专利名称：家蚕微孢子虫孢壁蛋白swp30基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种来自于家蚕微孢子虫的孢壁蛋白基因 SWP30。
背景技术：
微孢子虫(釘cro邻ori力's)隶属于原生生物界(尸ro"ste)、微孢子虫门(Mcro邵ora) (Levine and Corliss 1980)，近期研究表明微孢子虫在进化上与真菌有着紧密的亲缘关 系。微孢子虫近150个属1300余种，是专营细胞内寄生，具有抗性极强的孢子，通过极 管剌入宿主组织细胞后将其孢原质注入细胞，完成感染并大量增殖，最终破坏宿主组织。 它能广泛寄生感染无脊椎动物和脊椎动物，尤其是极具经济价值的昆虫、鱼类、啮齿类、 兔类、皮毛动物、灵长类以及家庭宠物如狗和鸟，引发疾病甚至死亡。其中家蚕微孢子虫 (Afese历a Zw/^/cA)，能经食下和胚种途径寄生于家蚕，引发严重的传染性微粒子病，最 终导致家蚕大规模死亡，给世界蚕业造成巨大的经济损失，成为近100年来影响蚕业生产 的难题。另外新发现，许多属的微孢子虫与人类疾病有关，如角膜病、角膜结膜炎、呼吸 疾病、前列腺肥大和扩散感染、肝炎、脑炎、痢疾、肌炎、胆管炎等等，甚至还能机会性 地感染艾滋病(AIDS)患者、器官移植病人、服用免疫抑制剂药物病人和先天性免疫机能 不健全者，引起呼吸系统、泌尿系统和皮肤溃烂等恶性疾病，加剧病情，加速病人的死亡。 对于微孢子的治疗已有报道，如烟曲霉素及它的衍生物抑制甲硫氨酸氨基肽酶2的活 性，阿苯达唑和苯丙咪唑能够抑制微管蛋白形成，它们被鉴定为治疗微孢子的有用药剂， 然而，对于治疗感染人类的多种微孢子仍没有找到有效、安全的药物。微孢子虫能够产生一种感染性的，能够抵制环境的孢子，孢子弹出内部极丝并将其内 含物接种到临近宿主细胞。孢子发芽机制一直吸引着微孢子虫研究者们。近年来的研究表 明，在微孢子虫受到外界刺激发芽之前，存在一个微孢子虫孢子与宿主细胞相互接触，以 提高宿主细胞感染率的过程，而微孢子虫的孢壁蛋白在此过程中起着与宿主细胞相互识别 和粘附的作用，如果抑制了微孢子虫孢子与宿主细胞的粘附作用，就可能降低了宿主细胞 的感染率甚至控制宿主细胞的感染，因此近年来微孢子虫孢壁蛋白已成为该领域的研究焦发明内容本发明基于蛋白质组学研究和基因组数据分析，克隆分析和免疫学鉴定家蚕微孢子虫 孢壁蛋白蛋白基因SWP30。通过对家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因的克隆，得到了孢壁蛋白 SWP30的编码序列，具体方法如下(1)引物设计根据蛋白质组学的方法以及家蚕微孢子虫的6倍基因组数据，获得孢壁蛋白SWP30编码序列，利用引物设计软件Primer 5.0进行引物设计，在正向引物加入BamHI酶切位点，在反向引物加入XhoI酶切位点。引物序列分别为 SWP30-primer-F: 5， GCGGATCCATGAATATTTTACTTGCTAC 3' SWP30-primer-R: 5'CCGCTCGAGGAAAGGAATGGTATTGTC 3' (2) NbSWP30基因PCR扩增由于微孢子虫基因组的高度简化特点，内含子很少，基因组序列数据显示SWP30基因不含内含子，故利用提取的微孢子基因组直接作为模板，采用基因组PCR扩增目的片段。SWP30基因长度为834 bp;(3) NbSWP30基因克隆NbSWP30扩增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)载体上， 然后进行序列测定，从而获得NbSWP30的全长编码序列；(4) 序列分析该序列与本发明申请人2000年登陆NCBI数据库的表面抗原P30.4 序列(登陆号Ai:2'15278. l.， GI: 7542623)相比，本次序列为一完整的基因，增加了 5，端 66核苷酸，这66核苷酸编码22个氨基酸残基，编码该蛋白的信号肽部分，决定着该蛋白 的分泌性表达。Protein SP/Lth ESTNCBITMD PredictedPredictedpI/MM HBM(Aa) homologue N-glycosy latphosphory la (kDa) numberion sites tion sitesSWP30 19/278 Yes AF245278 no Yes Yes 7.93/32.1 0(5) 蛋白的鉴定将克隆的SWP30基因进行原核表达，制备抗血清，利用免疫印迹、 间接荧光免疫实验和免疫电镜对SWP30蛋白进行鉴定。结果表明SWP30蛋白质在家蚕微 孢子虫孢壁上特异性表达，为孢壁蛋白。上述方法获得的NbSWP30基因编码序列及其推断的氨基酸序列如下 SWP30的序列1 atg组aUttacttgctacagctagttttgttttgtcattaggcttcgttaaagctgaa MNILLATASFVLSLGFVKAE61 cc88ctagacatcacgac卿t3tgcctatattgaaagggttgtatgtgacgtaaatttcPTRHHDRYAYIERVVCDVNF 121 cctgatcttttatgtcgcagaaaatctcatgctattgcttacagaatgttcagattaataPDLLCRRKSHAIAYRMFRLI 181 ccagttcgaaatcccaattatgaaatttcaacagattatgtgagtcatg肌tttaatactPVRNPNYEISTDYVSHEFNT 241 acgcgtgtcagaagtgaatccgagaaatacttgtgttcttctta.tggftccaaacggatacTRVRSESEKYLCSSYGPNGY 301 gtctcaggcgatgtttttatcttgcg肪atgctttaaataaacttttcgatcatcatgaaVSGDVFILRNALNKLFDHHE 361 atagaagaattggcatacgaactgtttataagattagtcgctagcttccttgattcttgtIEELAYELFIRLVASFLDSC 421 tcttatxct33atcttttg3gcacaatcttgtaagatgcag8tctgaagacgaagagctcSYPKSFEHNLVRCRSEDEELCTSPLAAFIKLVSRRSTRDV 541 gtccttatcgttttaaatgatttctcacattacctca肪cttgaagaaggacacggctttVLIVLNDFSHYULEEGHGF 601 tcgaaagacagaaaatcaaatcaatgcgtcaaatttactcaactttacttctactatcttSKDRKSNQCVKFTQLYFYYL 661 tcagccgcagtaaiictttattgaaagaaagatatctgcttttactttgatcccagtaatgSAAVNFIERKISAFTLIPVM 721 gatgatagaaggattgcctctgtttctgctatcatgatctcctctaagtttgcaaatacaDDRRIASVSAIMISSKFANT 781 actggaaattatgtcEittaacgcaacttctttcatggscaataccattcctttctaaTGNYVINATSFMDNTIPF本本发明的优点是序列分析结果显示孢壁蛋白SWP30基因是家蚕微孢子虫物种所特有的基因，实验证 明针对SWP30蛋白的抗体与其他蛋白无交叉反应，Pj以用于家蚕微孢子虫的免疫学检测， 为蚕业生产上微粒子病检测手段带来革命性的改变。
具体实施方式
-实施例根据蛋白质组学的方法以及家蚕微孢子虫的6倍基因组数据，通过基因组数据库以及一系列的克隆与亚克隆，获得了家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP30基因编码序列CDS,利用 引物设计软件Primer 5.0进行引物设计，在正向引物加入BamH 1酶切位点'在反向引物加入XhoI酶切位点，分别设计了如下引物SWP30-primer-F: 5， GCGGATCCATGAATATTTTACTTGCTAC 3，SWP30-primer-R: 5，CCGCTCGAGGAAAGGAATGGTATTGTC 3' 从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增SWP30基因编码序列，扩增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)载体上，然后进行序列测定，从而获得SWP30基因的全长编码序列。将SWP30 基因不含信号肽的序列克隆到原核表达载体pGEX-4Tl上进行诱导表达，纯化表达产物； 将纯化的表达产物作为抗原免疫小鼠制备抗血清；利用免疫学的手段可对SWP30蛋白和家 蚕微孢子虫进行鉴定、诊断。
权利要求
1、家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP30基因，其特征在于其序列如下ATGAATATTT TACTTGCTAC AGCTAGTTTT GTTTTGTCAT TAGGCTTCGT TAAAGCTGAA60CCAACTAGAC ATCACGACAG ATATGCCTAT ATTGAAAGGG TTGTATGTGA CGTAAATTTC120CCTGATCTTT TATGTCGCAG AAAATCTCAT GCTATTGCTT ACAGAATGTT CAGATTAATA180CCAGTTCGAA ATCCCAATTA TGAAATTTCA ACAGATTATG TGAGTCATGA ATTTAATACT240ACGCGTGTCA GAAGTGAATC CGAGAAATAC TTGTGTTCTT CTTATGGACC AAACGGATAC300GTCTCAGGCG ATGTTTTTAT CTTGCGAAAT GCTTTAAATA AACTTTTCGA TCATCATGAA360ATAGAAGAAT TGGCATACGA ACTGTTTATA AGATTAGTCG CTAGCTTCCT TGATTCTTGT420TCTTATCCTA AATCTTTTGA GCACAATCTT GTAAGATGCA GATCTGAAGA CGAAGAGCTC480TGCACCTCTC CTCTCGCAGC TTTCATCAAA CTTGTTTCTC GTCGTTCAAC CAGAGATGTT540GTCCTTATCG TTTTAAATGA TTTCTCACAT TACCTCAAAC TTGAAGAAGG ACACGGCTTT600TCGAAAGACA GAAAATCAAA TCAATGCGTC AAATTTACTC AACTTTACTT CTACTATCTT660TCAGCCGCAG TAAACTTTAT TGAAAGAAAG ATATCTGCTT TTACTTTGAT CCCAGTAATG720GATGATAGAA GGATTGCCTC TGTTTCTGCT ATCATGATCT CCTCTAAGTT TGCAAATACA780ACTGGAAATT ATGTCATTAA CGCAACTTCT TTCATGGACA ATACCATTCC TTTCTAA 837。
2、 家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP30基因编码的蛋白质，其特征在于其序列如下-MNILLATASF VLSLGFVKAE PTRHHDRYAY IERVVCDVNF PDLLCRRKSH AIAYRMFRLI 60PVRNPNYEIS TDYVSHEFNT TRVRSESEKY LCSSYGPNGY VSGDVFILRN ALNKLFDHHE 120IEELAYELFI RLVASFLDSC SYPKSFEHNL VRCRSEDEEL CTSPLAAFIK LVSRRSTRDV 180VLIVLNDFSH YLKLEEGHGF SKDRKSNQCV KFTQLYFYYL SAAVNFIERK ISAFTLIPVM 240DDRRIASVSA IMISSKFANT TGNYVINATS FMDNTIPF 278。
全文摘要
一种家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP30，依据蛋白质组学的方法和家蚕微孢子虫的6倍基因组数据，经过克隆与亚克隆得到了编码家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP30编码序列，并经一系列生物技术克隆以及免疫学手段证实。本发明所获得的家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP30基因为家蚕微孢子虫物种所特有，为诊断、防治家蚕微粒子病提供有力手段；免疫学实验表明针对NbSWP25蛋白的抗体与其他蛋白无交叉反应。该基因可用于家蚕微孢子虫病的分子生物学、免疫学检测，为蚕业生产上微粒子病的检测带来革命性的改变。
文档编号C12N15/30GK101250537SQ20081006941
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月3日 优先权日2008年3月3日
发明者向仲怀, 周泽扬, 潘国庆, 蓝希钳 申请人:西南大学