专利名称：用于制备人重组胰岛素的方法
用于制备人重组胰岛素的方法本发明涉及生物技术学、基因工程和医学并且可被用于药物生产，特别是用于制造治疗糖尿病的药物。胰岛素是由通过3个二硫键(1个链间键(A6-A11)和2个链内键(A7-B7和A2tl-B19)) 连接的21个残基的酸性A链和30个氨基酸的碱性B链[1]组成的蛋白质激素。虽然可成功地在体外重组胰岛素的分开的A链和B链[2]，但在体内通常合成单链多肽(前胰岛素原)。其含有B链N末端处的信号肽和A链与B链之间的C肽。在于内质网中切割N末端信号序列后，所产生的多肽折叠并且作为胰岛素原被包装到分泌颗粒中[3]。由一组特定的蛋白酶进一步加工后，胰岛素原然后被转化为胰岛素并且被分泌到血流中以调节糖水平。在商业上，已通过转肽作用产生了人胰岛素，其中用苏氨酸替代了猪胰岛素的B 链第30个位置处的丙氨酸残基[4]。由于从猪胰岛素产生人胰岛素受到其高成本的限制， 最近的研究已主要集中在通过基因工程技术生产人胰岛素的方法。已利用了 3个主要的方法使用微生物进行胰岛素的生产。其中两个方法涉及大肠杆菌(Escherichia coli)，其中胰岛素前体作为更大的融合蛋白的一部分被表达在细胞质中(主要以包涵体的形式)，或者被分泌到周质空间中[5]。第三种方法利用酵母，并且胰岛素前体被分泌到周围的培养基中[6]或形成不溶性包涵体[7]。通过基因工程方式制备人胰岛素的方法包括下列步骤在大肠杆菌中以融合蛋白的形式产生胰岛素原，将融合蛋白重折叠以形成正确的二硫键；用胰蛋白酶和羧肽酶B处理重折叠的多肽；纯化生成物以获得胰岛素。该方法的变型也利用了融合蛋白的磺化作用和溴化氰切割来获得作为胰岛素生产的中间产物的胰岛素原[8]。此外，基因操作使得能够产生在重组蛋白的胰岛素原和/或C肽部分中具有不同氨基酸含量的的融合蛋白。这些操作被引向增加正确折叠的胰岛素原(前胰岛素原)的产率。然而，具有正确二硫键的重折叠的胰岛素原的产率随着重折叠缓冲液中胰岛素原的浓度增加而降低。这是由于错折叠和一定程度的聚合。因此，重折叠是胰岛素生产过程中的关键步骤。此外，在胰岛素生产的随后步骤中胰岛素的纯化是非常费力的并且通常是高成本的。总之，开发人胰岛素生产的新方法不仅有益于终产品的质量而且还节约资源并为消费者降低产品价格。重组人胰岛素生产的公开方法包括包含编码胰岛素原的重组DNA的质粒构建 [9]、产生杂合多肽的大肠杆菌菌株的开发和培养、细胞的分离和破碎、杂合多肽的回收和酶促切割，继而分离所需的产物。然而，该方法只利用大肠杆菌菌株BL21/pIK8-胰岛素原，其携带单一的质粒DNA PIK8-胰岛素原，因而限制许多宿主/表达载体组合。此外，该方法包括在酶促切割之前用柠康酐处理杂合多肽，这加入了额外的纯化步骤并且降低了所需产物的产率。本发明的目标在于开发重组人胰岛素生产的方法，该方法保证增加杂合多肽的产率和制造具有高质量的所需产品。该方法的主要结果是由于某些制造步骤的简化和消除、终产物产率的数量增加和改善的终产物质量而改进技术的有效性。所有这些益处均归因于表达载体数量的增加、前肽氨基酸序列的优化、重折叠方法的优化和细胞破碎、包涵体洗涤、蛋白质回收及纯化方法的精进。所声明的一系列特征与所达到的技术效果之间存在密切的因果关系。本发明涉及用于通过培养用编码重组人胰岛素多肽的DNA序列转化的原核宿主而产生重组人胰岛素的改进的方法。在大肠杆菌中合成了包含连接于胰岛素原的前导序列的重组杂合多肽。通过用胰蛋白酶和羧肽酶B处理正确折叠的杂合多肽，以及随后的纯化来产生人胰岛素。根据本发明，可以以良好的重现性制造人重组胰岛素，而蛋白质回收和纯化步骤被显著改善了。新的质粒DNA构建体的开发使我们能够扩大所使用的微生物菌株的种类并优化前肽的氨基酸组成。本方法中所提出的介由利用快速流动高容量树脂的吸附层析而浓缩杂合多肽的有效技术允许我们显著提高该方法的生产率。此外，所提出的方法不存在在酶促切割之前利用柠康酐步骤封闭氨基。为了使脱苏氨酸的形成最小化，在高PH值时进行胰蛋白酶解，因而增加终产物的产率并且省略与 citraconilation相关联的额外纯化步骤。此外，优化了胰岛素纯化的方法。其包括离子交换层析和反相高效液相色谱，这允许产生98-99 %的纯度的胰岛素。因此，在付之以开发新的表达载体、改进细胞破碎和包涵体洗涤方法、优化重折叠和利用吸附层析进行蛋白质浓缩、不使用citraconilation以及在高pH值下进行胰蛋白酶解以使脱苏氨酸的形成最小化后，解决了被搁置的问题。除了所报导的之前的质粒DNA(ρΙΚ8-胰岛素原)外，本发明呈现了具有一些益处的新质粒-缩短的C肽(质粒pMUT12、pISYN2、pCIM61、pDIM07)。作为该修饰的结果，终产物的产率增加了。胰岛素在PIK8-胰岛素原表达载体中产生47 %的杂合多肽，当使用pMUT12 或pISYN2质粒时产生68%的杂合多肽，在使用pCIM61或pDIM07质粒的情况下产生82% 的杂合多肽。-编码由前肽序列的差异而不同的杂合多肽的新质粒。经验性地选择前肽的氨基酸组成来改变杂合多肽的电荷(和适当时等电点)，因而允许使用不同的方法进行蛋白质纯化。考虑了大肠杆菌密码子的使用频率而化学合成编码杂合多肽的DNA(pISYN2质粒)，与包含具有原始密码子的人胰岛素原cDNA的相似表达载体相比，这使杂合多肽的产率增加40%。本发明利用非常有效的高压细胞破碎技术(细胞破碎效率超过99% )，而当使用公知的超声处理方法时细胞破碎的效率为40至50%左右。此外，该方法是节约成本的、高产的并且产生质量更好的终产物(包涵体)。此外，用于重折叠的杂合多肽的制备不包括亚硫酸分解步骤(该步骤通常降低终产物的产率并且增加生产成本)。所提出的还原的多肽的直接重折叠方法被大大简化并且其使得可能以0. 5-1. Omg/ml的蛋白质浓度进行重折叠，而磺化多肽的还原需要低于 0. lmg/ml的多肽浓度。这样，蛋白质复性所需的重折叠缓冲液的体积大大减小了。
通过下列附图进一步阐释本发明
图1是质粒DNA pIK8-胰岛素原的示意图，显示了胰岛素前体的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。图2是质粒DNA pMUT12的示意图，显示了胰岛素前体的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。图3是质粒DNA pISYN2的示意图，显示了胰岛素前体的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。图4是质粒DNA pCIM61的示意图，显示了胰岛素前体的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。图5是质粒DNA pDIM07的示意图，显示了胰岛素前体的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。图6描绘了人胰岛素的一级结构。本发明基于克隆编码人胰岛素前体的重组DNA，所述人胰岛素前体作为包涵体在大肠杆菌宿主细胞中被表达，随后回收重组多肽并且在允许半胱氨酸残基之间形成正确的二硫键的条件下复性。进一步酶促切割和纯化重组多肽。用于产生杂合多肽的方法包括下列步骤a)用编码在重组多肽的内部具有胰蛋白酶切割位点的人胰岛素前体的重组DNA 转化大肠杆菌菌株；b)在允许重组DNA表达和包涵体产生的条件下培养经转化的宿主细胞；c)细胞破碎和回收所表达的多肽；d)在变性剂和还原剂存在的情况下溶解重组多肽，然后使其重折叠；e)利用胰蛋白酶和羧肽酶B酶促切割杂合多肽以产生胰岛素；f)胰岛素的分离和纯化。本发明的主要目的是在根据本发明介由构建编码胰岛素原的重组质粒DNA，产生和培养产生杂合多肽的大肠杆菌菌株，分离和破碎细胞以及分离多肽，对其进行酶促转化，然后纯化和分离所需的产物而产生重组人胰岛素的方法中，编码包含人胰岛素原的氨基酸序列的杂合多肽的重组质粒DNA片段为表达载体pIK8-胰岛素原、或pMUT12、或 PISYN2、或pCIM61、或pDIM07的一部分或与前述DNA插入物之一杂交并且在表达时编码人胰岛素原前体，从而编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为PIK8-胰岛素原质粒的一部分的重组质粒DNA片段包含下列序列1......... ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCA
T1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S..H. 61........ATGCGCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGT
G21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L..V..121....... TGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCT .V. . G. . 0. . V. . R. . I,. . G. . G. . G. . P. . G. . Α. . G. . S. . I,. . 0. . P. . I,. . Α..L..241....... GAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCT
C「00441 41.
C. . G. . R. . R. . G. . F. . F. . Y. . Τ. . P. . K. . Τ. . R. . R. . R. . Α. . R. . D. . I,81.........Ε. . G. . S. . L. . Q. . K. . R. . G. . I. . V. . Ε. . Q. . C. . C. . Τ. . S. . I. . C. . S..L..301.......TACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG101........Y. . Q. . L. . Ε. . N. . Y. . C. . N..女· ·编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为pMUT12质粒的一部分的重组质粒 DNA片段包含下列序列1......... ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCA
T1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S..H.61........ATGCGCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGT
G21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L..V..121....... TGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATG
C41.........C. . G. . Ε. . R. . G. . F. . F. . Y. . Τ. . P. . K. . Τ. . K. . R. . G. . I. . V. . Ε. . Q..C..181....... TGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG61.........C. . Τ. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . Ε. . N. . Y. . C. . N..女编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为pISYN2质粒的一部分的重组质粒 DNA片段包含下列序列 1.........ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCA
T1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S..H.61........ATGCGCTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCTGGTGGAAGCGCTGTATTTAGT
G21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L..
121....... TGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAACGTGGCATTGTGGAACAGTG
T41.........C. . G. . E. . R. . G. . F. . F. . Y. . T. . P. . K. . T. . K. . R. . G. . I. . V. . E. . Q..C..181.......TGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTACTGCAACTAA61.........C. . T. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . E. . N. . Y. . C. . N..女编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为pCIM61质粒的一部分的重组质粒 DNA片段包含下列序列1......... ATGCGAAAGAAGCGGAAGAAGAAGCGTTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCT
G1..........M. . R. . K. . K. . R. . K. . K. . K. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H..L.61........GTGGAAGCGCTGTATTTAGTGTGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAA
A21.........V. . E. . A. . L. . Y. . L. . V. . C. . G. . E. . R. . G. . F. . F. . Y. . T. . P. . K. . T..K..121....... CGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTA
C41.........R. . G. . I. . V. . E. . Q. . C. . C. . T. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . E. . N..Y..181.......TGCAACTAA61.........C. . N..女· ·编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为pDIM07质粒的一部分的重组质粒 DNA片段包含下列序列1......... ATGGATGAAGACGAGGATGAAGCACGCTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCT
G1..........M. . D. . E. . D. . E. . D. . E. . A. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H..L. 61........GTGGAAGCGCTGTATTTAGTGTGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAA
A21.........V. . E. . A. . L. . Y. . L. . V. . C. . G. . E. . R. . G. . F. . F. . Y. . T. . P. . K. . T..K..121....... CGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTA
C41.........R. . G. . I. . V. . E. . Q. . C. . C. . T. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . E. . N..Y..181.......TGCAACTAA61.........C. . N..女· ·大肠杆菌菌株的开发利用包含编码一种或数种重组多肽的核苷酸序列的表达载体，此处所述编码一种或数种重组多肽的核苷酸序列的转录被置于可诱导的表达系统的控制之下，然后进行对经转化的大肠杆菌菌株的培养，随后诱导表达以允许重组多肽在宿主细胞中合成，并回收所产生的重组多肽。通过破碎细菌细胞或其片段的细胞壁，将细胞内沉淀物与裂解物分开，用非离子性去污剂洗涤细胞内沉淀物来进行包涵体回收，其进一步转化包括将沉淀物溶解在含有变性剂的缓冲液中，用还原剂处理杂合多肽，使杂合多肽重折叠以及介由吸附层析或超滤浓缩杂合多肽。通过用胰蛋白酶和羧肽酶B同时处理或通过用这两种酶分开处理进行胰岛素前体的蛋白水解转化，优选使用离子交换层析和/或高效液相色谱纯化所得产物。如进一步所描述的进行所述方法。在本发明中可利用各种允许人胰岛素的最佳生产的宿主/表达载体组合。例如， 有用的表达载体可由下述组成启动子、翻译起始信号、人胰岛素原cDNA(具有或不具有引入到C肽序列中的修饰)以及通过胰蛋白酶切割位点与胰岛素原分隔的任选的前肽。本发明的优选重组DNA分子是含有如上所述的DNA插入物的质粒。本发明的优选质粒包括 PIK8-胰岛素原、pMUT 12, piSYN2及其衍生物。本发明中还包括的是制造重组DNA分子的方法。该方法包括提供相应于为胰岛素的多肽的全部、部分、类似物、同源物或前体的DNA插入物和将该DNA插入物引入克隆载体中。优选地，将所述DNA序列与表达控制序列一起以正确的阅读框引入克隆载体中。在本发明的其他实施方案中，用至少一种能够表达人胰岛素的全部、部分或前体或具有与胰岛素相似的免疫原性或生物活性的多肽的重组DNA分子转化宿主细胞。有用的表达宿主包括公知的原核宿主例如大肠杆菌的菌株，包括但不限于下列菌株大肠杆菌HB101、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2^2、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌JM103、大肠杆菌BL21。通常将细菌宿主细胞培养在液体生长培养基中以在适合于宿主细胞和表达载体的条件下产生胰岛素前体多肽。优选地，将宿主细胞培养在细菌发酵罐中以使生产最大化， 但任何方便的培养方法都是可接受的(例如，摇瓶，特别是对于体积小于1升的培养物)。 确切的生长条件、培养基补充的时间安排和速率、培养基PH、温度和溶解氧水平以及诱导剂的添加(适当时)根据宿主细胞和表达构建体的特性而变化。在将细菌宿主细胞培养至所需的密度并完成了任何表达必需的诱导后，收集细胞。通常通过离心生长培养基来进行收集，虽然可使用任何其他方便的技术如超滤。此时， 可根据本发明立即处理所收集的细菌宿主细胞，或可将其冷冻用于日后处理。然后裂解细胞浆的细胞以释放包含胰岛素前体多肽的包涵体。使用约0. OlM至 2M的量级的离子强度，将细胞悬浮在约pH 6.0至9.0的缓冲液中。任何适当的盐(包括 NaCl)可被用于维持适当的离子强度水平。优选地，在下列条件下裂解细胞其中充分破碎细胞碎片使得其在低速离心下不出现在沉淀物中。通过常用技术例如机械方法(例如冷冻/解冻循环、使用微射流均质机、弗氏压碎器或超声振荡器)或利用酶促方法(例如用溶菌酶处理)来裂解细胞。通常推荐在降低的温度(即，低于约20°C)的条件下进行细胞裂解。
使用任何方便的技术(例如离心)从裂解的细胞浆中收集包涵体，如果需要，然后进行洗涤。通常通过将包涵体重悬在加入了去污剂(例如Triton X-100)的缓冲液中来洗涤包涵体，然后重新收集所述包涵体。随后将经洗涤的包涵体溶解在溶解缓冲液中，该缓冲液包含高浓度的离液剂(例如尿素或盐酸胍)、还原剂和任选的PH。尿素在溶解缓冲液中的浓度为6M至8M，优选7M并且盐酸胍浓度为5至7M，优选 6M。溶解缓冲液的PH范围为7. 5至11.0，优选8. 5至9.0。可使用任何pH缓冲剂(例如Tris、HEPES、MOPS、三(羟甲基)甲基甘氨酸等)。以提供有效pH缓冲的浓度(例如10 至约IOOmM,优选20mM)将pH缓冲剂加入溶解缓冲液中。所述溶解缓冲液中包括还原剂以还原二硫键并且以其还原形式维持半胱氨酸残基。有用的还原剂包括β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等。β-巯基乙醇的任选浓度为20至 200mM，优选 100 至 150mM。所述溶解缓冲液任选地包含另外的组分例如阳离子螯合剂如EDTA。将EDTA以约 0. 5至约5mM的浓度，优选以ImM至约2mM的浓度加入到溶解缓冲液中。此外，可加入甘氨酸(或其他氨基酸)以减少或消除自由基介导的蛋白质损害。甘氨酸的浓度范围为5至 IOOmM,优选 10 至 20mM。通常在约6小时至约M小时，优选约8小时的时期内进行包涵体的溶解。可在环境温度或降低的温度下(通常在约4°C至约M°C，优选在约20°C下)进行溶解。在包涵体溶解完成后，澄清经还原的多肽溶液以除去不溶性碎片。可通过使用高速离心来进行澄清。然后用重折叠缓冲液迅速稀释还原的胰岛素原前体。通过将包涵体溶液加入重折叠缓冲液中或通过将重折叠缓冲液和包涵体溶液同时递送入重折叠容器中来进行稀释。可用重折叠缓冲液将包涵体溶液稀释约10至约200倍，最优选100倍。稀释后最终的蛋白质浓度可以为约0. 01mg/ml至约5mg/ml，优选约lmg/ml。重折叠缓冲液通常包含pH缓冲剂、二硫化物改组氧化还原系统、二价阳离子螯合剂、自由基清除剂和一些其他低分子量添加剂。在约4°C至约的温度，优选在约10°C下进行重折叠过程。孵育时间通常为约2小时至约20小时，优选约6小时。重折叠缓冲液的主要组分包括浓度为约ImM至IOOmM,优选IOmM的甘氨酸；浓度为约0. 5mM至20mM的胱氨酸；约0. ImM至5mM的EDTA ；约至20%的甘油。在重折叠反应后，可浓缩经恰当重折叠的胰岛素前体，将其进一步纯化，并且可对蛋白质进行蛋白水解处理(例如，利用胰蛋白酶和羧肽酶B)以产生成熟的胰岛素。可使用任何方便的技术(例如超滤或层析(例如，离子交换层析、疏水相互作用层析或亲和层析) 等)实现重折叠的蛋白质的浓缩。如果需要，浓缩步骤还可包括缓冲液交换过程。优选在降低的温度(例如，约4至10°C )下进行浓缩。通过用胰蛋白酶和羧肽酶B同时处理或通过用这两种酶分开处理来进行胰岛素前体的蛋白水解转化。以1 200至约1 20，000(酶底物，重量重量)的比率使用胰蛋白酶，而以1 100至约1 5，000的比率使用羧肽酶B。在具有pH 7. 5至约11.0，优选pH 10. 5的缓冲液中进行蛋白水解转化；Ca2+、Zn2\ Mn2+、Mg2+的添加可有利于所述反应。 孵育温度的范围为0°C至约30°C，优选为约60C，孵育时间为1至M小时，优选约14小时。在蛋白水解转化后，纯化具有生物活性的胰岛素。
下列实施例阐释了本发明。应当理解，这些实施例仅用于阐释的目的而不应当被认为以任何方式限制本发明。实施例1.质粒DIK8-胰岛素原的构建使用聚合酶链式反应(PCR)技术以及引物Pl和P2从人胰腺单链cDNA扩增人胰岛素cDNA 引物Pl (正向引物)5，-GC ICATATGI CGATTTGTGAACCAACACCTGTG-3，引物P2(反向引物)5 ’ -TG |GAATTC| CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGC-3 ’引物Pl被设计为编码始于人前胰岛素原的Arf2的人胰岛素B链片段和用于克隆目的的NdeI位点(加框的)。反向引物(P2)与胰岛素A链的氨基端及用于克隆目的EcoRI 位点(加框的)互补。PCR反应包含各25pmole的寡聚引物、IXPCR缓冲液、各200 μ M浓度的4种核苷酸(dA、dC、dG和dT)、2ng单链cDNA、5. 0单位的Taq聚合酶。PCR反应的条件为95°C下进行3分钟，35个循环(95°C下进行1分钟；65 °C下进行30秒；72 °C下进行30 秒)，然后在72°C下进行5分钟。凝胶纯化约^Obp的PCR产物，将其克隆到pTA克隆载体中。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株DH5 α中，并且在含有氨苄青霉素的LB板上选择转化体。将数个菌落在LB培养基中培养过夜，使用Wizard小量制备DNA分离试剂盒分离质粒DNA。克隆IK8被测定具有正确的DNA序列。为了在大肠杆菌中表达，用NdeI和EcoRI消化从克隆IK8分离的质粒DNA，凝胶纯化约270bp的片段，将其克隆到已用相同的酶降解、并且经牛小肠碱性磷酸酶处理的质粒 pET28a中。将连接混合物转化到大肠杆菌DH5 α中，并在LB卡那霉素板上选择转化体。从数个转化体分离质粒DNA，并且通过用NdeI和EcoRI消化来进行筛选。鉴定出正确的克隆， 将其命名为ρΙΚ8-胰岛素原。将该质粒进一步转化到大肠杆菌菌株如JM109或BL21中。实施例2.质粒PMUT12的构建在使用PCR和下列引物进行的定点诱变中将质粒DNA ρΙΚ8_胰岛素原用作模板Ml :5，-CTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTG-3，Μ2 :5’ -CAGCATTGTTCCACAATGCCACGCTTGGTCTTGGGTGTGTAGAAG-3，在于96°C变性3分钟后，使用5U rTth DNA聚合酶进行30个PCR循环。PCR条件如下94°C，30秒；59°C，30秒；72°C，6分钟以及在72°C下最终延伸10分钟。利用Zymoclean PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并且用IOU的DpnI进行降解-以除去原始模板。在进行另一轮柱纯化后，将2mkl的等分转化到大肠杆菌菌株DH5 α中，并在含有卡那霉素的LB板上选择转化体。将数个克隆在LB培养基中培养过夜，并且使用Wizard小量制备DNA分离试剂盒分离质粒DNA。克隆MUT12被测定具有正确的DNA序列。为了在大肠杆菌中表达，将该质粒进一步转化到大肠杆菌菌株如JM109或BL21中。实施例3质粒pISYN2的构建
为了构建PCSYN61，我们首先利用报导的人胰岛素氨基酸序列[10]合成了 5个寡脱氧核苷酸。在这些合成中，我们考虑了大肠杆菌的高度表达基因中的密码子使用[11]和大肠杆菌tRNA的丰度[12]。我们还在沿着我们的寡核苷酸序列的各种位置处包括了用于克隆目的的内切核酸酶识别位点。引物序列Sl :5，-CATATGCGCTTTGTGAACCAG-3，S2 5 ’-AAGCCACGCTCGCCGCACACTAAATACAGCGCTTCCACCAGGTGGCTGCCACACAGATGCTGG TTCACAAAGCGCATATG-3’S3 5 ’-CGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAACGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCAC CAGTATTTGTAGCCTGT-3'S4 5 ’-CAGGCGTGAATTCTTAGTTGCAGTAATTTTCCAGCTGATACAGGCTACAAATACTGGTGC-3’S5 :5， -CAGGCGTGAATTCTTAGTTGC-3，将PCR缓冲液中的引物Sl、S2、S3、S4 (各自终浓度2mkm)与5U的rTth聚合酶的混合物加热至94°C 1分钟，冷却至62°C，在72°C下进行反应2分钟以填充缺口。在下列条件下进行接下去的20个扩增循环94°C，15秒；62°C，30秒；72°C，30秒。在Sl和S5引物存在的情况下，将2mkl的上述反应混合物用作模板来扩增胰岛素原cDNA。凝胶纯化约ISObp 的PCR产物，将其克隆到pTA-克隆载体中。克隆IS2被测定具有正确的DNA序列。为了在大肠杆菌中表达，用NdeI和EcoRI消化从克隆IS2分离的质粒DNA，凝胶纯化约170bp的片段，将其克隆到已用相同的酶消化、并且经牛小肠碱性磷酸酶处理的质粒 pET28a中。将连接混合物转化到大肠杆菌DH5 α中，并且在LB卡那霉素板上选择转化体。 从数个转化体中分离质粒DNA，并且通过用NdeI和EcoRI消化来进行筛选。鉴别出正确的克隆，将其命名为PISYN2。将该质粒转化到大肠杆菌菌株如JM109或BL21中。实施例4质粒pCIM61的构建将质粒DNA pMUT12用作模板来扩增具有经修饰的前肽的人胰岛素原cDNAmini。 利用下列引物在对于实施例1所描述的条件下进行PCR反应引物C(正向)5’ -GCCATATGCGAAAGAAGCGGAAGAAGAAGCGTTTTGTGAACACCTGTG-3’引物IL4(反向)5’ -CCGCAAGCTTTTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGG-3’凝胶纯化约210bp的PCR产物，将其克隆到pTA克隆载体中。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株DH5ci中，并且在含有氨苄青霉素的LB板上选择转化体。克隆CIM6被测定具有正确的DNA序列。为了在大肠杆菌中进行表达，用NdeI和HindIII消化从克隆CIM6分离的质粒 DNA，凝胶纯化约200bp的片段，将其克隆到已用相同的酶降解的质粒pET39a中。将连接混合物转化到大肠杆菌DH5 α中，并且在LB卡那霉素板上选择转化体。从数个转化体中分离质粒DNA，并通过用NdeI和HindIII消化来进行筛选。鉴别出正确的克隆，将其命名为 PCIM61。将该质粒转化到大肠杆菌菌株如JM109或BL21中。实施例5
质粒DDIM07的构建将质粒DNA pMUT12用作模板来扩增具有经修饰的前肽的人胰岛素原cDNAmini。 利用下列引物在对于实施例1所描述的条件下进行PCR反应引物D (正向)5 ’ -TACCATGGATGAAGACGAGGATGAAGCACGCTTTGTGAACCAACACCTGTG-3’引物IL4(反向)5’ -CCGCAAGCTTTTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGG-3’凝胶纯化约210bp的PCR产物，将其克隆到pTA克隆载体中。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株DH5ci中，并且在含有氨苄青霉素的LB板上选择转化体。克隆DIMl被确定具有正确的DNA序列。为了在大肠杆菌中进行表达，用NcoI和HindIII消化从克隆DIMl中分离的质粒 DNA，凝胶纯化约200bp的片段，将其克隆到已用相同的酶降解的质粒pET28a中。将连接混合物转化到大肠杆菌DH5 α中，并且在LB卡那霉素板上选择转化体。从数个转化体中分离质粒DNA，并且通过用NcoI和HindIII消化来进行筛选。鉴别出正确的克隆，将其命名为 PDIM07。将该质粒转化到大肠杆菌菌株如JM109或BL21中。实施例6胰岛素前体蛋白的表汰按照与上述相同的方法将经确认包含编码胰岛素前体的DNA片段的质粒 (ΡΙΚ8-胰岛素原、pMUT12、pCIM61、pISYN2、pDIM07等)用于转化表达宿主细胞大肠杆菌 BL21 (DE3)，选择抗卡那霉素的菌落。将用质粒pIK8-胰岛素原、pISYN2和pCIM61转化的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞在用于专利程序目的的关于微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约的条款下适当地以1MB B-7169、IMB B-7230和1MB B-7251的登录号保藏在乌克兰微生物中心(Ukrainian Center of Microorganisms)以及适当地以CCM 7511 (保藏日期2008年 1月30日)、CCM 7568(保藏日期2008年8月28日)和CCM 7567(保藏日期2008年8月 28日)的登录号保藏在捷克微生物保藏中心(Czech Collection of Microorganisms)。将上述所选择的菌落接种在Iml LB培养基中(每升IOg细菌用胰蛋白胨、5g细菌用酵母提取物和IOg NaCl)，然后在37°C下培养超过12小时。将培养物转移至50ml含有 30 μ g/ml卡那霉素的LB培养基中，并且当培养物的0D_为0. 5至0. 8时，向培养物中加入 IPTG(异丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至ImM的终浓度。伴随200rpm的振荡于37°C 继续培养4小时，以4，OOOrpm离心15分钟以获得大肠杆菌细胞沉淀。通过在95°C下于蛋白质加样缓冲液中加热5分钟来裂解细胞，根据标准方法[13]通过SDS凝胶电泳来分析裂解物。实施例7发酵和生长条件1.工作库将具有任一上述质粒的大肠杆菌菌株BL21的单个菌落培养在LB培养基(10g/L 细菌用胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和5g/L NaCl)或补充有适当抗生素的其类似物中。然后用冷冻培养基稀释培养物并储存在-80°C或-170°C。2.接种物
从工作库向摇瓶中的无菌LB培养基接种，所述LB培养基补充有30 μ g/ml的卡那霉素或50yg/ml的氨苄青霉素，在振荡器上于37°C和约250rpm下孵育15小时。如果需要，在搅拌通气发酵罐中进行接种物扩增的随后阶段。用5-10%的烧瓶培养物接种无菌培养基，并在搅拌和通气的条件下于37°C，pH 6. 9士0. 5下孵育5至8小时以使溶解氧水平维持在20%的空气饱和度之上。3.牛产用1-10%的接种培养物接种生产培养基，在37°C下进行孵育。设置搅拌-通气速率以使溶解氧水平维持在20%的空气饱和度之上。利用NH4OH将pH维持在6. 9 士 0. 5。将炔丙醇B400用作消泡剂。生产培养基
权利要求
1.生产重组人胰岛素的方法，所述方法是介由构建编码胰岛素原的重组质粒DNA，产生和培养产生杂合多肽的大肠杆菌菌株，分离和破碎细胞以及分离多肽，对其进行酶促转化，然后纯化和分离所需的产物，所述方法的特征在于，编码包含人胰岛素原的氨基酸序列的杂合多肽的重组质粒DNA片段为表达载体pIK8-胰岛素原、或pMUT12、或pISYN2、或 PCIM61或pDM07的一部分或与前述DNA插入物之一杂交并且在表达时编码人胰岛素原前体，从而编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为ΡΙΚ8-胰岛素原质粒的一部分的重组质粒DNA片段具有下列序列.1.........ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT.1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S. . H..61........ ATGCGCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTG.21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L. . V...121....... TGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAG.41.........C. . G. . Ε. . R. . G. . F. . F. . Y. . Τ. . P. . K. . Τ. . R. . R. . Ε. . A. . Ε. . D. . L. . Q...181....... GTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTG.61.........V. . G. . Q. . V. . Ε. . L. . G. . G. . G. . P. . G. . A. . G. . S. . L. . Q. . P. . L. . A. . L...241....... GAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTC.81.........Ε. . G. . S. . L. . Q. . K. . R. . G. . I. . V. . Ε. . Q. . C. . C. . Τ. . S. . I. . C. . S. . L...301.......TACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG.101........Y. . Q. . L. . Ε. . N. . Y. . C. . N..女· ·编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为PMUT12质粒的一部分的重组质粒DNA 片段具有下列序列.1.........ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT.1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S. . H..61........ ATGCGCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTG.21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L. . V...121.......TGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGC.41.........C. . G. . Ε. . R. . G. . F. . F. . Y. . Τ. . P. . K. . Τ. . K. . R. . G. . I. . V. . Ε. . Q. . C...181....... TGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG.61.........C. . Τ. . S. . Τ. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . Ε. . N. . Y. . C. . N..女…编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为PISYN2质粒的一部分的重组质粒DNA 片段具有下列序列.1.........ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCAT.1..........Μ. . G. . S. . S. . H. . H. . H. . H. . H. . H. . S. . S. . G. . L. . V. . P. . R. . G. . S. . H..61........ATGCGCTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCTGGTGGAAGCGCTGTATTTAGTG.21.........Μ. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L. . V. . Ε. . A. . L. . Y. . L. . V..121....... TGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAACGTGGCATTGTGGAACAGTGT.41.........C. . G. . Ε. . R. . G. . F. . F. . Y. . Τ. . P. . K. . Τ. . K. . R. . G. . I. . V. . Ε. . Q. . C...181....... TGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTACTGCAACTAA.61.........C. . Τ. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . Ε. . N. . Y. . C. . N..女编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为PCIM61质粒的一部分的重组质粒DNA 片段具有下列序列·1......... ATGCGAAAGAAGCGGAAGAAGAAGCGTTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCTG·1..........M. . R. . K. . K. . R. . K. . K. . K. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L.·61........GTGGAAGCGCTGTATTTAGTGTGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAA·21.........V. . E. . A. . L. . Y. . L. . V. . C. . G. . E. . R. . G. . F. . F. . Y. . T. . P. . K. . T. . K..·121.......CGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTAC·41.........R. . G. . I. . V. . E. . Q. . C. . C. . T. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . E. . N. . Y..·181.......TGCAACTAA·61.........C. . N..女..编码包含人胰岛素原序列的杂合多肽并且作为PDIM07质粒的一部分的重组质粒DNA 片段具有下列序列·1......... ATGGATGAAGACGAGGATGAAGCACGCTTTGTGAACCAGCATCTGTGTGGCAGCCACCTG·1..........M. . D. . E. . D. . E. . D. . E. . A. . R. . F. . V. . N. . Q. . H. . L. . C. . G. . S. . H. . L.·61........GTGGAAGCGCTGTATTTAGTGTGCGGCGAGCGTGGCTTCTTTTATACCCCGAAAACCAAA·21.........V. . E. . A. . L. . Y. . L. . V. . C. . G. . E. . R. . G. . F. . F. . Y. . T. . P. . K. . T. . K..·121.......CGTGGCATTGTGGAACAGTGTTGCACCAGTATTTGTAGCCTGTATCAGCTGGAAAATTAC·41.........R. . G. . I. . V. . E. . Q. . C. . C. . T. . S. . I. . C. . S. . L. . Y. . Q. . L. . E. . N. . Y..·181.......TGCAACTAA·61.........C. . N..*..
2.根据权利要求1的方法，其特征在于大肠杆菌菌株产生的步骤是使用质粒载体进行的，所述质粒载体含有编码一种或数种重组多肽的核苷酸序列，并且同时所述编码一种或多种重组多肽的核苷酸序列的转录在可诱导的表达系统的控制之下，然后培养经转化的大肠杆菌菌株并诱导所述表达系统以允许所述重组多肽在大肠杆菌细胞中表达，以及回收所产生的重组多肽。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，使用细菌细胞或细胞片段的破碎、细胞内沉淀的分离、然后用非离子性去污剂洗涤沉淀来进行细胞分离和破碎以及杂合多肽的回收，而杂合多肽的分离包括在含有变性剂的缓冲溶液中溶解沉淀，用还原剂处理杂合多肽，重折叠杂合多肽，介由吸附层析或超滤浓缩杂合多肽。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，同时或相继使用胰蛋白酶和羧肽酶进行杂合多肽的酶促切割，然后优选进行离子交换层析。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，在酶促切割后介由离子交换层析和/或反向高效液相色谱进行胰岛素纯化。
全文摘要
本发明涉及生物技术学并且可被用于生产人重组胰岛素，所述人重组胰岛素用来制备用于治疗胰腺糖尿病的药剂。提出了各种含有人工基因并编码人胰岛素前体的重组质粒DNA。使用异丙基-硫代半乳糖吡喃糖苷来诱导杂合多肽的生物合成，从而使得杂合多肽的诱导后水平等于或大于总细胞蛋白质的25％。根据所述的方法，通过培养含有所述重组质粒之一的生产菌株、分离包涵体、溶解并复性融合蛋白、以及酶促降解和层析纯化所述蛋白质而产生人胰岛素。本发明简化了生产人重组胰岛素的方法并且增加了其产率。
文档编号C12R1/19GK102282260SQ200980154515
公开日2011年12月14日 申请日期2009年6月16日 优先权日2008年11月26日
发明者A·P·拉扎耶夫, I·E·考斯特斯基, I·L·里索夫斯基, I·P·勒斯克, V·R·鲁西夫 申请人:Mako有限责任公司