CTAB透性化细胞，搞高胞内酶的活性。本发明制备过程中条件温和，对细胞活性无损害。制得的颗粒均匀，且细胞载量较高，泄漏率低于10％。
文档编号C12N11/04GK101532006SQ20081006945
公开日2009年9月16日 申请日期2008年3月12日 优先权日2008年3月12日
发明者于明安, 毅 侯, 飞 廖, 杨晓兰, 泉 赵, 巍 陆, 龚耿浩 申请人:重庆医科大学